流感病毒的实验室快速诊断方法(上)(3)
第二章 组织培养法
一、概况
由于病毒缺少本身的酶系统，必须依赖宿主细胞的酶和代谢系统才能达到病毒的复制。因此，组织培养技术的原理主要是供应及维持合适的细胞来支持病毒的繁殖。病毒在敏感细胞的复制常常引起细胞病变以及病毒释放到维持液中，可以以此作为病毒的实验诊断、抗原及疫苗的制备。与鸡胚接种法比较，组织培养法更为敏感，应用更为广泛，一般2—3天可报告实验结果。
二、材料
(一)Hank’s溶液
(二)0.25%胰酶和Versene消化液
(三)生长液：含10%一15%胎牛或小牛血清、终浓度分别每m1含l00U，100μg，50U和50μg的青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的Eagle’s MEM或水解乳蛋白溶液，用5.6%NaHCO3将pH调至7.3土0.1。注意，用Eagle’s MEM时应查明是否已含谷氨酰胺，如不含，应每100mI中补加配好的谷氨酰胺1m1。
(四)维持液：同培养液，但不含小牛血清，含终浓度为5μg/m1的胰酶。
(五)玻璃器材等
三、组织培养技术
(一)MDCK细胞传代
1.先把需用的溶液置室温，使其温度达室温，也可放37℃水浴预温。
2.已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。
3.把Versene与0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3m1(加入量应根据瓶大小不同而异)。
4.置37℃恒温箱5—10min，在此期间应在光学显微镜下观察1—2次，当细胞变圆，细胞与细胞问互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万别消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。
5.倒掉消化液，每瓶加入9m1Eagle’s MEM生长液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。
6.吸出6mI接种2小瓶，3m1/l瓶，把原瓶留下。置37℃恒温箱培养。
一般情况下，一瓶细胞传3瓶，如细胞急着用，也可一传二。有时不急着用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2—3天需传代一次。
(二)成片细胞的维持
细胞已成片如继续培养，则易老化甚至脱落。因此，成片细胞如不能当天应用，可放室温(20℃左右)或可换成含2%小牛血液的维持液，每5—7天换一次液，一般可维持1—3个星期。
(三)第二代细胞的制备
利用第二代细胞培养病毒的优点是单层细胞一般较原代细胞生长均匀。在组织来源缺乏或原代细胞成片后不能立即应用时，可做第二代细胞的细胞培养。方法是将原代成片细胞瓶的生长液倒掉，用Hank’s液洗一次，根据瓶的大小加人能盖满成片细胞的0.1%一25%胰酶，pH7.6，放37℃或室温2—3分钟，将瓶倒放使细胞朝上液体在下面，在显微镜下观察，细胞如开始收缩，即将胰酶倒掉，加人生长液吹打并分散细胞。生长液的量可按原量2倍加，即一瓶传二瓶。, 百拇医药(丁丽新)
一、概况
由于病毒缺少本身的酶系统，必须依赖宿主细胞的酶和代谢系统才能达到病毒的复制。因此，组织培养技术的原理主要是供应及维持合适的细胞来支持病毒的繁殖。病毒在敏感细胞的复制常常引起细胞病变以及病毒释放到维持液中，可以以此作为病毒的实验诊断、抗原及疫苗的制备。与鸡胚接种法比较，组织培养法更为敏感，应用更为广泛，一般2—3天可报告实验结果。
二、材料
(一)Hank’s溶液
(二)0.25%胰酶和Versene消化液
(三)生长液：含10%一15%胎牛或小牛血清、终浓度分别每m1含l00U，100μg，50U和50μg的青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的Eagle’s MEM或水解乳蛋白溶液，用5.6%NaHCO3将pH调至7.3土0.1。注意，用Eagle’s MEM时应查明是否已含谷氨酰胺，如不含，应每100mI中补加配好的谷氨酰胺1m1。
(四)维持液：同培养液，但不含小牛血清，含终浓度为5μg/m1的胰酶。
(五)玻璃器材等
三、组织培养技术
(一)MDCK细胞传代
1.先把需用的溶液置室温，使其温度达室温，也可放37℃水浴预温。
2.已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。
3.把Versene与0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3m1(加入量应根据瓶大小不同而异)。
4.置37℃恒温箱5—10min，在此期间应在光学显微镜下观察1—2次，当细胞变圆，细胞与细胞问互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万别消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。
5.倒掉消化液，每瓶加入9m1Eagle’s MEM生长液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。
6.吸出6mI接种2小瓶，3m1/l瓶，把原瓶留下。置37℃恒温箱培养。
一般情况下，一瓶细胞传3瓶，如细胞急着用，也可一传二。有时不急着用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2—3天需传代一次。
(二)成片细胞的维持
细胞已成片如继续培养，则易老化甚至脱落。因此，成片细胞如不能当天应用，可放室温(20℃左右)或可换成含2%小牛血液的维持液，每5—7天换一次液，一般可维持1—3个星期。
(三)第二代细胞的制备
利用第二代细胞培养病毒的优点是单层细胞一般较原代细胞生长均匀。在组织来源缺乏或原代细胞成片后不能立即应用时，可做第二代细胞的细胞培养。方法是将原代成片细胞瓶的生长液倒掉，用Hank’s液洗一次，根据瓶的大小加人能盖满成片细胞的0.1%一25%胰酶，pH7.6，放37℃或室温2—3分钟，将瓶倒放使细胞朝上液体在下面，在显微镜下观察，细胞如开始收缩，即将胰酶倒掉，加人生长液吹打并分散细胞。生长液的量可按原量2倍加，即一瓶传二瓶。, 百拇医药(丁丽新)