定量PCR技术及在临床实验室应用的价值(1)
1.目前国内临床实验室应用PCR技术存在的问题：
在设施方面，如仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔内差；自动化程度较低，人工操作人为误差较大；实验室布局不合理，不能满足3个分开的房间进行分阶段操作(第1间实验室为混合试剂和质控，第2间实验室为标本提取和试剂混合，第3间实验室为PCR扩增及产物检测，工作人员应从第1间依次到第3间实验室，不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室，不能逆流，以防止空气污染；加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外，标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏，或操作者不戴手套，对着试管讲话，唾液溅入标本，RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列，最好在保守区，特异性强，无干扰。
琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb,高浓度尿素)可出现假阴性。
, 百拇医药
目前美国病理学会(CAP)等组织以及临床实验室改进修正案(CLIA 1988)要求正规检测方法是先行PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室，如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中HBV、EBV、CMV的DNA。他们认为在他们的实验室里，用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的2种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格，而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。
2 .PCR技术检测的临床意义
我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病，如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原(HIV-Ag)和抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道，感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag(+)者，HIV PCR(+)。但HIV PCR(+)者，HIV- P24Ag可呈现(-)，此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断，定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。
用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义，这已被国内外医学界的工作者公认。
结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30-50天，培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。
当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。, 百拇医药(张捷)
在设施方面，如仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔内差；自动化程度较低，人工操作人为误差较大；实验室布局不合理，不能满足3个分开的房间进行分阶段操作(第1间实验室为混合试剂和质控，第2间实验室为标本提取和试剂混合，第3间实验室为PCR扩增及产物检测，工作人员应从第1间依次到第3间实验室，不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室，不能逆流，以防止空气污染；加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外，标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏，或操作者不戴手套，对着试管讲话，唾液溅入标本，RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列，最好在保守区，特异性强，无干扰。
琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb,高浓度尿素)可出现假阴性。
, 百拇医药
目前美国病理学会(CAP)等组织以及临床实验室改进修正案(CLIA 1988)要求正规检测方法是先行PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室，如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中HBV、EBV、CMV的DNA。他们认为在他们的实验室里，用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的2种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格，而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。
2 .PCR技术检测的临床意义
我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病，如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原(HIV-Ag)和抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道，感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag(+)者，HIV PCR(+)。但HIV PCR(+)者，HIV- P24Ag可呈现(-)，此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断，定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。
用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义，这已被国内外医学界的工作者公认。
结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30-50天，培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。
当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。, 百拇医药(张捷)