流感病毒的实验室快速诊断方法(下)(2)
收集的血清进行酶标记，即为酶标记的抗鸡IgG抗血清。
(二)80%丙酮制备 8份丙酮2份生理盐水配制，4℃保存待用。
(三)长成片的MDCK细胞
(四)待检标本和对照标本
(五)实验步骤：
1.长成片的MDCK细胞，弃生长液，用Hank’s液洗两次。
2.在细胞板上按图4—1做标记(甲1型，甲3型，乙型为当前人群主要流行病毒株)。既每份标本3孔，按图4—1所示，每孔加入0.1ml相应标本。
3.盖好盖子，35℃ CO2孵箱培养2小时。
4.取出，倒掉接种液，用Hank’s液洗两次，每孔加入0.1ml细胞维持液(见第二章)，35℃CO2孵箱过夜培养。
5.取出，倒掉细胞维持液，用生理盐水洗两次，每孔加入0.1ml/孔80%丙酮，4℃20—30分钟。
6.倒掉丙酮，孔朝上，置室温30一60min，让丙酮完全挥发掉。
7.按图4—1所示，分别加入0.1ml/孔工作浓度的抗血清，置室温结合1—2小时。
8.倒掉抗血清，用洗涤液洗5遍，晾干，加工作浓度的酶标抗体，0.1m1/孔。如用兔的就得用酶标记兔的IgG抗血清；如用鼠单抗就得用酶标抗鼠的IgG抗血清。室温孵育1—2h。
9.例掉第二抗体，用洗涤液洗5遍，晾干。
10.加入OPD—H202底物0.1m1/孔，置盒子中(不能露光)，室温20分钟。
11.结果观察与判断。
首先观察对照组：加维持液的不应显色；阳性对照组只能本身对本身的显色，对不同亚型和不同型的不应显色；实验组：与甲3亚型血清显色的，表明待检标本为甲3亚型，同理为甲l亚型或乙型。
近来国外多用混合的单克隆抗体，因单克隆抗体特异性强，用单个的易发生漏检，用多个混在一起就可大大提高检出率。有时用混合的抗Np的单克隆抗体，这样只能查出特检标本是甲型还是乙型流感病毒。
为提高了标本的检出率，常常每标本接种18孔以上。凡1—2孔出现阳性就可判为阳性标本。
由于病毒通过MDCK细胞扩增后，大大提高了标本的检出率，同时MDCK细胞不存有与底物显颜色的内酶来影响ELISA测定，方法也较简便，第二天就可出结果。故MDCIK—ELISA为目前流感诊断中用得最广泛的方法之一。
最后观察结果时，也可以下列形式进行：(1)每孔加入底物，置室温30分钟。(2)弃底物，用PBS洗两次.(3)每孔加100一300 μl PBS。(4)用阅片灯或白色灯光背景观察各孔染色，或以倒置显微镜察看细胞染色。
在显微镜下，正常未感染病毒的细胞不着色，而感染病毒的细胞整个胞体呈暗红色。
由于临床标本中常含有上皮细胞、酵母菌或其它细胞碎片，而这些杂质常带黄色或浅棕色，因此，必须仔细观察加以区别。, http://www.100md.com(丁丽新)
(二)80%丙酮制备 8份丙酮2份生理盐水配制，4℃保存待用。
(三)长成片的MDCK细胞
(四)待检标本和对照标本
(五)实验步骤：
1.长成片的MDCK细胞，弃生长液，用Hank’s液洗两次。
2.在细胞板上按图4—1做标记(甲1型，甲3型，乙型为当前人群主要流行病毒株)。既每份标本3孔，按图4—1所示，每孔加入0.1ml相应标本。
3.盖好盖子，35℃ CO2孵箱培养2小时。
4.取出，倒掉接种液，用Hank’s液洗两次，每孔加入0.1ml细胞维持液(见第二章)，35℃CO2孵箱过夜培养。
5.取出，倒掉细胞维持液，用生理盐水洗两次，每孔加入0.1ml/孔80%丙酮，4℃20—30分钟。
6.倒掉丙酮，孔朝上，置室温30一60min，让丙酮完全挥发掉。
7.按图4—1所示，分别加入0.1ml/孔工作浓度的抗血清，置室温结合1—2小时。
8.倒掉抗血清，用洗涤液洗5遍，晾干，加工作浓度的酶标抗体，0.1m1/孔。如用兔的就得用酶标记兔的IgG抗血清；如用鼠单抗就得用酶标抗鼠的IgG抗血清。室温孵育1—2h。
9.例掉第二抗体，用洗涤液洗5遍，晾干。
10.加入OPD—H202底物0.1m1/孔，置盒子中(不能露光)，室温20分钟。
11.结果观察与判断。
首先观察对照组：加维持液的不应显色；阳性对照组只能本身对本身的显色，对不同亚型和不同型的不应显色；实验组：与甲3亚型血清显色的，表明待检标本为甲3亚型，同理为甲l亚型或乙型。
近来国外多用混合的单克隆抗体，因单克隆抗体特异性强，用单个的易发生漏检，用多个混在一起就可大大提高检出率。有时用混合的抗Np的单克隆抗体，这样只能查出特检标本是甲型还是乙型流感病毒。
为提高了标本的检出率，常常每标本接种18孔以上。凡1—2孔出现阳性就可判为阳性标本。
由于病毒通过MDCK细胞扩增后，大大提高了标本的检出率，同时MDCK细胞不存有与底物显颜色的内酶来影响ELISA测定，方法也较简便，第二天就可出结果。故MDCIK—ELISA为目前流感诊断中用得最广泛的方法之一。
最后观察结果时，也可以下列形式进行：(1)每孔加入底物，置室温30分钟。(2)弃底物，用PBS洗两次.(3)每孔加100一300 μl PBS。(4)用阅片灯或白色灯光背景观察各孔染色，或以倒置显微镜察看细胞染色。
在显微镜下，正常未感染病毒的细胞不着色，而感染病毒的细胞整个胞体呈暗红色。
由于临床标本中常含有上皮细胞、酵母菌或其它细胞碎片，而这些杂质常带黄色或浅棕色，因此，必须仔细观察加以区别。, http://www.100md.com(丁丽新)