周围血管疾病基因治疗的研究进展(3)
2.2 非病毒载体 目前常用的非病毒载体主要是阳离子脂质体载体(如Lipofectin、Lipofectamine等)和阳离子多聚体载体(如多聚赖氨酸等)。它们通过细胞内吞或细胞膜融合将外源基因导入细胞内，由于载体内不含病毒序列，安全性很高，所携带的基因片段长度范围大，对被转染细胞无分化的要求，但它们介导的基因转移缺乏组织特异性和靶向性。目前针对阳离子脂质体载体进行的研究包括研究不同类型的脂质、脂质与核酸的比例、核酸的缩合、携带电荷量以及是否使用融合剂等问题，但其制备方法上尚有许多问题没有解决，例如如何提高细胞膜以及细胞核膜的穿透率、如何避免载体被网状内皮系统吞噬，如何避免细胞内源性核酸酶降解所携带的外源基因，因而其临床广泛应用受到限制[20,21]。
2.3 联合应用 病毒载体和非病毒载体联合应用可提高转染效率。Toyoda等报道将携带外源基因的腺病毒载体，与阳离子多聚体载体多聚赖氨酸或阳离子脂质体载体Lipofectin混合后导入兔颈动脉内，转染效率提高5～6倍。其原因可能是带正电的阳离子载体包被在带负电的腺病毒颗粒表面，能使颗粒更好地与带负电的细胞膜结合，通过细胞内吞或细胞膜融合进入细胞内[22]。Mulders等发现经紫外线照射后的腺病毒载体与多聚赖氨酸联合应用时，既能避免宿主免疫反应，又能降低腺病毒载体的使用滴度，提高载体的转染效率[18]。Van Belle等用一种生物相容性好的多聚大分子物质Poloxamer407作为腺病毒载体的载体，Poloxamer407在4℃时为液态，在37℃时为凝胶样固态，利用这种特性可将腺病毒载体固定在所要转染的血管段周围，避免了载体溶液不必要的流失，能使腺病毒载体的转染效率提高15倍。这种方法为血管内支架预埋治疗基因提供了新的手段[23]。
3 基因导入途径的更新
3.1 基因导入体内途径可分为离体法(ex vivo)和直接体内法(in vivo)。前者是先在体外将外源基因导入培养的载体细跑、然后将转染后的细跑回输给受者，使携带有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物而达到治疗目的。后者是直接将外源基因导入受者体内相关的靶组织或靶细胞内起到治疗目的，这种方法简便易行，如肌肉注射、静脉注射、皮下包埋等，缺点是基因转染效率太低。近年来，随着载体系统的改进和发展，直接体内法的应用进展较大。
3.2 基因导入血管壁的途径分为经内膜、经外膜、经肌肉和经骨髓四种。
3.2.1 经内膜途径是通过球囊导管或直接将含有外源基因溶液高压灌注血管腔，其缺点有：需要暂时中断血供；容易损伤剥脱血管内膜；因血管内膜的天然屏障作用，使中膜层基因转染效率下降。新型的经内膜途径与血管内支架的应用联合起来，将各种外源治疗基因预埋入支架内，能起到抗凝、防治内膜增生等作用。Herrmann等报道将携带有水蛭素基因的阳离子脂质体载体聚乙二醇(PEG)与一种可降解的大分子材料聚乳酸(PLA)混合后，包被在血管内支架的表面，能有效预防支架内附壁血栓的形成[24]。
3.2.2 经外膜途径是通过各种物理方法如水凝胶包被、直接外膜周围注射等方法，将外源基因固定在需要治疗的的血管段外膜周围，在操作过程中无须中断血供，也无损伤内膜之忧，缺点是只有在手术时才能采用这种途径。Laitinen等报道用一种生物惰性材料制成领圈样结构包绕在血管外膜外，在领圈和外膜之间放置治疗基因，使外源基因在较长时间内能达到一定的浓度，从而提高了基因的转染效率[25,26]。
3.2.3 经肌肉途径是将外源基因直接注入肌肉，由肌细胞摄取表达后作用于相关靶组织或靶细胞的方法。它可以应用不同的载体，也可以不用载体而直接将裸DNA注入肌肉内。Rade等将携带水蛭素基因的腺病毒直接注射入肌肉后，能有效表达，并抑制动脉损伤后的内膜增生。Isner小组[1]和本室[27]报道将含VEGF的裸DNA直接注入下肢缺血肌肉后，能有效促进侧枝循环的形成。汤建等报道的基因缝线和基因电针技术也是经肌肉途径的发展，分别通过结扎线引起的肌肉缺血和外加电场的作用，来提高肌细胞摄取外源基因的效率[28,29]。(赵意平 张柏根)