调心方有效部位TX0201对类AD大鼠学习记忆和胆碱能系统的影响(基金项目)
http://www.100md.com
中华实用医药杂志 2003年12月 第3卷 第23期
基金项目:国家自然科学基金重点项目(编号:39830450)
【摘要】 目的 观察调心方有效部位TX0201对类阿尔茨海默病(AD)大鼠的空间学习记忆和胆碱能系统的影响。方法 应用β-淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)注射入大鼠右侧杏仁核，建立类AD的动物模型;用Morris水迷宫法测试大鼠学习记忆能力;用化学比色法测定大鼠皮质的乙酰胆碱酯酶含量;采用放射免疫法测定胆碱乙酰化转移酶的含量。结果 TX0201能够改善类AD大鼠的学习记忆能力，降低大鼠脑内乙酰胆碱酯酶的含量，但对胆碱乙酰化转移酶无作用。结论 调心方有效部位TX0201能有效改善Aβ25-35单侧杏仁核注射类AD大鼠的学习记忆能力，其作用与抑制胆碱酯酶活性有关，与多奈哌齐(Donepezil)相似。
关键词 Alzheimer病 β-淀粉样蛋白 TX0201 Morris水迷宫 胆碱能系统
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)23-2125-03
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Effect of TX0201abstracted from“Heart-Regulating Formula”
on spatial learning and cholinergic system in treatment of
rat with Alzheimer’s disease
Yu Zhihua，Yang Ge，Jin Hongshu，et al.
Institute of Geratogogy，Shanghai University of TCM，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To observe the effect of TX0201abstracted from“Heart-Regulating Formula”on spatial learning and cholinergic system in treatment of ratwith Alzheimer’s disease.Methods Rat models of AD were induced by unilateral Aβ25-35injected into the right side amygdale.The effect of TX0201on spatial learning and memory ability of these rat models was investigated with the method ofMorris water maze;and the effect of cholineergic system(AchE，ChAT)of these ratmodels was investigated with immunoradiometry and chemical colorimetory.ResultsTX0201could significantly improve the spatial learning and memory disturbance，decrease the activity of AchE，has no effect on the activity of ChAT.ConclusionTX0201abstracted from“Heart-Regulating Formula”has significant ameliorative effects on spatial learning and memory disturbance of rat models with induced by Aβ25-35.The reason is decrease the activity of AchE，same as Donepezil.
, 百拇医药
Key words Alzheimer’disease amyloid-βprotein TX0201 Morris water maze cholinergic system
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经系统慢性退行性病变，其主要病理特征为神经元丢失、大量老年斑(SP)、神经纤维缠结(NFT)。由于该病的发病原因尚不清楚，国际上关于此病的发病机制主要有:β-淀粉样蛋白(Amyloid-βProtein)毒性假说 [1] 、Tau蛋白异常修饰说 [2] 、神经细胞凋亡说 [3] 等。目前本病在病因、诊断和治疗上尚无突破性的进展。调心方是林水淼教授多年来治疗AD的经验方，取得了较好的临床疗效 [4] 。在此方基础上，经过进一步分离提取得到的有效部位TX0201，具有改善东莨菪碱小鼠学习记忆的能力。本文以多奈哌齐为对照，观察调心方有效部位TX0201对Aβ25-35诱导的类阿尔茨海默病(AD)大鼠的空间学习记忆和胆碱能系统的影响。
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1 材料与方法
1.1 动物与分组 SD雄性大鼠，清洁级，体重(250±30)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，室温18～22℃，日光辅助照明，维持每日光照12h，自由摄食与饮水。造模前进行水迷宫训练3天，剔除差异明显的大鼠，随机分为正常组、类AD模型组、TX0201组和多奈哌齐组，每组8只。
1.2 药物与用药 调心方有效部位TX0201由党参、茯苓、桂枝、远志等中药组成，经D101大孔吸附树脂分离提取，总皂甙含量超过50%，每毫升含29.8g，由上海中医药大学老年医学研究所提供。多奈哌齐由英国Boots公司生产，5mg/片。TX0201组和多奈哌齐组分别于造模后第2天给予(依标准动物体质量法，分别相当于成人每日用量的10倍)，1次/d，连续2周，迷宫测试期间，于测试前30min给药。其余各组用等量的双蒸水灌胃。
1.3 动物造模 参照文献 [5] ，以2%的戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉大鼠，立体定位仪固定头部，切开皮肤，暴露头骨，于前囟后3.2mm、右侧旁开4.3mm处进针，深8.5mm，然后匀速推注5.0nmol(用0.1%的三氟乙酸溶解)的Aβ25-35(Sigma公司生产)，6min内注射完毕，留针5min后缓慢退出。
, 百拇医药
1.4 空间学习能力测试 采用Morris水迷宫法 [6] ，水迷宫由上海中医药大学老年所提供。各组大鼠在灌胃开始后第10天进行水迷宫测定，连续5天。实验在暗室中进行，将大鼠移至暗室中适应30min后开始测试。平台设于迷宫西南象限正中，水面高出平台1.5cm，水温保持在19℃～20℃，每天2次，分别从正北、正东两个起始点投放，设定最长游动时限为70s，以秒表计时，记录大鼠找到平台所需的时间，或称潜伏期。
1.5 乙酰胆碱酯酶(AchE)测定 连续14天用药，第15天将动物断头处死，于冰台上快速取右侧脑皮层和海马，用生理盐水制成10%的匀浆液，然后以1500rpm低温离心15min，取上清至于-70℃冰箱待测。采用化学比色法测 定，试剂盒由南京建成公司生产，严格按照试剂盒说明书程序进行测定。蛋白测定用考马氏兰比色法。
1.6 胆碱乙酰转移酶(ChAT)测定 采用[1-14C]Ac-CoA掺入法，[1-14C]Ac-CoA为Amersham公司产品，比放射性2-10Ci/mmol。
, 百拇医药
1.7 统计学处理 数据以X±s表示，经SPSS11.0软件在PC上进行处理，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 给药后各组类AD大鼠水迷宫实验结果 见表1。
表1 给药后各组类AD大鼠水迷宫实验结果 (X±s，s)
由表1可见，随着训练天数的增加，各组的平均潜伏期均逐渐缩短。第1天，模型组与正常组之间差异有显著性(P<0.05)，模型组与TX0201和多奈哌齐组之间差异无显著性(P>0.05)。从第2天开始至第5天，模型组与正常组之间差异有显著性(P<0.05)，TX0201和多奈哌齐组的潜伏期明显缩短，较模型组组间比较差异均有显著性(P<0.05)。TX0201和多奈哌齐组之间差异无显著性(P>0.05)。表明TX0201和多奈哌齐组均能显著改善Aβ25-35诱导的类AD大鼠的空间学习记忆。
, 百拇医药
2.2 给药后各组类AD大鼠胆碱能系统的变化 见表2。
表2 给药后各组类AD大鼠皮质AchE和ChAT活性的变化
注:与模型组比较 ˇ P<0.05
由表2可见，调心方有效部位TX0201与模型组比较， 可以显著抑制Aβ25-35诱导的类AD大鼠脑内皮质的AchE(P<0.05)，多奈哌齐组也有显著差异。但二方对脑内皮质中的ChAT酶差异均无显著性。
3 讨论
目前国内外众多的实验室从不同的角度研制AD动物模型，但是各种动物模型均不能全面反映出AD的病理特征。Aβ是AD患者脑内老年斑的主要组成部分，同时其毒性也是AD病理机制中的一个重要环节，所以采用长度不同Aβ片段进行脑内注射是比较常用的制造类AD模型方法。Aβ25-35是Aβ蛋白序列中神经毒性较强的片段，实验表明，通过Aβ25-35单侧杏仁核注射，可以造成大鼠学习记忆和脑内胆碱能系统的改变 [5] 。
, 百拇医药
尽管AD的病因尚未完全阐明，但胆碱能低下是迄今公认的AD典型表现。多奈哌齐是FDA批准的第二代胆碱酯酶抑制剂，目前认为它的治疗作用是可逆性的抑制胆碱酯酶引起的乙酰胆碱水解，达到增加受体部位乙酰胆碱的作用。通过本实验可见，该药能够抑制Aβ25-35诱导的类AD大鼠脑内皮质的AchE，从而提高大鼠的学习记忆能力，但对ChAT酶无作用。在调心方基础上进一步分离提取得到的TX0201也能显著抑制类AD大鼠脑内的AchE，而对ChAT酶无显著作用，这与以往报导 [5] 中的调心方作用有所不同，可能与其作为有效部位，作用靶点相应专一有关。
总之，通过对调心方进一步分离提取，可以明确复方中不同有效部位的各自作用靶点，有利于全面认识中药理论和中药复方多成分、多靶点的治疗模式，阐明中药复方的作用机制。同时排除无治疗作用生物成分，筛选出治疗AD的更加高效、安全的中医新药。
参考文献
, 百拇医药 1 Selkoe DJ.Alzheimer’s disease:A central role for amyloid.J Neuˉropathol Exp Neurol，1994，53:438-447.
2 Smale G，Nichiols NR，Brady DR，et al.Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer’s disease.Exp Neurol，1995，133:225-230.
3 Barinaga M.Is apoptosis key in Alzheimer’s disease.Science，1998，281:1303-1304.
4 林水淼，周如倩，等.调心方、补肾方对阿尔茨海默病患者认知功能的临床研究.中国老年学杂志，2002，22(专刊):25-28.
5 刘学源，徐品初，等.调心方对杏仁核注射Aβ大鼠记忆行为胆碱能系统的影响.现代康复，2001，5(5):48-49.
6 Morris R.Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat.J Neurosci Methods，1984，11(4):47-49.
作者单位:200032上海中医药大学老年医学研究所
(编辑罗 彬), 百拇医药(郁志华 杨 戈 金红姝 张钦传 林水淼)
【摘要】 目的 观察调心方有效部位TX0201对类阿尔茨海默病(AD)大鼠的空间学习记忆和胆碱能系统的影响。方法 应用β-淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)注射入大鼠右侧杏仁核，建立类AD的动物模型;用Morris水迷宫法测试大鼠学习记忆能力;用化学比色法测定大鼠皮质的乙酰胆碱酯酶含量;采用放射免疫法测定胆碱乙酰化转移酶的含量。结果 TX0201能够改善类AD大鼠的学习记忆能力，降低大鼠脑内乙酰胆碱酯酶的含量，但对胆碱乙酰化转移酶无作用。结论 调心方有效部位TX0201能有效改善Aβ25-35单侧杏仁核注射类AD大鼠的学习记忆能力，其作用与抑制胆碱酯酶活性有关，与多奈哌齐(Donepezil)相似。
关键词 Alzheimer病 β-淀粉样蛋白 TX0201 Morris水迷宫 胆碱能系统
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)23-2125-03
, http://www.100md.com
Effect of TX0201abstracted from“Heart-Regulating Formula”
on spatial learning and cholinergic system in treatment of
rat with Alzheimer’s disease
Yu Zhihua，Yang Ge，Jin Hongshu，et al.
Institute of Geratogogy，Shanghai University of TCM，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To observe the effect of TX0201abstracted from“Heart-Regulating Formula”on spatial learning and cholinergic system in treatment of ratwith Alzheimer’s disease.Methods Rat models of AD were induced by unilateral Aβ25-35injected into the right side amygdale.The effect of TX0201on spatial learning and memory ability of these rat models was investigated with the method ofMorris water maze;and the effect of cholineergic system(AchE，ChAT)of these ratmodels was investigated with immunoradiometry and chemical colorimetory.ResultsTX0201could significantly improve the spatial learning and memory disturbance，decrease the activity of AchE，has no effect on the activity of ChAT.ConclusionTX0201abstracted from“Heart-Regulating Formula”has significant ameliorative effects on spatial learning and memory disturbance of rat models with induced by Aβ25-35.The reason is decrease the activity of AchE，same as Donepezil.
, 百拇医药
Key words Alzheimer’disease amyloid-βprotein TX0201 Morris water maze cholinergic system
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经系统慢性退行性病变，其主要病理特征为神经元丢失、大量老年斑(SP)、神经纤维缠结(NFT)。由于该病的发病原因尚不清楚，国际上关于此病的发病机制主要有:β-淀粉样蛋白(Amyloid-βProtein)毒性假说 [1] 、Tau蛋白异常修饰说 [2] 、神经细胞凋亡说 [3] 等。目前本病在病因、诊断和治疗上尚无突破性的进展。调心方是林水淼教授多年来治疗AD的经验方，取得了较好的临床疗效 [4] 。在此方基础上，经过进一步分离提取得到的有效部位TX0201，具有改善东莨菪碱小鼠学习记忆的能力。本文以多奈哌齐为对照，观察调心方有效部位TX0201对Aβ25-35诱导的类阿尔茨海默病(AD)大鼠的空间学习记忆和胆碱能系统的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 动物与分组 SD雄性大鼠，清洁级，体重(250±30)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，室温18～22℃，日光辅助照明，维持每日光照12h，自由摄食与饮水。造模前进行水迷宫训练3天，剔除差异明显的大鼠，随机分为正常组、类AD模型组、TX0201组和多奈哌齐组，每组8只。
1.2 药物与用药 调心方有效部位TX0201由党参、茯苓、桂枝、远志等中药组成，经D101大孔吸附树脂分离提取，总皂甙含量超过50%，每毫升含29.8g，由上海中医药大学老年医学研究所提供。多奈哌齐由英国Boots公司生产，5mg/片。TX0201组和多奈哌齐组分别于造模后第2天给予(依标准动物体质量法，分别相当于成人每日用量的10倍)，1次/d，连续2周，迷宫测试期间，于测试前30min给药。其余各组用等量的双蒸水灌胃。
1.3 动物造模 参照文献 [5] ，以2%的戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉大鼠，立体定位仪固定头部，切开皮肤，暴露头骨，于前囟后3.2mm、右侧旁开4.3mm处进针，深8.5mm，然后匀速推注5.0nmol(用0.1%的三氟乙酸溶解)的Aβ25-35(Sigma公司生产)，6min内注射完毕，留针5min后缓慢退出。
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1.4 空间学习能力测试 采用Morris水迷宫法 [6] ，水迷宫由上海中医药大学老年所提供。各组大鼠在灌胃开始后第10天进行水迷宫测定，连续5天。实验在暗室中进行，将大鼠移至暗室中适应30min后开始测试。平台设于迷宫西南象限正中，水面高出平台1.5cm，水温保持在19℃～20℃，每天2次，分别从正北、正东两个起始点投放，设定最长游动时限为70s，以秒表计时，记录大鼠找到平台所需的时间，或称潜伏期。
1.5 乙酰胆碱酯酶(AchE)测定 连续14天用药，第15天将动物断头处死，于冰台上快速取右侧脑皮层和海马，用生理盐水制成10%的匀浆液，然后以1500rpm低温离心15min，取上清至于-70℃冰箱待测。采用化学比色法测 定，试剂盒由南京建成公司生产，严格按照试剂盒说明书程序进行测定。蛋白测定用考马氏兰比色法。
1.6 胆碱乙酰转移酶(ChAT)测定 采用[1-14C]Ac-CoA掺入法，[1-14C]Ac-CoA为Amersham公司产品，比放射性2-10Ci/mmol。
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1.7 统计学处理 数据以X±s表示，经SPSS11.0软件在PC上进行处理，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 给药后各组类AD大鼠水迷宫实验结果 见表1。
表1 给药后各组类AD大鼠水迷宫实验结果 (X±s，s)
由表1可见，随着训练天数的增加，各组的平均潜伏期均逐渐缩短。第1天，模型组与正常组之间差异有显著性(P<0.05)，模型组与TX0201和多奈哌齐组之间差异无显著性(P>0.05)。从第2天开始至第5天，模型组与正常组之间差异有显著性(P<0.05)，TX0201和多奈哌齐组的潜伏期明显缩短，较模型组组间比较差异均有显著性(P<0.05)。TX0201和多奈哌齐组之间差异无显著性(P>0.05)。表明TX0201和多奈哌齐组均能显著改善Aβ25-35诱导的类AD大鼠的空间学习记忆。
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2.2 给药后各组类AD大鼠胆碱能系统的变化 见表2。
表2 给药后各组类AD大鼠皮质AchE和ChAT活性的变化
注:与模型组比较 ˇ P<0.05
由表2可见，调心方有效部位TX0201与模型组比较， 可以显著抑制Aβ25-35诱导的类AD大鼠脑内皮质的AchE(P<0.05)，多奈哌齐组也有显著差异。但二方对脑内皮质中的ChAT酶差异均无显著性。
3 讨论
目前国内外众多的实验室从不同的角度研制AD动物模型，但是各种动物模型均不能全面反映出AD的病理特征。Aβ是AD患者脑内老年斑的主要组成部分，同时其毒性也是AD病理机制中的一个重要环节，所以采用长度不同Aβ片段进行脑内注射是比较常用的制造类AD模型方法。Aβ25-35是Aβ蛋白序列中神经毒性较强的片段，实验表明，通过Aβ25-35单侧杏仁核注射，可以造成大鼠学习记忆和脑内胆碱能系统的改变 [5] 。
, 百拇医药
尽管AD的病因尚未完全阐明，但胆碱能低下是迄今公认的AD典型表现。多奈哌齐是FDA批准的第二代胆碱酯酶抑制剂，目前认为它的治疗作用是可逆性的抑制胆碱酯酶引起的乙酰胆碱水解，达到增加受体部位乙酰胆碱的作用。通过本实验可见，该药能够抑制Aβ25-35诱导的类AD大鼠脑内皮质的AchE，从而提高大鼠的学习记忆能力，但对ChAT酶无作用。在调心方基础上进一步分离提取得到的TX0201也能显著抑制类AD大鼠脑内的AchE，而对ChAT酶无显著作用，这与以往报导 [5] 中的调心方作用有所不同，可能与其作为有效部位，作用靶点相应专一有关。
总之，通过对调心方进一步分离提取，可以明确复方中不同有效部位的各自作用靶点，有利于全面认识中药理论和中药复方多成分、多靶点的治疗模式，阐明中药复方的作用机制。同时排除无治疗作用生物成分，筛选出治疗AD的更加高效、安全的中医新药。
参考文献
, 百拇医药 1 Selkoe DJ.Alzheimer’s disease:A central role for amyloid.J Neuˉropathol Exp Neurol，1994，53:438-447.
2 Smale G，Nichiols NR，Brady DR，et al.Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer’s disease.Exp Neurol，1995，133:225-230.
3 Barinaga M.Is apoptosis key in Alzheimer’s disease.Science，1998，281:1303-1304.
4 林水淼，周如倩，等.调心方、补肾方对阿尔茨海默病患者认知功能的临床研究.中国老年学杂志，2002，22(专刊):25-28.
5 刘学源，徐品初，等.调心方对杏仁核注射Aβ大鼠记忆行为胆碱能系统的影响.现代康复，2001，5(5):48-49.
6 Morris R.Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat.J Neurosci Methods，1984，11(4):47-49.
作者单位:200032上海中医药大学老年医学研究所
(编辑罗 彬), 百拇医药(郁志华 杨 戈 金红姝 张钦传 林水淼)