络病与心脑血管疾病相关性研究及治疗新进展 通心络促血管生成作用的实验研究
作者简介：王文健教授
复旦大学华山医院教授、主任医师、博士生导师，复旦大学中西医结合研究所所长，复旦大学上海医学院中西医结合系主任，教育部重点学科中西医结合临床专业学科带头人，享受国务院特殊津贴。长期从事中西医结合老年病研究。在老年病和代谢性疾病的中西医结合治疗方面取得了重要成果。曾先后承担国家攻关项目、国家自然科学基金重点项目10余项，获省部级科技进步奖8项，主编专著5部，发表论文40余篇。现兼任中国中西医结合学会副会长，中国中西医结合学会虚证与老年病专业委员会主任委员，上海市中西医结合学会会长。
摘要
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目的：探讨中药通心络对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型血管生成的影响。方法：运用血清药理学的方法制备药物血清，将鸡胚随机分为空白血清组、贝复济组及通心络大、小剂量组，检测尿囊膜的血管增生程度。结果：通心络大剂量组CAM的血管增生数明显高于空白血清组(P<0.05)，且与贝复济组无显著差异(P>0.05)而通心络小剂量组与空白血清组相比无显著差异(P>0.05)。结论：通心络可促进鸡胚绒毛CAM的血管增生从而具有一定的促血管新生作用。
研究
冠心病是冠状动脉狭窄或闭塞导致心肌缺血，从而影响心功能的临床常见心血管疾病。近年来由于冠状动脉旁路移植术(CABG)、经皮冠脉内血管成形术(PTCA)及心肌内激光打孔等新技术的开展，对冠心病的治疗取得了一定疗效1，但仍有相当一部分病人药物治疗效果不佳且不适宜接受血管重建术，而即使术后也存在着25%～50%的再狭窄率。因此通过治疗性血管增生以减轻心肌缺血逐渐成为目前研究的热点2。血管新生疗法即是通过加强新生侧枝血管的自然过程以维持冠状动脉渐进性闭塞时的血流量。本研究拟通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型探讨中药通心络对血管生成的影响。
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材料与方法
一、主要仪器和试剂
培养箱(日本池本理化工业株式会社)，超净工作台(上海净化设备厂)，解剖显微镜(日本Okympus公司320040型)，电子天平(上海精密科学仪器有限公司JY2002型)。
香港麻花鸡胚蛋，蛋重50～65 g。
孔径0.45 μm的微孔滤膜(上海华美生物工程公司)。
甲醇、丙酮等常规试剂均为国产分析纯。
二、药物血清的制作
选普通级雄性Wistar大鼠，体重220±20 g，常规喂养。通心络(由石家庄以岭药业股份有限公司提供，主要由人参、水蛭、全蝎等组成，以纯净水配制成1 g/mk药液)大、小剂量组分别按成人(50 kg)剂量的5倍、10倍灌胃；空白组给予与大剂量通心络组相同体积的生理盐水。按文献报道方法3分别制成大、小剂量通心络组及空白组血清，分装后-30℃保存，经培养实验证明无微生物污染后使用。
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三、CAM模型的制作及血管测定
参照付生法4、姜志钢5等报道的方法略加改进。白皮种蛋消毒后放入37℃孵化箱，气室向上，每天转动3～4次，至孵蛋第9天，消毒种蛋表面后在气室顶端打1～2 mm小孔，在距胎头前1 cm、两条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位标记1.0 cm×1.5 cm的长方形区域，磨切透卵壳，在卵壳膜上轻轻划破直径约1 mm的小孔，滴加少许无菌纯净水分离小孔边缘的卵壳膜，将无菌的直径为6 mm的微孔滤膜载体放在CAM的血管最少处，然后在载体中央加入通心络大、小剂量及空白组相应的动物血清。西药对照贝复剂组采用重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)[由珠海东大生物制药有限公司生产，批号(98)卫药准字(珠东大)S-01号]直接加入。加药液量为每枚蛋10 μk。加药后，用无菌透明胶封窗，标记后再放入37.8℃的孵箱内孵育3天。加药3天后每蛋注入11的甲醇、丙酮等量混合固定液2.5 mk室温下固定20 min，待CAM上血管内的血液凝固后，揭去封窗的透明膜，剪除CAM水平以上的蛋壳，以滤膜载体为中心把CAM剪下，放入盛有少量水并铺有滤纸的平皿里展开，阴干，连同滤纸保存。解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘)1 mm范围内为一级血管，以实验部位边缘5 mm处为二级血管，凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45°者均予计数；而穿行、绕行的血管则不算在内。一、二级血管分别观察计数。
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四、统计学处理
应用SPSS统计软件进行单因素方差分析比较各组间差异。所有数据以均数±标准差x±s表示。
结果
与空白血清组相比，贝复济组及通心络大剂量组血管生成数明显增加(P<0.05)，且通心络大剂量组与贝复济组无显著差异(P>0.05)；而通心络小剂量组的血管生成数则明显少于贝复济组(P<0.05)表1，图1～4。提示通心络有促进血管生成的作用且呈剂量依赖性。
图1
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空白血清组CAM
图2
贝复济组CAM
图3
通心络小剂量组CAM
图4
通心络大剂量组CAM
表1
, 百拇医药 各组药物对鸡胚CAM血管生成的影响
组别
n
一级血管数
二级血管数
空白血清组
8
19.13±4.33
38.38±7.79
贝复济组
8
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36.38±6.17*
65.63±12.88*
通心络小剂量组
8
21.69±7.63#
40.44±12.31#
通心络大剂量组
8
32.31±6.55*
56.94±11.39*
注：与空白血清组相比，#P>0.05；*P<0.05
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讨论
一、中药复方与血清药理学
单味中药作为天然药物本身成分就很复杂，而中药复方则更是所组成药物的有机组合，体现的是一种综合作用。药物进入体内后会发生一系列的代谢变化，中药粗制剂直接加入离体反应体系中并不能显示药物在体内的代谢过程，因此中药复方药理的体外研究往往和体内实验存在一定的差距。而使中药经口服吸收后用含药血清进行体外实验，可以更真实地体现药物在体内代谢后的作用。本实验中，由于通心络粉末极难溶于水，因此我们采用血清药理学6的方法既解决了水溶性的问题，又能最大程度地模拟药物经体内代谢后的作用，从而使所得结果基本与临床相一致。
二、血管新生与冠心病
血管新生即原有的血管又产生新的血管，生理情况下血管生长处于相对平衡状态，当发生缺血缺氧及肿瘤等应激情况时平衡失控，血管新生的过程被激活，导致侧枝血管形成[7]。以往对冠心病发展过程中冠状动脉侧枝循环的研究主要集中在压力梯度及血流量等物理因素，而目前研究发现在心肌缺血缺氧时，冠脉侧枝的形成可以减少或抵御心肌缺血或坏死，保证血液的正常供给，而其中成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的mRNA表达明显增多，说明侧枝循环的建立可能与具有生物活性物质的作用有关7。但是，目前采用促血管新生因子治疗冠心病还处于临床实验阶段，一些问题诸如给药途径、起效时间及安全性等有待解决。
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三、血管新生模型的选择
近年来已建立了多种实验模型以检测生物或物理机械因素对侧枝循环形成的干预作用，包括对犬、猪等大动物进行直接心脏部位的血管计数，或通过鸡胚尿囊膜、动物颊囊膜等的血管生长观察促血管新生作用的强弱，其中鸡胚尿囊膜由于模型简便易行，计数指标客观成熟并具有良好的重复性，可定性定量地检测不同组织或细胞系分泌成分及生物因子等对血管的作用8，从而广泛应用于中药的血管生成活性及作用特点的研究。
四、中药通心络的促血管新生作用
通心络胶囊是吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，由人参、水蛭、土鳖虫、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成，具有益气活血、通络止痛之功效。已有的研究表明，该药具有扩冠、降脂、抗凝、维护血管内皮功能等作用，而本研究提示通心络可以呈剂量依赖性的促进血管生成，其疗效甚至可与成纤维细胞生长因子(bFGF)相当。虽然通心络促血管生成的作用机制值得进一步探讨，但本研究结果无疑为开拓更广泛的临床应用和多角度研究其多靶点的作用机制奠定了基础。
(参考文献略), http://www.100md.com(复旦大学附属华山医院 复旦大学中西医结合研究所 王文健 傅晓东 陈伟华 应健 王)