人睾丸前列腺素D合成酶重组表达质粒的构建与鉴定(1)
特异性前列腺素D合成酶(Prostaglandin Dsyn thase；PGDS通常分两类:一是脑型PGDS，亦称Lipocalin型PGDS，(LPGDS)；二是脾型PGDS，，亦称生血型PGDS。人睾丸PGDS属LPGDS，它不仅可催化机体前列腺素D2(PGD2)的产生，亦可结合和运输亲脂/疏水分子，为Lipocalin家族成员中唯一有酶活性者。LPGDS的基因结构和理化性质，及其在男性生殖过程中的可能作用，作者已作过阐述。经检索中国学术期刊光盘，至今未见有关于LPGDS的研究报告；经检索美国国家图书馆PubMed，人睾丸PGDScDNA的序列亦未见报道。为了对男性生殖系统中LPGDS的表达，调控及作用进行系统的研究，我们试图在已克隆出LPGDScDNA的基础上(待发表 )，用基因工程方法获得人睾丸LPGDS (htLPGDS)的高表达，希望籍此获得htLPGDS的单克隆或多克隆抗体，从而建立针对LPGDS的免疫学研究方法。本文用PCR从人睾丸LPGDScDNA克隆扩增得到编码LPGDS的基因片段，插入原核表达载体PGEX2T中，得到重组表达质粒PGEX2T/htLPGDS，经PCR和双酶切鉴定为正确克隆。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验设备与材料 9600型DNA Thermalcycler(美国PE公司 )；超净工作台 (苏州净化设备厂)；UV2600型紫外分光光度计 (日本岛津 )；台式高速冷冻离心机及恒温摇床 (军事医学科学院仪器厂)Taq酶，限制性内切酶BamHI和EcoRI，T4DNA连接酶，DNA清洁和PCR Clean up试剂盒，均购自大连TaKaRa公司；质粒提取纯化试剂盒，购自BoehringerMannhei公司；PGEX 2T和宿主菌JM103M103由本院李芳秋博士惠赠；其它试剂均为分析纯。
1.2 引物设计和合成 依据Nagata等的报道，设计如下一对引物，可扩增编码全长LPGDS的cDNA。上游引物1∶ 5′CCGCTCGGATCCAGGAGAATGGC TACTCAT 3′，近 5′端引入BamHI酶切位点；下游引物 2∶5′CCCTGGGAATTCCTATTGTTC CGTCATGCA 3′，近 5′端引入EcoRI酶切位点 (下画线部分 )。引物由大连TaKaRA公司合成。
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1.3 PCR扩增 以测序证实为人LPGDS的人睾丸LPGDSc DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系的组成 :10×Buffer 5μl，25mmol/L MgCl24μ1，25mmol/L dNTP 1μl，LPGDS引物primer 1和2各1μl，LPGDS cDNA模板5μl，用消毒去离子水补至495μl。混匀后，95℃预变性 5min，加Taq DNA聚合酶 0.5μl(5U)，混匀后按如下循环扩增；94℃1min，55℃退火0.5min，72℃延伸 15min，30个循环后于 72℃再延伸 7min。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增的效果。
1.4 PGEX2T质粒的扩增及质粒DNA提取 取质粒菌1个菌落于 5ml LB/氨苄青霉素培养基中，37℃，160r/min摇床培养6h后，取2.5ml菌液按high pure plasmid isolation kid说明书操作。
1.5 PCR产物和PGEX2T DNA的酶切反应 反应体系为 :10×KBuffer 2μl，质粒DNA或PCR产物8μl，双蒸水8μl，EcoRI 1μl，BamHI 1μl。混匀，37℃ 1h后，加终止液2μl。
, http://www.100md.com
1.6 酶切产物的纯化及鉴定 分别取质粒DNA和PCR产物双酶切产物各 30μl，按DNA清洁和PCRClean up试剂盒说明书操作。纯化后的产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.7 连接反应 反应体系为 :10×Buffer 2μl，PGEX2T和PCR产物酶切后纯化产物各8μl，T4DNA连接酶1μl，双蒸水1μl。混匀，16℃ 30min后，转入4℃放置24h以上，反应产物用于构建重组质粒PGEX2T/htLPGDS。
1.8 重组质粒转化宿主菌JM103连接物按常规法转化氯化钙法制备的感受态大肠杆菌JM103。挑取氨苄青霉素抗性菌落，接种含氨苄青霉素的LB液体培养基，扩增阳性菌落。提取质粒，用作鉴定重组质粒。, 百拇医药(陆金春 黄宇烽 张锡然)
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1 材料与方法
1.1 实验设备与材料 9600型DNA Thermalcycler(美国PE公司 )；超净工作台 (苏州净化设备厂)；UV2600型紫外分光光度计 (日本岛津 )；台式高速冷冻离心机及恒温摇床 (军事医学科学院仪器厂)Taq酶，限制性内切酶BamHI和EcoRI，T4DNA连接酶，DNA清洁和PCR Clean up试剂盒，均购自大连TaKaRa公司；质粒提取纯化试剂盒，购自BoehringerMannhei公司；PGEX 2T和宿主菌JM103M103由本院李芳秋博士惠赠；其它试剂均为分析纯。
1.2 引物设计和合成 依据Nagata等的报道，设计如下一对引物，可扩增编码全长LPGDS的cDNA。上游引物1∶ 5′CCGCTCGGATCCAGGAGAATGGC TACTCAT 3′，近 5′端引入BamHI酶切位点；下游引物 2∶5′CCCTGGGAATTCCTATTGTTC CGTCATGCA 3′，近 5′端引入EcoRI酶切位点 (下画线部分 )。引物由大连TaKaRA公司合成。
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1.3 PCR扩增 以测序证实为人LPGDS的人睾丸LPGDSc DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系的组成 :10×Buffer 5μl，25mmol/L MgCl24μ1，25mmol/L dNTP 1μl，LPGDS引物primer 1和2各1μl，LPGDS cDNA模板5μl，用消毒去离子水补至495μl。混匀后，95℃预变性 5min，加Taq DNA聚合酶 0.5μl(5U)，混匀后按如下循环扩增；94℃1min，55℃退火0.5min，72℃延伸 15min，30个循环后于 72℃再延伸 7min。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增的效果。
1.4 PGEX2T质粒的扩增及质粒DNA提取 取质粒菌1个菌落于 5ml LB/氨苄青霉素培养基中，37℃，160r/min摇床培养6h后，取2.5ml菌液按high pure plasmid isolation kid说明书操作。
1.5 PCR产物和PGEX2T DNA的酶切反应 反应体系为 :10×KBuffer 2μl，质粒DNA或PCR产物8μl，双蒸水8μl，EcoRI 1μl，BamHI 1μl。混匀，37℃ 1h后，加终止液2μl。
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1.6 酶切产物的纯化及鉴定 分别取质粒DNA和PCR产物双酶切产物各 30μl，按DNA清洁和PCRClean up试剂盒说明书操作。纯化后的产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.7 连接反应 反应体系为 :10×Buffer 2μl，PGEX2T和PCR产物酶切后纯化产物各8μl，T4DNA连接酶1μl，双蒸水1μl。混匀，16℃ 30min后，转入4℃放置24h以上，反应产物用于构建重组质粒PGEX2T/htLPGDS。
1.8 重组质粒转化宿主菌JM103连接物按常规法转化氯化钙法制备的感受态大肠杆菌JM103。挑取氨苄青霉素抗性菌落，接种含氨苄青霉素的LB液体培养基，扩增阳性菌落。提取质粒，用作鉴定重组质粒。, 百拇医药(陆金春 黄宇烽 张锡然)