大蒜素抗肝纤维化机理的探讨
【摘要】 目的 本研究初步探讨大蒜素对体外培养肝星形细胞增殖的影响，进而阐明其对肝纤维化的防治作用。方法 采用链霉蛋白酶和胶原酶消化密度梯度离心法分离肝星形细胞;使用不同浓度大蒜素后MTT法检测其增殖情况。结果 药物浓度与MTT吸光度值呈负相关。与对照组胸腺因子D相比，大蒜素对细胞增殖有明显抑制作用。结论 大蒜素能抑制星形细胞增殖，具有体外抗肝纤维化作用，可能成为一种新的抗肝纤维化药物。
关键词 肝纤维化 大蒜素 肝星形细胞 增殖
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)02-0102-02
Antifibrotic mechanism of garlic on hepatic stellate cell
Mei Shuang，TaoLihua，You Shuqing，et al.
, http://www.100md.com
Qiqiha’er Medical College，Heilongjiang161042.
【Abstract】 Objective To investigate the antifibrotic mechanism of garlicon hepatic stellate cell(HSC).Methods HSC were isolated and cultured with method of density gradient centrifugation after digested in pronase and collagenase.Proliferation of HSC was analysed withMTT492.HSCs were exposed to garlic which was diluted with10%serum DMEM in different concentrations for48hours.MTT was added in and assayed after4hours with microplate reader in OD492.Results The OD492value was negatively related to garlic concentration.Compared with the conˉtrol，garlic can inhibit HSC proliferation.The effect is more significant at the concentration of>2μg/ml.Conclusion Garlic can inhibit HSC proliferation and has antifibrotic potential in liver fibrosis in vitro.
, 百拇医药
Key words liver fibrosis garlic hepatic stellate cell proliferation
肝纤维化是慢性肝病共同的病理特征，也是向肝硬化发展的重要中间环节，涉及到复杂的细胞及分子机制的动态过程，肝星形细胞(Hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化发生、发展的核心环节 [1] ，导致细胞外基质合成过多，降解减少，大量沉积在肝脏形成纤维化。目前国内外尚无确切的治疗肝纤维化的药物，本实验探讨大蒜素对大鼠HSC的影响，为防治肝纤维化寻求有效药物。
1 材料和方法
1.1 HSC的分离和培养 雄性Wistar大鼠，体重450～500g，购于佳木斯大学实验动物中心。链霉蛋白酶和胶原酶联合消化Nycordenz介质密度梯度离心分离大鼠肝星形细胞，取少量用于观察和计数，其余的按1×10 5 浓度接种在培养瓶，放于37℃5%CO 2 培养箱中，48h后更换培养液。
, http://www.100md.com
1.2 细胞鉴定 (1)荧光显微镜观察:制备细胞滴片，在328nm波长光下观察和计数具有蓝绿色荧光细胞数。荧光易淬灭。(2)细胞活率鉴定:活细胞数检查，取少量细胞悬液，按9:1体积加入0.4%台盼蓝混匀后倒置显微镜观察，并记录未着色的细胞数。活细胞数占细胞总数98%。(3)细胞纯度鉴定:免疫组化检测结蛋白(desmin)新分离细胞的desmin阳性率为94%，接种7天后几乎100%为desmin阳性细胞。
1.3 噻唑蓝(MTT)检测法 (1)血清浓度与MTT吸光度的 关系:细胞接种于96孔培养板上，分别加0、5%、10%、20%的DMEM培养液培养48h，各孔加入200μl浓度为0.5%的MTT，37℃孵育4h，弃去上清，加入200μl二甲基桠枫溶解MTT结晶，在酶标仪上检测波长492nm的吸光度(OD 492 )。(2)MTT法选择大蒜素有效实验浓度:按一系列浓度(0.5μg/ml1.0μg/ml2.0μg/ml10.0μg/ml)分别制备10%血清大蒜素(购于湖北五三制药厂)和胸腺因子D(购于福州金山制药厂)，并设不加药物的空白对照。将HSC按1×10 5 浓度接种于96孔培养板中，培养24h后换成药物稀释液培养48h后，各孔加入200μl浓度为0.5%的MTT，37℃孵育4h，弃去上清，加入200μl二甲基桠枫(DMSO)溶解MTT结晶，在酶标仪上检测波长492nm的吸光度(OD 492 )。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 所有数据用均数±标准差(X±s)表示，组间比较采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析和t检验。
2 结果
2.1 形态学观察 新分离的HSC胞浆中富含脂滴，接种24h后，细胞贴壁呈椭圆形，胞浆内脂滴减少，少量细胞开始伸展，48h后大部分细胞伸展生长，部分出现伪足，细胞呈星形。随着天数增加，胞质内脂滴逐渐减少，细胞由星形向梭形转变，第7天细胞形态类似成纤维细胞，13天呈局灶性生长。原代培养48h加入不同浓度药物溶液，与对照组比，细胞伸展缓慢，增殖细胞减少。
2.2 血清浓度与MTT吸光度的关系 5%～20%范围内，血清浓度与MTT吸光度值明显相关(P<0.01)，说明小牛血清在一定范围内刺激HSC的增殖(见表1)。表1 不同血清浓度对MTT法(略)
2.3 MTT法检测大蒜素对HSC增殖的影响 细胞增殖率随大蒜素浓度的增加不断下降，且与大蒜素呈剂量依赖性关系。与胸腺因子D比较，大蒜素浓度在0.5μg/ml对细胞增殖出现抑制作用，在2.0～10.0μg/ml范围，对细胞增殖有明显抑制作用。(见表2)表2 MTT法检测大蒜素对HSC增殖的影响 (略)
, 百拇医药
3 讨论
肝纤维化是一个慢性渐进性过程，包括炎症、损伤和修复、重建三个阶段，持续发展最终导致肝硬化。HSC在肝纤维化中起核心作用。各种病因造成肝脏损伤引起细胞外基质(ECM)微环境改变，及肝脏内细胞和炎症细胞产生大量的生长因子、细胞因子及脂质过氧化产物通过旁分泌途径共同作用于HSC使其基因表达改变，导致静止的HSC形态及功能改变，表现为ECM合成及降解发生改变，生长因子、细胞因子及其受体表达，肌动蛋白等收缩结构出现使其转化为具有增殖、收缩及合成能力的肌成纤维细胞。活化后的HSC大量产生成分异常的ECM，替代正常基底膜胶原，且胶原降解减少，ECM合成与降解不平衡，异常沉积形成肝纤维化，并进一步加重HSC的激活，形成恶性循环，使纤维化不断加重。
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，其原理是 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，DMSO则能溶解细胞中蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在一定波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量。大蒜素是葱科植物大蒜的地下鳞茎的有效成分。大蒜素有多种生物学活性，主要集中在对病原微生物、消化系统、心血管系统、肿瘤、代谢等方面的药理作用。如今已人工合成大蒜素，便于临床应用。目前大蒜素抗肝纤维化的机制还不清楚，从理论上推测可能为以下方面:(1)抗氧化作用:大蒜素是一种强抗氧化剂。脂质过氧化产生的自由基可以通过细胞毒作用直接损伤肝脏细胞，同时也可以充当信号分子，对钙离子信号转导、蛋白激酶与蛋白的磷酸化以及核转录因子均有一定作用，可以扩大炎症损伤 [2] ，促进HSC的激活。有文献报道 [3] 大蒜素具有抑制脂质过氧化作用，减少过氧化产物丙二醛的产生，降低谷丙转氨酶的含量，使超氧化物歧化酶活性及还原型谷胱苷肽含量升高。(2)抑制血小板聚集，减少血小板释放血小板源性生长因子(PDGF):PDGF是肝纤维化过程中的主要细胞因子，对HSC增殖起重要作用 [4] ，正常情况下经单核细胞合成后以颗粒形式贮存于血小板，一旦血小板聚集脱颗粒，PDGF释放出来激活HSC，使其大量增殖。大蒜素可以提高PGI 2 ，PGI 2 可以直接激活腺苷酸环化酶，使CAMP水平增加，CAMP增加可以抑制细胞由G1期向M期的过程，抑制HSC增殖。本实验10%血清培养中，发现大蒜素在0.5μg/ml剂量即已有抑制作用，呈浓度依赖性，2.0～10.0μg/ml同浓度组相比，大蒜素作用明显优于胸腺因子D，说明大蒜素对HSC增殖有明显抑制作用，有较好的抗肝纤维化作用。本实验主要在细胞水平证明大蒜素对HSC增殖有抑制作用，而且呈剂量依赖性关系。有待于以后在分子水平上阐明大蒜素发挥抑制HSC增殖作用的信号途径，以及各个途径之间的相互关系，进而从分子水平揭示大蒜素抗肝纤维化的机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Iredale JP.Cirrhosis:new research provides a basis for rational and tarˉgeted treatments.BMJ，2003，327(7407):143-147.
2 陈瑗，周玫.自由基医学基础与病理生理，北京:人民卫生出版社，2002，10.
3 韩娜，王芸.大蒜素对肝损伤保护作用的观察.中华医学杂志，1991，71(10):571.
4 刘学松，张锦生.血小板源性生长因子对大鼠肝星状细胞增殖和胶原及血小板源性生长因子基因表达的影响.中华病理学杂志，2000，29(1):27.
作者单位:161042齐齐哈尔医学院
515001汕头大学医学院病理教研室
黑龙江省鹤岗市人民医院病理科
佳木斯大学医学院病理教研室
(收稿日期:2003-11-05)
(编辑青 山), http://www.100md.com(梅双 陶立华 游淑清 陶富山)
关键词 肝纤维化 大蒜素 肝星形细胞 增殖
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)02-0102-02
Antifibrotic mechanism of garlic on hepatic stellate cell
Mei Shuang，TaoLihua，You Shuqing，et al.
, http://www.100md.com
Qiqiha’er Medical College，Heilongjiang161042.
【Abstract】 Objective To investigate the antifibrotic mechanism of garlicon hepatic stellate cell(HSC).Methods HSC were isolated and cultured with method of density gradient centrifugation after digested in pronase and collagenase.Proliferation of HSC was analysed withMTT492.HSCs were exposed to garlic which was diluted with10%serum DMEM in different concentrations for48hours.MTT was added in and assayed after4hours with microplate reader in OD492.Results The OD492value was negatively related to garlic concentration.Compared with the conˉtrol，garlic can inhibit HSC proliferation.The effect is more significant at the concentration of>2μg/ml.Conclusion Garlic can inhibit HSC proliferation and has antifibrotic potential in liver fibrosis in vitro.
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Key words liver fibrosis garlic hepatic stellate cell proliferation
肝纤维化是慢性肝病共同的病理特征，也是向肝硬化发展的重要中间环节，涉及到复杂的细胞及分子机制的动态过程，肝星形细胞(Hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化发生、发展的核心环节 [1] ，导致细胞外基质合成过多，降解减少，大量沉积在肝脏形成纤维化。目前国内外尚无确切的治疗肝纤维化的药物，本实验探讨大蒜素对大鼠HSC的影响，为防治肝纤维化寻求有效药物。
1 材料和方法
1.1 HSC的分离和培养 雄性Wistar大鼠，体重450～500g，购于佳木斯大学实验动物中心。链霉蛋白酶和胶原酶联合消化Nycordenz介质密度梯度离心分离大鼠肝星形细胞，取少量用于观察和计数，其余的按1×10 5 浓度接种在培养瓶，放于37℃5%CO 2 培养箱中，48h后更换培养液。
, http://www.100md.com
1.2 细胞鉴定 (1)荧光显微镜观察:制备细胞滴片，在328nm波长光下观察和计数具有蓝绿色荧光细胞数。荧光易淬灭。(2)细胞活率鉴定:活细胞数检查，取少量细胞悬液，按9:1体积加入0.4%台盼蓝混匀后倒置显微镜观察，并记录未着色的细胞数。活细胞数占细胞总数98%。(3)细胞纯度鉴定:免疫组化检测结蛋白(desmin)新分离细胞的desmin阳性率为94%，接种7天后几乎100%为desmin阳性细胞。
1.3 噻唑蓝(MTT)检测法 (1)血清浓度与MTT吸光度的 关系:细胞接种于96孔培养板上，分别加0、5%、10%、20%的DMEM培养液培养48h，各孔加入200μl浓度为0.5%的MTT，37℃孵育4h，弃去上清，加入200μl二甲基桠枫溶解MTT结晶，在酶标仪上检测波长492nm的吸光度(OD 492 )。(2)MTT法选择大蒜素有效实验浓度:按一系列浓度(0.5μg/ml1.0μg/ml2.0μg/ml10.0μg/ml)分别制备10%血清大蒜素(购于湖北五三制药厂)和胸腺因子D(购于福州金山制药厂)，并设不加药物的空白对照。将HSC按1×10 5 浓度接种于96孔培养板中，培养24h后换成药物稀释液培养48h后，各孔加入200μl浓度为0.5%的MTT，37℃孵育4h，弃去上清，加入200μl二甲基桠枫(DMSO)溶解MTT结晶，在酶标仪上检测波长492nm的吸光度(OD 492 )。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 所有数据用均数±标准差(X±s)表示，组间比较采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析和t检验。
2 结果
2.1 形态学观察 新分离的HSC胞浆中富含脂滴，接种24h后，细胞贴壁呈椭圆形，胞浆内脂滴减少，少量细胞开始伸展，48h后大部分细胞伸展生长，部分出现伪足，细胞呈星形。随着天数增加，胞质内脂滴逐渐减少，细胞由星形向梭形转变，第7天细胞形态类似成纤维细胞，13天呈局灶性生长。原代培养48h加入不同浓度药物溶液，与对照组比，细胞伸展缓慢，增殖细胞减少。
2.2 血清浓度与MTT吸光度的关系 5%～20%范围内，血清浓度与MTT吸光度值明显相关(P<0.01)，说明小牛血清在一定范围内刺激HSC的增殖(见表1)。表1 不同血清浓度对MTT法(略)
2.3 MTT法检测大蒜素对HSC增殖的影响 细胞增殖率随大蒜素浓度的增加不断下降，且与大蒜素呈剂量依赖性关系。与胸腺因子D比较，大蒜素浓度在0.5μg/ml对细胞增殖出现抑制作用，在2.0～10.0μg/ml范围，对细胞增殖有明显抑制作用。(见表2)表2 MTT法检测大蒜素对HSC增殖的影响 (略)
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3 讨论
肝纤维化是一个慢性渐进性过程，包括炎症、损伤和修复、重建三个阶段，持续发展最终导致肝硬化。HSC在肝纤维化中起核心作用。各种病因造成肝脏损伤引起细胞外基质(ECM)微环境改变，及肝脏内细胞和炎症细胞产生大量的生长因子、细胞因子及脂质过氧化产物通过旁分泌途径共同作用于HSC使其基因表达改变，导致静止的HSC形态及功能改变，表现为ECM合成及降解发生改变，生长因子、细胞因子及其受体表达，肌动蛋白等收缩结构出现使其转化为具有增殖、收缩及合成能力的肌成纤维细胞。活化后的HSC大量产生成分异常的ECM，替代正常基底膜胶原，且胶原降解减少，ECM合成与降解不平衡，异常沉积形成肝纤维化，并进一步加重HSC的激活，形成恶性循环，使纤维化不断加重。
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，其原理是 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，DMSO则能溶解细胞中蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在一定波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量。大蒜素是葱科植物大蒜的地下鳞茎的有效成分。大蒜素有多种生物学活性，主要集中在对病原微生物、消化系统、心血管系统、肿瘤、代谢等方面的药理作用。如今已人工合成大蒜素，便于临床应用。目前大蒜素抗肝纤维化的机制还不清楚，从理论上推测可能为以下方面:(1)抗氧化作用:大蒜素是一种强抗氧化剂。脂质过氧化产生的自由基可以通过细胞毒作用直接损伤肝脏细胞，同时也可以充当信号分子，对钙离子信号转导、蛋白激酶与蛋白的磷酸化以及核转录因子均有一定作用，可以扩大炎症损伤 [2] ，促进HSC的激活。有文献报道 [3] 大蒜素具有抑制脂质过氧化作用，减少过氧化产物丙二醛的产生，降低谷丙转氨酶的含量，使超氧化物歧化酶活性及还原型谷胱苷肽含量升高。(2)抑制血小板聚集，减少血小板释放血小板源性生长因子(PDGF):PDGF是肝纤维化过程中的主要细胞因子，对HSC增殖起重要作用 [4] ，正常情况下经单核细胞合成后以颗粒形式贮存于血小板，一旦血小板聚集脱颗粒，PDGF释放出来激活HSC，使其大量增殖。大蒜素可以提高PGI 2 ，PGI 2 可以直接激活腺苷酸环化酶，使CAMP水平增加，CAMP增加可以抑制细胞由G1期向M期的过程，抑制HSC增殖。本实验10%血清培养中，发现大蒜素在0.5μg/ml剂量即已有抑制作用，呈浓度依赖性，2.0～10.0μg/ml同浓度组相比，大蒜素作用明显优于胸腺因子D，说明大蒜素对HSC增殖有明显抑制作用，有较好的抗肝纤维化作用。本实验主要在细胞水平证明大蒜素对HSC增殖有抑制作用，而且呈剂量依赖性关系。有待于以后在分子水平上阐明大蒜素发挥抑制HSC增殖作用的信号途径，以及各个途径之间的相互关系，进而从分子水平揭示大蒜素抗肝纤维化的机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Iredale JP.Cirrhosis:new research provides a basis for rational and tarˉgeted treatments.BMJ，2003，327(7407):143-147.
2 陈瑗，周玫.自由基医学基础与病理生理，北京:人民卫生出版社，2002，10.
3 韩娜，王芸.大蒜素对肝损伤保护作用的观察.中华医学杂志，1991，71(10):571.
4 刘学松，张锦生.血小板源性生长因子对大鼠肝星状细胞增殖和胶原及血小板源性生长因子基因表达的影响.中华病理学杂志，2000，29(1):27.
作者单位:161042齐齐哈尔医学院
515001汕头大学医学院病理教研室
黑龙江省鹤岗市人民医院病理科
佳木斯大学医学院病理教研室
(收稿日期:2003-11-05)
(编辑青 山), http://www.100md.com(梅双 陶立华 游淑清 陶富山)