标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响(2)
2.血红蛋白对测定结果的干扰(表2)
当血清标本中血红蛋白含量大于5.89μg/L时,采用煮沸裂解法处理标本,测定HBV DNA的含量明显低于核酸纯化方法(P<0.05)。从荧光定量的扩增变化曲线来看,煮沸裂解法处理标本所得的曲线明显较核酸纯化方法平坦。
四.讨论
在临床进行血清HBV DNA的PCR测定时,由于煮沸处理标本进而直接扩增较核酸提取纯化法简便快速,因而国内绝大部分试剂盒均采用此种标本处理方法,但国外试剂如Roche公司Amplicor HBV DNA PCR ELISA定量测定试剂及Biotronics公司的HBV DNA荧光定量PCR试剂均采用核酸纯化方法。HBV DNA定量测定主要是用于乙型肝炎病人治疗的动态观察及疗效判断,这就要求定量测定要有很好的重复性,从而不至于给出错误的信息。我们探讨了目前国内常用的血清标本煮沸处理方法对HBV DNA荧光定量测定重复性的影响,发现其测定的重复性(2份样本的测定CV分别为0.2165和0.3262)明显差于对标本进行核酸纯化后的测定重复性(CV分别为0.0699和0.1092)。这可能是由于煮沸处理血清标本只是将病毒核酸从病毒颗粒中释放出来,因而在吸取离心后的样本上清用于扩增时,样本中很可能或多或少地会含有一些原有的血清标本成分,如血红素及其他一些蛋白等,很难保证在每次吸取时,这些对PCR扩增有干扰的物质的量均是一致的。Roche公司的Amplicor HBV DNA PCR ELISA定量测定方法的批内CV小于0. 2000[1]。
此外,有研究表明,血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性,从而影响PCR测定[2-4]。本组的结果表明,当血清标本中血红蛋白含量为589.00μg/L,可见血清明显为红色,2种标本处理方法测定结果均有降低,但煮沸处理法更为明显(从7.76×106拷贝数/ml降至4.33×105拷贝数/ml);当血红蛋白含量为58.90μg/L,肉眼观察略有红色,而在血红蛋白含量为5.89μg/L时,肉眼观察不到是否溶血,这种情况在临床很常见。采用煮沸裂解方法处理标本,在扩增模板溶液中会有残留的血红蛋白,血红蛋白可通过对Taq酶的强抑制作用而影响扩增检测。但如能在扩增模板制备即标本处理时,将血红蛋白去除,则不会影响后面的扩增检测。从表2可以看出,核酸纯化方法在这两种情况下,结果均无明显改变,而煮沸处理法结果有明显降低。综上所述,在HBV DNA的PCR定量测定时,用煮沸方法处理标本,操作虽简单一些,但测定的重复性明显不如对标本进行核酸纯化后的测定重复性,并且提取效率亦低些。尤其要引起重视的是,由于血液采集及分离血清过程中的操作原因,临床血清样本常见有轻微溶血,煮沸处理标本可致测定结果明显偏低(降低2个数量级),这将使得在监测病人治疗中HBV DNA的定量失去诊断价值,而且在定性测定时,也会由于这些抑制物的存在,而使较弱阳性标本的PCR测定出现假阴性结果。, 百拇医药(李金明 王露楠 邓巍)
当血清标本中血红蛋白含量大于5.89μg/L时,采用煮沸裂解法处理标本,测定HBV DNA的含量明显低于核酸纯化方法(P<0.05)。从荧光定量的扩增变化曲线来看,煮沸裂解法处理标本所得的曲线明显较核酸纯化方法平坦。
四.讨论
在临床进行血清HBV DNA的PCR测定时,由于煮沸处理标本进而直接扩增较核酸提取纯化法简便快速,因而国内绝大部分试剂盒均采用此种标本处理方法,但国外试剂如Roche公司Amplicor HBV DNA PCR ELISA定量测定试剂及Biotronics公司的HBV DNA荧光定量PCR试剂均采用核酸纯化方法。HBV DNA定量测定主要是用于乙型肝炎病人治疗的动态观察及疗效判断,这就要求定量测定要有很好的重复性,从而不至于给出错误的信息。我们探讨了目前国内常用的血清标本煮沸处理方法对HBV DNA荧光定量测定重复性的影响,发现其测定的重复性(2份样本的测定CV分别为0.2165和0.3262)明显差于对标本进行核酸纯化后的测定重复性(CV分别为0.0699和0.1092)。这可能是由于煮沸处理血清标本只是将病毒核酸从病毒颗粒中释放出来,因而在吸取离心后的样本上清用于扩增时,样本中很可能或多或少地会含有一些原有的血清标本成分,如血红素及其他一些蛋白等,很难保证在每次吸取时,这些对PCR扩增有干扰的物质的量均是一致的。Roche公司的Amplicor HBV DNA PCR ELISA定量测定方法的批内CV小于0. 2000[1]。
此外,有研究表明,血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性,从而影响PCR测定[2-4]。本组的结果表明,当血清标本中血红蛋白含量为589.00μg/L,可见血清明显为红色,2种标本处理方法测定结果均有降低,但煮沸处理法更为明显(从7.76×106拷贝数/ml降至4.33×105拷贝数/ml);当血红蛋白含量为58.90μg/L,肉眼观察略有红色,而在血红蛋白含量为5.89μg/L时,肉眼观察不到是否溶血,这种情况在临床很常见。采用煮沸裂解方法处理标本,在扩增模板溶液中会有残留的血红蛋白,血红蛋白可通过对Taq酶的强抑制作用而影响扩增检测。但如能在扩增模板制备即标本处理时,将血红蛋白去除,则不会影响后面的扩增检测。从表2可以看出,核酸纯化方法在这两种情况下,结果均无明显改变,而煮沸处理法结果有明显降低。综上所述,在HBV DNA的PCR定量测定时,用煮沸方法处理标本,操作虽简单一些,但测定的重复性明显不如对标本进行核酸纯化后的测定重复性,并且提取效率亦低些。尤其要引起重视的是,由于血液采集及分离血清过程中的操作原因,临床血清样本常见有轻微溶血,煮沸处理标本可致测定结果明显偏低(降低2个数量级),这将使得在监测病人治疗中HBV DNA的定量失去诊断价值,而且在定性测定时,也会由于这些抑制物的存在,而使较弱阳性标本的PCR测定出现假阴性结果。, 百拇医药(李金明 王露楠 邓巍)