流感病毒的实验室快速诊断方法(上)(2)
鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：
1.血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
2.胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
3.绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
(二)接种途径
1.尿囊腔接种
, http://www.100md.com
通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界边缘约1mm处并避开血管作一标记此即为注射点。在点周围用75%酒精消毒，并用蛋钻机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注人流感病毒0.1一0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃孵箱培养。于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
收获时间根据不同病毒而异，甲型流感病毒一般培养44—48h可进行收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用碘酒或75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走卵壳，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4℃或低温保存待用。
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2.羊膜腔接种
这个接种途径主要应用于临床材料(如患者咽嗽液等)分离病毒。这种接种可直接感染羊腹腔的内面胚层内，也可被鸡胚咽下或吸人，因此，病毒可感染多种组织。还可产生全胚胎感染。病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此羊膜腔接种分离病毒时，除收获羊水外，还应收获尿液。羊膜腔接种法较多，以下介绍其中一种：选7—10日龄鸡胚经照视后，画出气室边缘及标记胚胎位置，在气室端靠近胚胎侧之卵壳上钻一长方形裂痕(约10×6mm)，勿损伤壳膜，钻口处用75%酒精消毒，用消毒镊子除去长方形卵壳和壳膜外层(壁层)，从孔中滴入一滴无菌液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在壳膜内层(脏层)铺开，此时在照卵灯下即可清楚地看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的领下胸前，用针头轻轻拨动下额及腿，当进入羊膜腔时，能见到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射0.1一0.2ml接种物。以沾有碘酒通过火焰的小块胶布封口，置33—35℃恒温箱孵育。孵育72h后，进行收获，方法和收获尿囊液相同。收获前应先冷冻，用75%酒精消毒气室部分的卵壳，用无菌镊子将消毒过的卵壳打碎，取走，再用无菌镊子将内面的壳膜及绒毛尿囊膜撕开，用无菌毛细吸管吸取尿囊液，然后左手持小镊子夹起羊膜成伞状，右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获0.5—1.0mI羊水。如羊水过少，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取洗液。
, 百拇医药(丁丽新)
1.血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
2.胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
3.绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
(二)接种途径
1.尿囊腔接种
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通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界边缘约1mm处并避开血管作一标记此即为注射点。在点周围用75%酒精消毒，并用蛋钻机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注人流感病毒0.1一0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃孵箱培养。于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
收获时间根据不同病毒而异，甲型流感病毒一般培养44—48h可进行收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用碘酒或75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走卵壳，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4℃或低温保存待用。
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2.羊膜腔接种
这个接种途径主要应用于临床材料(如患者咽嗽液等)分离病毒。这种接种可直接感染羊腹腔的内面胚层内，也可被鸡胚咽下或吸人，因此，病毒可感染多种组织。还可产生全胚胎感染。病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此羊膜腔接种分离病毒时，除收获羊水外，还应收获尿液。羊膜腔接种法较多，以下介绍其中一种：选7—10日龄鸡胚经照视后，画出气室边缘及标记胚胎位置，在气室端靠近胚胎侧之卵壳上钻一长方形裂痕(约10×6mm)，勿损伤壳膜，钻口处用75%酒精消毒，用消毒镊子除去长方形卵壳和壳膜外层(壁层)，从孔中滴入一滴无菌液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在壳膜内层(脏层)铺开，此时在照卵灯下即可清楚地看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的领下胸前，用针头轻轻拨动下额及腿，当进入羊膜腔时，能见到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射0.1一0.2ml接种物。以沾有碘酒通过火焰的小块胶布封口，置33—35℃恒温箱孵育。孵育72h后，进行收获，方法和收获尿囊液相同。收获前应先冷冻，用75%酒精消毒气室部分的卵壳，用无菌镊子将消毒过的卵壳打碎，取走，再用无菌镊子将内面的壳膜及绒毛尿囊膜撕开，用无菌毛细吸管吸取尿囊液，然后左手持小镊子夹起羊膜成伞状，右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获0.5—1.0mI羊水。如羊水过少，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取洗液。
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