SARS研究进展：实验室诊断技术研究
实验室诊断技术研究
自从世界上不同实验室成功地分离出SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)以来，在仅仅约三个月的时间内，已经有人开发出了不少可用于SARS-CoV感染的特异性实验室检查技术。这些实验室诊断技术可以分为以下几类：① 病毒分离；②聚合酶链反应PCR；③ 特异性抗体检测；④免疫组化法检测病毒抗原；⑤电子显微镜检查。这些技术大多未经多家实验室之间的标准化，因此，对这些方法进行全面的评价，还为时过早。然而，根据现有资料进行适当的比较和初步的评价还是有可能的。用于某种感染性疾病的临床特异性实验室诊断技术应当具备特异性强、敏感度高、相对简便、快速、经济等特点。
, http://www.100md.com 病毒分离
目前国内外分离SARS-CoV所用的细胞大多都是Vero E6细胞 也有用NCI-H292细胞者Ksiazek等。病毒分离所用的标本有口咽部冲洗液、痰液、鼻咽洗液、肺活检材料、支气管肺泡灌洗液以及尸检时所取的肾脏标本等。将SARS病人的临床标本接种于Vero 6E细胞后2～4天Drosten等和Peiris等，甚至5天，培养细胞才出现明显的细胞病变。但传一代以后，孵育24小时即可出现细胞病变效应CPEPeiris等。
传统的病毒分离方法实际上可分为培养和鉴定两步。在接种标本后每日定时观察培养细胞是否出现CPE，这就是培养过程。当出现明显的CPE时，应当用已知针对SARS-CoV的特异性抗体对分离到的病毒进行鉴定，确定所分离出的病毒是哪一种病毒的哪一型或哪一株等，这就是鉴定。对一般病毒分离物进行鉴定的传统方法是用中和试验，但即使用微量法进行中和试验，检测所需要的时间也相当长2～3天，这样，总共需要至少4～8天，不适合于早期诊断。近年来已有人用酶联免疫吸附法(ELISA)或免疫荧光法(IFA)对培养物进行鉴定，可显著缩短检测时间。但目前分离SARS-CoV的方法实际上也没有标准化，鉴定这一步有人用间接IFAKsiazek等，甚至有人用PCR法Drosten等检测培养细胞中的SARS-CoV核酸，这可以大大缩短检测时间。病毒分离法一般而言特异性很强，但敏感度相对低。用ELISA或PCR进行鉴定，可在一定程度上提高敏感度。但因为SARS病毒传染性相当强，病毒分离只能在少数防护条件完善的实验室进行，因此其临床实际应用价值有限。采集病毒分离用的标本种类和采集的时机十分重要。比较实用而且安全的标本可能是痰液和鼻咽洗液。在病程的什么时机采集标本分离出病毒的可能性最大，目前尚无定论。根据文献，从发病1周以内以及1周左右采集的标本以及从死亡病例标本中，都有可能分离出SARS-CoV。但需要在不同病期收集标本进行病毒分离研究，才能得出比较可靠的结论。
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PCR类技术
到目前为止，用于检测SARS-CoV核酸的PCR方法有逆转录PCR RT-PCR、实时PCR、套式PCR和增强的实时PCRERT-PCR等。这些方法的敏感度很高，如能避免污染等问题，特异性也极强。用PCR类技术扩增的序列多为SARS-CoV的RNA聚合酶基因的片段(Ksiazek等)，因为一般认为该基因的序列
是比较保守的。Peiris等开发出的RT-PCR，用于扩增SARS-CoV的RNA。在44份取自SARS病人的鼻咽分泌物标本中，有22份显示SARS-CoV RNA阳性。
Law等开发的ERT-PCR方法的敏感度比实时PCR高100倍，比普通PCR高1000万倍，其特异性也极强。因此研究者认为该技术对检出或筛查SARS-CoV含量很低的标本有很大价值。但如果要开展此技术，购置专用设备、人员培训等投入约需人民币50万元。因此只能考虑在少数中心实验室开展。用于PCR检测的标本包括痰液、鼻咽分泌物、血液、活检标本等。因为PCR方法的敏感度极高，有可能从病程早期采集的标本中检出SARS-CoV的核酸，从而做到早期诊断。但这些方法也都没有标准化。
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特异性抗体(血清学)检测
国内外研究者用于检测血清中针对SARS-CoV的特异性抗体的方法有ELISA、间接IFA等。所用的抗原有将培养出的SARS-CoV灭活及进行其他处理后制备成检测抗原的，也有用基因重组技术制备SARS-CoV抗原，用于检测特异性抗体者毕胜利等。
祝庆余等用培养分离出的SARS-CoV制备出的免疫荧光抗原片检测26例SARS病人的血清，抗体阳性者为23例，而对照组的31份血清标本全部阴性，可见该方法的特异性和敏感度都很高。
有限的文献资料表明，SARS-CoV感染后，特异性IgM抗体的检出率相当低，而且在病程中检出的时间也比其他病毒感染性疾病晚，多在出现症状后10天甚至更晚才能检出。其原因是因为SARS-CoV本身的特点，还是当前所用的检测方法敏感度太低，还是有其他原因，如多数病人没有在发病7天以内取血等，有待研究探讨。王辰等的研究表明，用间接IFA法检测发病4天以内取血的13例病人中，无1例IgM抗体阳性，但却有4例IgG抗体阳性；发病7天以内取血的53例病人中，仅1例IgM抗体阳性，却有19例IgG抗体阳性。发病10天以内取血的110例病人中，IgM抗体阳性者9例8.2% IgG抗体阳性者50例45.5%。同一项研究中用ELISA法检测的结果也大致如此。这是一种十分罕见的情况，即在发病早期从大部分病例中检测不到特异性IgM抗体。对绝大部分病毒性疾病而言，感染的早期可从大多数病例血清中检测出IgM抗体，虽然也有例外，如HIV感染。广东省CDC万卓越等以培养分离出的SARS-CoV制备成抗原，以IFA分别检测SARS病例血清中IgM和IgG抗体，也发现有类似的情况，而且IgM抗体的总检出率为35% 而IgG抗体的检出率为90%。为什么IgM抗体总检出率低且检出的时间晚？有人曾经提示，用于检测该抗体的间接IFA或间接ELISA法中所用的抗人IgM μ链抗体的敏感度不够高。有人为解决这一问题，曾经更换数批或不同来源的抗人IgM抗体进行检测，结果仍如此。当然，这些检测方法都没有进行标准化，无论在哪一个环节上有问题，结果都可能受影响。还应当考虑的一个因素是，用间接法而不是用捕获法检测IgM抗体时，血清中的IgG抗体会影响IgM抗体的检出，特别是当IgG抗体水平较高时，更是如此。
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毕胜利等报告的双抗原夹心式酶免疫检测法EIA 所检测的实际是抗SARS-CoV的所谓“总抗体”，即可能包括IgM、IgG甚至IgA抗体，或者说，血清中存在哪一类抗体，该法都可能出现阳性，虽然不能分清是哪一类，但在某种意义上有其优越性，即有可能帮助做出早期诊断。
国内报告的血清学检查方法，特异性和敏感度都相当高，比我们平时用于检测其他某些病毒抗体的方法还高，因此可以在临床上用于SARS的辅助诊断或鉴别诊断。
徐国宾等用军事医学科学院微生物流行病研究所开发的用于检测SARS-CoV IgG抗体的试剂盒检测医务工作者127人及正常人57人的血浆标本注意，不是血清，血浆和血清对于抗体检测而言，有何区别，需探讨，全部阴性。而SARS患者总阳性率为61%，在发病后15～20天所取的标本阳性率为86%。
从国内外研究者用SARS-CoV为抗原，检测SARS病人和健康人血清中针对SARS-CoV抗体的研究，可以得出以下这些结论：①SARS病人绝大多数在病程的一定时间血清中出现针对SARS-CoV的特异性抗体。②SARS-CoV抗体检测可用于SARS的特异性诊断，但该抗体阴性时，不能轻易排除SARS。③SARS-CoV IgM抗体的检测似乎不能用于SARS的早期诊断 早期检测结果阳性时可以诊断是SARS，但阴性时不能排除SARS。④虽然尚未进行大规模人群的血清学检查，但初步研究结果表明，健康人以及明确诊断为其他疾病的病人，血清中没有SARS-CoV抗体，目前了解到的例外是部分或少数经营果子狸或某些蛇类的人员购销者及厨师血清中有SARS-CoV抗体。这也充分说明，SARS以前在普通人群中不曾发生。因此，临床上高度怀疑为SARS的病例，如果血清特异性抗体阳性，特别是发现抗体滴度明显升高达4倍或更高，则可确定诊断。⑤徐国宾等的研究初步表明，SARS这种疾病似乎不发生隐性感染。⑥检测抗体的方法经一定的标准化之后，可推广使用，并且应将其做为SARS病例定义的组成部分。
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用免疫组化法检测SARS-CoV抗原
免疫组化法的优越性是，可用该类方法检测组织或细胞内的病毒抗原。Ksiazek等用SARS恢复期病人血清抗体检测以SARS病人标本感染的Vero E6细胞，显示细胞浆和细胞膜上有强的染色，说明病毒抗原主要在细胞浆和细胞膜上表达。用这类方法也可以直接检测病人呼吸道分泌物中细胞内或活检或尸检组织内的SARS-CoV抗原。这类方法操作过程不很复杂，如能消除背景非特异性染色，其特异性也较强，虽然敏感度可能不很高。有条件的单位可以开展这一方法，用于SARS的特异性实验室检查。如果采集标本的种类和时机合适，有可能做到早期诊断。
电子显微镜检查
一般的超薄切片经负染进行透射式电镜检查，虽有可能观察到标本中的病毒颗粒，但只能了解病毒的形态学。有些病毒形态特殊，可以通过电镜检查基本确定。但对同一病毒属中不同种的病毒，以及同一种病毒的不同血清型，以及形态学上类似的病毒用一般电镜方法无法确定或鉴别。如借助于特异性抗体，进行免疫电镜检查，则可以做到确定诊断。从临床诊断的要求出发，电镜技术更适合于进行研究，而不适合于大量临床病例实验室诊断的需要。
有些研究单位还开发出了更新、敏感度和特异性更强的实验室检测技术，例如，我国军事医学科学院微生物流行病研究所开发出以上转荧光技术up-converting phosphor technokogy UPT为基础的免疫传感器，PCR-微量板杂交技术，以及基因芯片等。这些新技术经进一步的研究，有望用于SARS的临床检测或研究工作中。, http://www.100md.com(照日)