多囊卵巢综合征患者脂肪组织TNFR2mRNA的表达及其意义
【摘要】 目的 研究多囊卵巢综合征(PCOS)脂肪组织肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFR2)mRNA的表达，从分子水平探讨PCOS患者发生胰岛素抵抗(IR)的分子生物学机制。方法 采用RT-PCR技术结合内对照，半定量检测PCOS及其对照组脂肪组织TNFR2mRNA的表达。结果 TNFR2mRNA的表达量在PCOS肥胖组(0.90±0.12，P<0.001)和PCOS非肥胖组(0.62±0.14，P<0.05)均显著大于非肥胖对照组(0.50±0.15)，且以PCOS肥胖组升高更为明显(P<0.001)，PCOS肥胖组与肥胖对照组(0.88±0.14)相比则差异无显著性(P>0.05)。结论 PCOS两组脂肪组织TNFR2mRNA的表达均较非肥胖对照组增强，且以PCOS肥胖组升高更为明显，高水平的肿瘤坏死因子α(TNFα)可能通过上调TNFR2促进PCOS者TNFα系统活性增强。
关键词 多囊卵巢综合征 胰岛素抵抗 肿瘤坏死因子受体Ⅱ mRNA 肿瘤坏死因子α
, 百拇医药 【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)03-0193-04
A study on the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue in PCOS
Wang Zhuchen，Gu Xiongfei，Yang Dongzi，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen518035.
【Abstract】 Objective We study the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue from PCOS to get insight into the mechanism of IR in PCOS at the molecular biological level.Methods We survey the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue by semi-quantitative RT-PCR technique with inner-control.Results The expression of TNFR2mRNA inadipose from the obese PCOS group(0.90±0.12，P<0.001)and the nonobese PCOS group(0.62±0.14，P<0.05)is markedly higher than the nonobese control group(0.50±0.15)，and the obese PCOS group presents more increase(P<0.001).The difference between the obese PCOS group and the obese control group(0.88±0.14)is of no statistically significance(P>0.05).Conclusion These results suggest that the expression of TNˉFR2mRNA in adipose tissue from PCOS patient isabnormally excessive.The high TNFαcould up-regulate TNFR2which amplified the activity of TNFαin PCOS women.
, 百拇医药
Key words polycystic ovary syndrome adipose tissue insulin resistance tumor necrosis factor receptorⅡmRNA tumor necrosis factor alpha
多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)是以高雄激素血症和不排卵为特点的一组综合征。目前认为PCOS是以胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)为特征的内分泌代谢疾患，继发于IR的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用 [1] 。肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha，TNFα)是一个具有广泛生物活性的多肽，近年来大量的研究结果提示，TNFα还可能是IR的重要发病机制之一。在肥胖的人和鼠，增多的TNFα选择性地上调了肿瘤坏死因子受体Ⅱ(Tumor Necrosis Factor ReceptorⅡ，TNFR2)，且TNFα和TNFR2mRNA水平与IR呈正相关 [2] 。Fernandez-Real [3] 等报道肥胖患者血TNFR2水平较TNFα升高更为明显，并与ISI呈负相关，可作为肥胖患者TNFα相关IR的预测指标。为探讨TNFR2与PCOS患者IR的发病关系，我们对PCOS脂肪组织TNFR2mRNA的表达进行了研究，现报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 实验对象与组织来源 收集妇科病房2000年3月～2001年7月PCOS患者24例，临床症状及内分泌检查均符合PCOS诊断，术后病理检查证实为多囊卵巢。诊断标准是:(1)月经稀发或闭经和(或)多毛，肥胖;(2)不孕或持续基础体温(BBT)单相;(3)血清LH异常高，LH/FSH>2～3和/或高雄激素血症;(4)B型超声检查证实有卵巢多囊改变，表现为卵巢增大，包膜回声增强，可见单侧卵巢泡数≥10个，直径2～8mm，围绕卵巢边缘，有时散在分布于卵巢内 [4] 。24例PCOS患者据体重指数[体重/身高(kg/m 2 )]分为肥胖组(体重指数>24kg/m 2 )和非肥胖组(体重指数<24kg/m 2 )各12例;另随机收集妇科病房诊为卵巢囊肿或输卵管阻塞行开腹手术的肥胖和非肥胖妇女各12例。上述各组均无其它急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织适量，迅速置液氮中冻存。4组的临床资料见表1。由表1可知，PCOS两组分别与其体重相匹配的对照组相比，年龄和BMI均无统计学差异。
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1.2 主要试剂及仪器 TRIzoe Reagent(Gibco);Titan One Tube RT-PCR kit(Roche);PCR Marker(TakaRa DL2000DNA Marker);焦碳酸二乙酯(DEPC)(AMRESCO);DNA上样缓冲液(TakaRa);氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为新开瓶国产分析纯试剂:Tip头和EP管等均经DEPC处理，除去RNA酶污染;有关其它物品也经高温干烤灭活RNA酶。RNA样品缓冲液(250μl甲酰胺，83μl37%甲醛，50μl10×MOPS缓冲液，0.01%溴酚蓝);10×TBE贮存液(108g Tris碱，55g硼酸，40μl0.5μmol/L EDTA(pH0.8)加DEPC处理水至1L)。10×MOPS(0.2mol/L，3-CN-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)，50mmol/L乙酸钠，10mmol/L EDTA(pH7.6)。主要仪器有PCR扩增仪(Hema480);凝胶成像分析系统(UVP-GDS8000)，低温离心机(HARRIS);DNA/蛋白分析仪(Beckman DU530)。
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表1 各组的临床资料 (ˉx±s)
1.3 方法 [5]
1.3.1 脂肪组织总RNA的提取及鉴定 (1)取出液氮冻存的脂肪组织1g，加入5ml TRIzol，电动匀浆，12000g低温离心10min，吸出清亮的均一水相部分至另一离心管中，室温孵育5min;(2)加入1ml氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min，12000g低温离心15min;(3)小心吸取上层无色水相至另一离心管中，加入2.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g低温离心10min;(4)小心弃掉上清，加75%乙醇5ml，振匀，洗涤RNA沉淀，7500g低温离心5min，弃去上清，沉淀经空气干燥1min，溶于适量DEPC处理水中;(5)DNA/蛋白质分析仪确定每次样品中A260/280比率大于1.8，并测定所抽提总RNA的浓度，DEPC处理水将各样品总RNA配制成0.5μg/μl，分装后置-70℃保存备用。(6)RNA变性电泳:取17μl RNA样品加3μl RNA样品缓冲液，65℃变性15min，冰浴中冷却后上样，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶(1.5g琼脂糖，10ml10×MOPS，73ml DEPC处理水→微波炉化胶后冷却至60℃，加17ml37%甲醛，5μl EB→倒板制胶)70V电泳，电泳道1和泳道2的上样量分别为15μl和5μl缓冲液为1×MOPS，观察RNA的完整性。
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1.3.2 引物设计及建立内对照 TNFR2和β-actin引物均由上海生工合成。(1)TNFR2引物序列:上游引物5′(591)ACGTTCTCCAACACGACTTCATC(613)3′;下游引物5′(940)ATGATGACACAGTTCACCACTCC(918)3′;预扩增片断为349bp。(2)β-actin引物序列:上游引物5′(74)ATGGATˉGATGATATCGCCGCGCT(96)3′;下游引物5′(723)CACAGCTTCTCCTTAATGTCACG(701)3′;预扩增片断为649bp。引物设计均采用有关核酸序列分析软件计算机辅助设计。经对人类基因库扫描检查未发现其它同源序列。
1.3.3 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)(1)RT-PCR反应体系:混合物1，H 2 O4.5μl，dNTP4μl，DTT solution2.5μl，RNase inhibitor1μl，TNFR2upstream primer1.5μl，TNFR2downˉstream primer1.5μl，β-actin upstream primer1.5μl，β-actin downstream prime1.5μl，template RNA2μl;Total volume25μl。混合物2，H 2 O14μl，5×RT-PCR buffer10μl，Enzyme mix1μl;Total25μl。将混合物1和混合物2转入PCR管内(冰浴)，混匀，点动离心后加入30μl石蜡油。(2)RT-PCR条件 反转录条件:48℃，延续40min。扩增条件见表2。
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表2 扩增条件
1.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 琼脂糖凝胶的浓度为1.5%(将1.5g电泳级琼脂糖和100ml TBE溶液在微波炉中熔化，混匀，冷却至60℃，加入EB5μl)。精确取各样品RT-PCR产物10μl和上样缓冲液2μl混匀后上样，同时用PCR Marker作对照，70V电泳30min，紫外灯下观察有无目标条带，凝胶成像系统保留结果。于中山大学北校区分子研究中心进行图像分析，测定RT-PCR产物带的光密度和峰面积，每一产物带测三次，取均值，用TNFR2扩增产物带和β-actin扩增产物带的光密度与峰面积的乘积的比值表示该样本脂肪组织TNFR2mRNA的表达水平。
图1 脂肪组织总RNA甲醛变性凝胶电泳
图2 各组脂肪组织TNFR2RT-PCR产物的琼脂糖电泳
M:DNA Marker;1.PCOS肥胖组某样品;
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2.肥胖对照组某样品;3.PCOS非肥胖组某样品;
4.非肥胖对照组某样品
2 结果
2.1 脂肪组织总RNA甲醛变性凝胶电泳 由图1可见，我们抽提的总RNA在变性电泳中显示28S和18S两条带，且28S约为18S的1.5～2.5倍。
2.2 各组脂肪组织TNFR2RT-PCR产物的琼脂糖电泳和半定量分析 由图2可见，各组在约350bp和650bp处均有目标条带出现;图像分析结果表明，PCOS肥胖组(P<0.001)和PCOS非肥胖组(P<0.05)脂肪组织TNFR2mRNA表达量均显著大于非肥胖对照组，且以PCOS肥胖组升高更为明显(P<0.001)，肥胖对照组TNFR2mRNA表达水平也较非肥胖对照组明显升高(P<0.001)，但与PCOS肥胖组相比，差异无显著性(P>0.05)，见表3。
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表3 各组脂肪组织TNFR2表达的半定量分析
注: ˇ P<0.05与非肥胖对照组比较， ˇˇ P<0.001与非肥胖对照组比较， △ P<0.001与PCOS非肥胖组比较
3 讨论
目前检测mRNA专一产物的定量检测方法仍有争议。因RNA的纯度，定量、逆转录和PCR反应的扩增效率、加样误差及不同反应条件等一系列因素的影响，很难对RT-PCR产物做绝对定量。检测mRNA的方法有斑点杂交、Northern Blotting、RNA酶保护法及RT-PCR法，其中斑点杂交特异性差，Northern Blotting的操作复杂，RNA酶保护法费用高，和这些方法比较，RT-PCR法是目前最简便、最灵敏的检测微量mRNA的方法。而近年发展起来的竞争性RT-PCR技术，更是可以对微量的mRNA进行半定量研究。一个理想的定量PCR试验应该设立内参照，并且参照基因与待研究基因在同一反应管内进行，以排除反应过程中各干扰因素对扩增效率的影响。我们采用一步法RT-PCR结合内参照的方法半定量检测脂肪组织TNFR2mRNA表达水平，符合定量PCR试验的原则且客观实用。我们的试验结果显示，649bp的β-actin扩增产物带和349bp的TNFR2扩增产物带分离较好，条带清晰，表明TNFR2mRNA和β-actin mRNA均得到特异的反转录和特异性扩增，本实验有关TNFR2mRNA的半定量检测结果是准确可信的。
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目前PCOS发生IR的病因和机制尚未完全清楚，近年来TNFα的作用备受关注。大量研究证实TNFα与IR的发生有着密切的关系。例如肥胖者机体过度表达TNFα并与其IR程度呈正相关[6] ;TNFα还可阻断体外培养的细胞及动物体内的胰岛素作用，发生IR。TNFα的信号传导是通过TNFR1(P60)和TNFR2(P80)两个细胞表面受体完成的，这两种受体存在于高等哺乳动物大多数的细胞表面。TNFR1可以介导了TNFα已知的几乎所有作用，包括细胞凋亡、分化和增生等;而TNFR2主要与细胞代谢信号的传导有关。TNFα与细胞表面的相应受体结合后，可能通过作用于胰岛素生物效应中几个重要位点而介导了IR:(1)对胰岛素信号通路的影响:TNFα介导IRS-1的丝氨酸磷酸化并使之 成为胰岛素受体酪氨酸激酶(IRK)的抑制剂，从而抑制了IRS-1的酪氨酸磷酸化;(2)TNFα对脂肪细胞GluT4有下调作用;(3)TNFα可促进脂肪细胞的脂肪分解及游离脂肪酸(FFA)的释放，后者参与介导了肝及外周组织的IR;(4)TNFα可引起循环升糖激素的升高，这些激素可能分别或共同参与了TNFα介导的IR;(5)TNFα还可通过调节其它细胞因子如Leptin等的水平而介导IR [7，8] 。
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PCOS者常伴肥胖而PCOS非肥胖者也有不同程度的IR。Gonzalez [9] 和Sayin [10]等发现体胖和正常体重的PCOS者血清TNFα水平均明显升高;但体胖者升高更为显著且与空腹胰岛素水平呈正相关。而对于正常体重的PCOS者，血清TNFα水平与胰岛素抵抗程度无明显相关性，这可能与其检测胰岛素抵抗的指标不够敏感有关。Dunaif [11] 和Li [12] 等对PCOS者成纤维细胞和骨骼肌细胞培养并研究了胰岛素受体及胰岛素受体后的信号传导，发现其胰岛素受体亲合力无明显异常，但约50%PCOS患者皮肤的成纤维细胞上胰岛素受体的基础磷酸化作用增加，引起胰岛素介导的受体进一步磷酸化作用减弱。对磷酰胺酸分析发现胰岛素受体上丝氨酸残基的已磷酸化数量增多，而胰岛素介导的酪氨酸残基的可磷酸化数量减少。实验证实，胰岛素受体丝氨酸磷酸化数量增加是细胞内胰岛素信号传递的终止信息。有人对PCOS患者胰岛素受体及胰岛素受体β亚单位酪氨酸激酶区进行直接基因组DNA序列分析，结果未发现PCOS者存在胰岛素受体基因突变 [13] 。此外免疫沉淀反应和混合试验也提示胰岛素受体系统外的因子，如膜糖蛋白PC-1和TNFα等，可能参与PCOS者胰岛素受体后的信号传导障碍 [11] 。此外，近年来的研究发现，胰岛素增敏剂Troglitazone的应用可降低TNFα对脂肪细胞Ins信号通路的抑制作用，解除TNFα对GluT4的下调作用 [14] ，有效恢复PCOS者的排卵功能 [15] ，提示TNFα可能与PCOS者IR有关。
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文献报道，在肥胖的人和鼠，增多的TNFα选择性地上调了TNFR2，TNFα和TNFR2mRNA水平与IR呈正相关，提示TNFR2参与了肥胖相关的IR [2] 。我们的研究也首次证实PCOS肥胖组和肥胖对照组脂肪组织TNFR2mRNA表达水平均明显高于非肥胖对照组，但两组间的差异无显著性，提示PCOS肥胖者体内存在高水平的TNFα，并与其肥胖有关。此外，PCOS非肥胖患者脂肪组织TNFR2mRNA水平也较非肥胖对照组增高，表明还存在非肥胖因素可能参与了PCOS患者体内的高TNFα水平。文献报道TNFα的来源具有多样性，除脂肪细胞和肌肉能分泌TNFα外，单核细胞和巨噬细胞也是机体TNFα的主要来源之一，作用广泛。近年对PCOS患者血浆IGF-I水平的系列研究发现，PCOS非肥胖组血浆IGF-I水平较PCOS肥胖组和非肥胖对照组均衡定增高 [16] ;IGF-I可直接刺激单核巨噬细胞分泌TNFα并使STNFR2反馈性增加 [17] 。这是否与PCOS非肥胖者STNˉFR2水平升高有关尚需进一步的研究证实。
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参考文献
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基金项目:广东省卫生厅科研基金资助(2001189)
作者单位:518035广东深圳市第二人民医院妇产科
广州中山大学北校区生物化学教研室
510120广州中山大学孙逸仙纪念医院妇产科
(收稿日期:2003-12-28)
(编辑曲 全), 百拇医药(王竹晨)
关键词 多囊卵巢综合征 胰岛素抵抗 肿瘤坏死因子受体Ⅱ mRNA 肿瘤坏死因子α
, 百拇医药 【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)03-0193-04
A study on the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue in PCOS
Wang Zhuchen，Gu Xiongfei，Yang Dongzi，et al.
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【Abstract】 Objective We study the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue from PCOS to get insight into the mechanism of IR in PCOS at the molecular biological level.Methods We survey the expression of TNFR2mRNA in adipose tissue by semi-quantitative RT-PCR technique with inner-control.Results The expression of TNFR2mRNA inadipose from the obese PCOS group(0.90±0.12，P<0.001)and the nonobese PCOS group(0.62±0.14，P<0.05)is markedly higher than the nonobese control group(0.50±0.15)，and the obese PCOS group presents more increase(P<0.001).The difference between the obese PCOS group and the obese control group(0.88±0.14)is of no statistically significance(P>0.05).Conclusion These results suggest that the expression of TNˉFR2mRNA in adipose tissue from PCOS patient isabnormally excessive.The high TNFαcould up-regulate TNFR2which amplified the activity of TNFαin PCOS women.
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Key words polycystic ovary syndrome adipose tissue insulin resistance tumor necrosis factor receptorⅡmRNA tumor necrosis factor alpha
多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)是以高雄激素血症和不排卵为特点的一组综合征。目前认为PCOS是以胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)为特征的内分泌代谢疾患，继发于IR的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用 [1] 。肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha，TNFα)是一个具有广泛生物活性的多肽，近年来大量的研究结果提示，TNFα还可能是IR的重要发病机制之一。在肥胖的人和鼠，增多的TNFα选择性地上调了肿瘤坏死因子受体Ⅱ(Tumor Necrosis Factor ReceptorⅡ，TNFR2)，且TNFα和TNFR2mRNA水平与IR呈正相关 [2] 。Fernandez-Real [3] 等报道肥胖患者血TNFR2水平较TNFα升高更为明显，并与ISI呈负相关，可作为肥胖患者TNFα相关IR的预测指标。为探讨TNFR2与PCOS患者IR的发病关系，我们对PCOS脂肪组织TNFR2mRNA的表达进行了研究，现报告如下。
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1 资料与方法
1.1 实验对象与组织来源 收集妇科病房2000年3月～2001年7月PCOS患者24例，临床症状及内分泌检查均符合PCOS诊断，术后病理检查证实为多囊卵巢。诊断标准是:(1)月经稀发或闭经和(或)多毛，肥胖;(2)不孕或持续基础体温(BBT)单相;(3)血清LH异常高，LH/FSH>2～3和/或高雄激素血症;(4)B型超声检查证实有卵巢多囊改变，表现为卵巢增大，包膜回声增强，可见单侧卵巢泡数≥10个，直径2～8mm，围绕卵巢边缘，有时散在分布于卵巢内 [4] 。24例PCOS患者据体重指数[体重/身高(kg/m 2 )]分为肥胖组(体重指数>24kg/m 2 )和非肥胖组(体重指数<24kg/m 2 )各12例;另随机收集妇科病房诊为卵巢囊肿或输卵管阻塞行开腹手术的肥胖和非肥胖妇女各12例。上述各组均无其它急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织适量，迅速置液氮中冻存。4组的临床资料见表1。由表1可知，PCOS两组分别与其体重相匹配的对照组相比，年龄和BMI均无统计学差异。
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1.2 主要试剂及仪器 TRIzoe Reagent(Gibco);Titan One Tube RT-PCR kit(Roche);PCR Marker(TakaRa DL2000DNA Marker);焦碳酸二乙酯(DEPC)(AMRESCO);DNA上样缓冲液(TakaRa);氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为新开瓶国产分析纯试剂:Tip头和EP管等均经DEPC处理，除去RNA酶污染;有关其它物品也经高温干烤灭活RNA酶。RNA样品缓冲液(250μl甲酰胺，83μl37%甲醛，50μl10×MOPS缓冲液，0.01%溴酚蓝);10×TBE贮存液(108g Tris碱，55g硼酸，40μl0.5μmol/L EDTA(pH0.8)加DEPC处理水至1L)。10×MOPS(0.2mol/L，3-CN-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)，50mmol/L乙酸钠，10mmol/L EDTA(pH7.6)。主要仪器有PCR扩增仪(Hema480);凝胶成像分析系统(UVP-GDS8000)，低温离心机(HARRIS);DNA/蛋白分析仪(Beckman DU530)。
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表1 各组的临床资料 (ˉx±s)
1.3 方法 [5]
1.3.1 脂肪组织总RNA的提取及鉴定 (1)取出液氮冻存的脂肪组织1g，加入5ml TRIzol，电动匀浆，12000g低温离心10min，吸出清亮的均一水相部分至另一离心管中，室温孵育5min;(2)加入1ml氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min，12000g低温离心15min;(3)小心吸取上层无色水相至另一离心管中，加入2.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g低温离心10min;(4)小心弃掉上清，加75%乙醇5ml，振匀，洗涤RNA沉淀，7500g低温离心5min，弃去上清，沉淀经空气干燥1min，溶于适量DEPC处理水中;(5)DNA/蛋白质分析仪确定每次样品中A260/280比率大于1.8，并测定所抽提总RNA的浓度，DEPC处理水将各样品总RNA配制成0.5μg/μl，分装后置-70℃保存备用。(6)RNA变性电泳:取17μl RNA样品加3μl RNA样品缓冲液，65℃变性15min，冰浴中冷却后上样，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶(1.5g琼脂糖，10ml10×MOPS，73ml DEPC处理水→微波炉化胶后冷却至60℃，加17ml37%甲醛，5μl EB→倒板制胶)70V电泳，电泳道1和泳道2的上样量分别为15μl和5μl缓冲液为1×MOPS，观察RNA的完整性。
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1.3.2 引物设计及建立内对照 TNFR2和β-actin引物均由上海生工合成。(1)TNFR2引物序列:上游引物5′(591)ACGTTCTCCAACACGACTTCATC(613)3′;下游引物5′(940)ATGATGACACAGTTCACCACTCC(918)3′;预扩增片断为349bp。(2)β-actin引物序列:上游引物5′(74)ATGGATˉGATGATATCGCCGCGCT(96)3′;下游引物5′(723)CACAGCTTCTCCTTAATGTCACG(701)3′;预扩增片断为649bp。引物设计均采用有关核酸序列分析软件计算机辅助设计。经对人类基因库扫描检查未发现其它同源序列。
1.3.3 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)(1)RT-PCR反应体系:混合物1，H 2 O4.5μl，dNTP4μl，DTT solution2.5μl，RNase inhibitor1μl，TNFR2upstream primer1.5μl，TNFR2downˉstream primer1.5μl，β-actin upstream primer1.5μl，β-actin downstream prime1.5μl，template RNA2μl;Total volume25μl。混合物2，H 2 O14μl，5×RT-PCR buffer10μl，Enzyme mix1μl;Total25μl。将混合物1和混合物2转入PCR管内(冰浴)，混匀，点动离心后加入30μl石蜡油。(2)RT-PCR条件 反转录条件:48℃，延续40min。扩增条件见表2。
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表2 扩增条件
1.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 琼脂糖凝胶的浓度为1.5%(将1.5g电泳级琼脂糖和100ml TBE溶液在微波炉中熔化，混匀，冷却至60℃，加入EB5μl)。精确取各样品RT-PCR产物10μl和上样缓冲液2μl混匀后上样，同时用PCR Marker作对照，70V电泳30min，紫外灯下观察有无目标条带，凝胶成像系统保留结果。于中山大学北校区分子研究中心进行图像分析，测定RT-PCR产物带的光密度和峰面积，每一产物带测三次，取均值，用TNFR2扩增产物带和β-actin扩增产物带的光密度与峰面积的乘积的比值表示该样本脂肪组织TNFR2mRNA的表达水平。
图1 脂肪组织总RNA甲醛变性凝胶电泳
图2 各组脂肪组织TNFR2RT-PCR产物的琼脂糖电泳
M:DNA Marker;1.PCOS肥胖组某样品;
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2.肥胖对照组某样品;3.PCOS非肥胖组某样品;
4.非肥胖对照组某样品
2 结果
2.1 脂肪组织总RNA甲醛变性凝胶电泳 由图1可见，我们抽提的总RNA在变性电泳中显示28S和18S两条带，且28S约为18S的1.5～2.5倍。
2.2 各组脂肪组织TNFR2RT-PCR产物的琼脂糖电泳和半定量分析 由图2可见，各组在约350bp和650bp处均有目标条带出现;图像分析结果表明，PCOS肥胖组(P<0.001)和PCOS非肥胖组(P<0.05)脂肪组织TNFR2mRNA表达量均显著大于非肥胖对照组，且以PCOS肥胖组升高更为明显(P<0.001)，肥胖对照组TNFR2mRNA表达水平也较非肥胖对照组明显升高(P<0.001)，但与PCOS肥胖组相比，差异无显著性(P>0.05)，见表3。
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表3 各组脂肪组织TNFR2表达的半定量分析
注: ˇ P<0.05与非肥胖对照组比较， ˇˇ P<0.001与非肥胖对照组比较， △ P<0.001与PCOS非肥胖组比较
3 讨论
目前检测mRNA专一产物的定量检测方法仍有争议。因RNA的纯度，定量、逆转录和PCR反应的扩增效率、加样误差及不同反应条件等一系列因素的影响，很难对RT-PCR产物做绝对定量。检测mRNA的方法有斑点杂交、Northern Blotting、RNA酶保护法及RT-PCR法，其中斑点杂交特异性差，Northern Blotting的操作复杂，RNA酶保护法费用高，和这些方法比较，RT-PCR法是目前最简便、最灵敏的检测微量mRNA的方法。而近年发展起来的竞争性RT-PCR技术，更是可以对微量的mRNA进行半定量研究。一个理想的定量PCR试验应该设立内参照，并且参照基因与待研究基因在同一反应管内进行，以排除反应过程中各干扰因素对扩增效率的影响。我们采用一步法RT-PCR结合内参照的方法半定量检测脂肪组织TNFR2mRNA表达水平，符合定量PCR试验的原则且客观实用。我们的试验结果显示，649bp的β-actin扩增产物带和349bp的TNFR2扩增产物带分离较好，条带清晰，表明TNFR2mRNA和β-actin mRNA均得到特异的反转录和特异性扩增，本实验有关TNFR2mRNA的半定量检测结果是准确可信的。
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目前PCOS发生IR的病因和机制尚未完全清楚，近年来TNFα的作用备受关注。大量研究证实TNFα与IR的发生有着密切的关系。例如肥胖者机体过度表达TNFα并与其IR程度呈正相关[6] ;TNFα还可阻断体外培养的细胞及动物体内的胰岛素作用，发生IR。TNFα的信号传导是通过TNFR1(P60)和TNFR2(P80)两个细胞表面受体完成的，这两种受体存在于高等哺乳动物大多数的细胞表面。TNFR1可以介导了TNFα已知的几乎所有作用，包括细胞凋亡、分化和增生等;而TNFR2主要与细胞代谢信号的传导有关。TNFα与细胞表面的相应受体结合后，可能通过作用于胰岛素生物效应中几个重要位点而介导了IR:(1)对胰岛素信号通路的影响:TNFα介导IRS-1的丝氨酸磷酸化并使之 成为胰岛素受体酪氨酸激酶(IRK)的抑制剂，从而抑制了IRS-1的酪氨酸磷酸化;(2)TNFα对脂肪细胞GluT4有下调作用;(3)TNFα可促进脂肪细胞的脂肪分解及游离脂肪酸(FFA)的释放，后者参与介导了肝及外周组织的IR;(4)TNFα可引起循环升糖激素的升高，这些激素可能分别或共同参与了TNFα介导的IR;(5)TNFα还可通过调节其它细胞因子如Leptin等的水平而介导IR [7，8] 。
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PCOS者常伴肥胖而PCOS非肥胖者也有不同程度的IR。Gonzalez [9] 和Sayin [10]等发现体胖和正常体重的PCOS者血清TNFα水平均明显升高;但体胖者升高更为显著且与空腹胰岛素水平呈正相关。而对于正常体重的PCOS者，血清TNFα水平与胰岛素抵抗程度无明显相关性，这可能与其检测胰岛素抵抗的指标不够敏感有关。Dunaif [11] 和Li [12] 等对PCOS者成纤维细胞和骨骼肌细胞培养并研究了胰岛素受体及胰岛素受体后的信号传导，发现其胰岛素受体亲合力无明显异常，但约50%PCOS患者皮肤的成纤维细胞上胰岛素受体的基础磷酸化作用增加，引起胰岛素介导的受体进一步磷酸化作用减弱。对磷酰胺酸分析发现胰岛素受体上丝氨酸残基的已磷酸化数量增多，而胰岛素介导的酪氨酸残基的可磷酸化数量减少。实验证实，胰岛素受体丝氨酸磷酸化数量增加是细胞内胰岛素信号传递的终止信息。有人对PCOS患者胰岛素受体及胰岛素受体β亚单位酪氨酸激酶区进行直接基因组DNA序列分析，结果未发现PCOS者存在胰岛素受体基因突变 [13] 。此外免疫沉淀反应和混合试验也提示胰岛素受体系统外的因子，如膜糖蛋白PC-1和TNFα等，可能参与PCOS者胰岛素受体后的信号传导障碍 [11] 。此外，近年来的研究发现，胰岛素增敏剂Troglitazone的应用可降低TNFα对脂肪细胞Ins信号通路的抑制作用，解除TNFα对GluT4的下调作用 [14] ，有效恢复PCOS者的排卵功能 [15] ，提示TNFα可能与PCOS者IR有关。
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文献报道，在肥胖的人和鼠，增多的TNFα选择性地上调了TNFR2，TNFα和TNFR2mRNA水平与IR呈正相关，提示TNFR2参与了肥胖相关的IR [2] 。我们的研究也首次证实PCOS肥胖组和肥胖对照组脂肪组织TNFR2mRNA表达水平均明显高于非肥胖对照组，但两组间的差异无显著性，提示PCOS肥胖者体内存在高水平的TNFα，并与其肥胖有关。此外，PCOS非肥胖患者脂肪组织TNFR2mRNA水平也较非肥胖对照组增高，表明还存在非肥胖因素可能参与了PCOS患者体内的高TNFα水平。文献报道TNFα的来源具有多样性，除脂肪细胞和肌肉能分泌TNFα外，单核细胞和巨噬细胞也是机体TNFα的主要来源之一，作用广泛。近年对PCOS患者血浆IGF-I水平的系列研究发现，PCOS非肥胖组血浆IGF-I水平较PCOS肥胖组和非肥胖对照组均衡定增高 [16] ;IGF-I可直接刺激单核巨噬细胞分泌TNFα并使STNFR2反馈性增加 [17] 。这是否与PCOS非肥胖者STNˉFR2水平升高有关尚需进一步的研究证实。
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基金项目:广东省卫生厅科研基金资助(2001189)
作者单位:518035广东深圳市第二人民医院妇产科
广州中山大学北校区生物化学教研室
510120广州中山大学孙逸仙纪念医院妇产科
(收稿日期:2003-12-28)
(编辑曲 全), 百拇医药(王竹晨)