RT-PCR在SARS动物模型鉴定及疫苗评价中的应用
【摘要】 目的 建立RT-PCR方法，用于鉴定SARS感染性动物模型是否成功建立，并对SARS灭活疫苗的效果进行评估。方法 SARS感染动物模型组选用3周岁的健康SPF级恒河猴，经鼻吸入Sino1SARS毒株。病毒攻击后的第7天将动物处死。评价疫苗组选用3周岁的健康SPF级恒河猴，选择Sino3SARS灭活疫苗(20030904批号)肌肉注射，免疫2次。免疫后经鼻滴入Sino1SARS毒株，病毒攻击后的第7天将动物处死。自病毒攻击后的第1天起每日连续采集动物咽拭子标本，病毒攻击后的第3天、第5天、第7天采集血浆标本 [1] 。将标本进行病毒分离及RT-PCR检测。结果 模型组动物及注射对照疫苗组动物病毒攻击后第1～7天咽拭子标本经RT-PCR检测均为阳性。注射疫苗组动物仅在病毒攻击后第1天咽拭子标本RT-PCR检测呈阳性。模型组动物血浆标本经RT-PCR检测呈现阳性，疫苗组动物血浆标本经RT-PCR检测均为阴性。病毒分离结果显示在模型动物及注射对照疫苗组动物咽拭子标本中分离到病毒，未在疫苗组动物的咽拭子标本分离到病毒。血浆标本中均未分离到病毒。结论 与病毒分离相比，RT-PCR方法具有快速、简便、特异性强等优点，便于推广使用，可作为模型鉴定、疫苗评估及药物筛选的重要手段。
, 百拇医药
关键词 SARS实验感染动物模型 RT-PCR nesting PCR
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2753-04
Application of RT-PCR on identifying and evaluating
of SARS animal model and vaccine
Zhang Yangqing，Tu Xinming，Zhu Hua，et al.
Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100021.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective Establish the RT-PCR method for verifying the SARS infection animal model and eˉvaluating the effect of vaccine.Methods We choose3years old SPF macaques，and inoculate the SARS corona virus by dropping in nose，those infected animals as SARS model and will be used to test SARS candidate vaccine.Colˉlect throat swab specimen and the plasma specimen at different time after monkeys were infected.Results After challenged，by the method of RT-PCR the throat swab specimens from vaccine immunize animal are positive only at the firstday，the plasma specimens from the monkeys of SARS infection animal model are positive，others are negative.We can only isolate virus from the throat swab specimens of SARS infection animal model.Conclusion This method is fast，efficient and special.We can use it in a large scope.It can be used to identify the SARS infection animal modˉel and evaluate the efficacy of vaccine.
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Key words SARS corona virus infected animal model RT-PCR nesting Real-time PCR
SARS又称急性重症呼吸系统综合征，临床表现为发热、咳嗽、呼吸窘迫。该疾病传染性强，病死率高，大量病人死于呼吸衰竭，且治愈后出现肺纤维化及股骨头坏死并发症，对人民生命健康造成巨大威胁。因此研究发病机制，降低发病率，减轻疾病症状成为迫在眉睫的事。而SARS疫苗的研制是解决问题最为直接有效的方法。SARS感染性动物模型的建立是进行疾病发生机制的研究、疫苗的评价及药物的筛选的关键环节。如何确认SARS感染性动物模型的成功建立并鉴定模型及评价相应的疫苗是否有效是当前面临的重要问题。目前WHO对SARS患者的标本进行鉴定的方法有病毒分离，ELISA及RT-PCR等。病毒分离耗时长且敏感性较低;ELISA可检测SARS抗原及抗体，但目前缺乏检测SARS病毒的单克隆抗体，无法特异性检测 SARS抗原，而抗体的出现较晚，无法及时判断病原体的入侵;其中RT-PCR的检测方法特异性强，敏感度高且耗时短，为模型的鉴定及疫苗的评价提供了最为直接快速有效的手段 [2] 。RT-PCR分为荧光PCR [3] 及套式PCR等方法 [4] 。均可在极少的样品中检测到其中的微量病毒。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 3岁龄健康恒河猴，购自医科院医学生物学研究所，遗传背景清楚，检查SARS病毒抗体为阴性，并按实验用猴国家标准微生物SPF级别检测排除病原体。共8只，雌雄各半。模型组3只，注射疫苗组4只，注射对照疫苗组1只。
1.2 病毒株 SARS病毒(SARS病毒Sino1株，由北京科兴生物制品有限公司提供)。
1.3 SARS灭活疫苗 北京科兴生物制品有限公司提供。批号:20030904，含量:10μg/ml。制备方法:用SARS病毒(SARS病毒Sino3株，由北京协和医院非典型肺炎患者鼻拭子分离，于Vero细胞传代至第11代)接种Vero细胞[美国ATCC(American Tissue Culture Collection)提供]。培养后，用β-丙内酯灭活，纯化制成。保存条件:4℃，溶剂:PBS。
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1.4 对照疫苗 北京科兴生物制品有限公司提供。批号:20030909，含量:10μg/ml。制备方法:按照疫苗生产工艺制备的Vero细胞对照疫苗。保存条件:4℃。
1.5 试剂及仪器 MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolaˉtion Kit(购自Roche);One Step RT-PCR Kit(购自TaKaRa);SARS-CoV核酸扩增荧光检测试剂盒(上海复兴实业医学科技发展有限公司惠赠);MagNA Pure LC系统(Roche);PCR仪(eppendorf5330);RocheReal-time PCR仪(Lightcycler)。
1.6 标本
1.6.1 咽拭子 每日清晨进食前用灭菌棉签伸入恒河猴咽喉部蘸取分泌物，浸入1ml DMES中放置-80℃冰箱保存备用。
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1.6.2 血浆 取抗凝静脉血1ml分离出血浆放置-80℃冰箱保存备用。
1.7实验设计 (1)将试验用猴随机分组，每组3～4只动物，模型组不采取任何防护措施，另两组分别注射疫苗，分为SARS灭活疫苗及对照疫苗，然后将动物同时用病毒进行攻击。分别在模型组及疫苗组恒河猴攻击前及病毒攻击后第1～7天采取咽拭子标本，病毒攻击后第2、第5、第7天采血浆标本。以攻击的毒株作为阳性对照，以未被病毒攻击的空白猴咽拭子及血浆作为阴性对照，并设立未加样品的空白对照，进行nesting-PCR，同时将标本进行病毒分离。(2)将标本提取的核酸同时进行Real-time PCR及nesting-PCR比较其灵敏度。(3)与病毒分离相对比，比较其灵敏度。将原始毒株进行病毒滴定，将病毒分离可检测到的病毒浓度向下稀释，稀释至10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 、10 -6 进行RT-PCR，比较两种方法的灵敏度。
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1.8 实验方法
1.8.1 nesting PCR实验方法 取200μl标本以MagNA Pure LC系统(Roche)自动提取标本中病毒的总核酸。取5μl作为模板进行RT-PCR，反应体系如下10×one step RT-PCR buffer5μl，MgCl 2 (25mM)10μl，dNTP Mixture(10mM)5μl，Rnase Inhibitor(40U/μl)1μl，AMV RTase XL(5U/μl)1μl，AMV-Optiˉmized Taq(5U/μl)1μl，1st Primer Pair(20uM)1μl，样品RNA1μl，加RNAse Free dH 2 O至50μl。按以下条件进行RT-PCR反应:50℃15min，94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles。引物序列为1st sense:5′-ATGAATTACCAAGTˉCAATGGTTAC-3′antisense，5′-CATAACCAGTCGˉGTACAGCTAC-3′，2nd sense:5′GAAGCTATTCGTCACGTT-3′antisense，5′CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG-3′，反应结束后，取RT-PCR产物作为下一轮PCR反应的模板，进行nesting PCR，反应条件如下:RT-PCR反应液1μl，10×one step RT-PCR buffer5μl，MgCl 2 (25mM)5μl，dNTP Mixture(10mM)2μl，AMV-Optimized Taq(5U/μl)1μl，2nd Primer Pair(20uM)1μl，加dH2 O至50μl。按以下条件进行PCR反应。94℃30s，55℃30s，72℃30s，30cycles。反应结束后，取10μl PCR反应产物在2%琼脂糖上进行凝胶电泳，出现110bp目的条带判定为SARS PCR阳性，未出现110bp目的条带判定为SARS PCR阴性。当空白对照、环境对照、阴性对照均为阴性，阳性对 照为阳性时，该实验成立并可判定结果。
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1.8.2 Real-time PCR实验方法 取200μl标本以MagNA Pure LC系统(Roche)自动提取标本中病毒的总核酸。取待测样品的核酸液10μl，加入18μl SARS RT-PCR反应液，混合酶2μl。上游引物:TTATC ACCCG CGAAG AAGCT，下游引物:CTGTA GAAAA TCCTA GCTGG AG，荧光探针:FAM-TCGTG CGTGG ATTGG CTTTG ATGT-TAMRA按以下条件进行RT-PCR反应:37℃30min，95℃2min，95℃5s，55℃10s，72℃20s，50个循环。结果判定:出现阳性曲线判定为SARS病毒核酸检测阳性，未出现阳性曲线判定为SARS病毒核酸RT-PCR检测阴性。
1.8.3 SARS病毒分离 接种病毒、观察:将对照疫苗接种于24孔板上。待对照疫苗长成单层，吸去生长液。每孔加咽拭子液(经0.2μm过滤器除菌过滤)400μl或血浆150μl或组织匀浆100μl后，37℃孵箱吸附1h。吸出液体后用PBS(加2%双抗)洗两遍，后加DMEM液补至1ml，37℃孵箱培养5～7天，观察细胞病变。将第一代上清接种于对照疫苗传代，盲传三代，进行病毒鉴定。
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2 结果
2.1 RT-PCR检测 显示注射SARS灭活疫苗及注射对照疫苗组恒河猴在注射后第3天采集的咽拭子标本经RT-PCR检测均为阴性。攻毒后模型组恒河猴及对照疫苗组恒河猴每天采集的咽拭子经RT-PCR检测均为阳性;疫苗组恒河猴仅在攻毒后前三天采集的咽拭子标本经RT-PCR检测为阳性，以后均为阴性。模型组恒河猴攻毒后第7天的血浆标本经RT-PCR检测为阳性，疫苗组各天血浆标本经检测均为阴性。见表1，图1。
2.2 病毒分离结果 显示模型组动物攻毒后的第2、第5、第7天的咽拭子均分离出病毒，注射对照疫苗的动物在攻毒后的第2天的咽拭子分离出病毒，注射疫苗组动物咽拭子未分离到病毒。所有动物的血浆标本均未分离出病毒。见表2。
2.3 将一批标本同时进行病毒分离与nesting PCR 其结果见表3。
2.4 选取相同的100份样本，以MagNA Pure LC系统(Roche)提取总核酸，分别进行nesting PCR及Real time PCR，比较其PCR结果 结果Nesting PCR比Real-time PCR检测SARS病毒核酸方法灵敏。见表4。
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表1疫苗组模型组恒河猴攻毒后RT-PCR检测结果
表2 疫苗组模型组恒河猴攻毒后病毒分离结果
表3 Nesting PCR与细胞培养法检测SARS病毒结果
表2 Nesting PCR与Real-time PCR 检测SARS病毒结果
2.5 提取RNA并进行RT-PCR 通过病毒分离的方法可检测浓度达10 -7 ，RT-PCR的检测灵敏度达10 -12 。见图 2。
图27为10 -8 病毒稀释液，8为10 -9 病毒稀释液，9为10 -10 病毒稀释液，10为10 -11 病毒稀释液，11为10 -12 病毒稀释液，12为10 -13 病毒稀释液，13为病毒原液。14为阴性对照，15为空白对照。余为阴性标本。
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3 讨论
感染性动物模型是指动物能模拟病毒在人类体内的活动情况，通过病毒学检测及免疫学检测说明病毒在体内的复制情况。为我们研究发病机制，评价疫苗，筛选药物提供了良好的平台。我们通过病毒分离与RT-PCR来说明病毒在体内的复制。与用Trizol提取总RNA相比，用罗氏的核酸分离纯分系统(磁珠法)提取的核酸纯度高且产率大，但是由于该仪器及其耗材、试剂盒价格高昂故难以推广使用。RT-PCR结果与病毒分离结果相大致相同，与病毒分离相比RT-PCR有敏感、快速、特异性强等特点。故在模型鉴定及疫苗评价中发挥重要作用。该实验可在实验室中推广使用。nesting-PCR与Real-time PCR相比，敏感度高，可能与上海复兴公司的SARS-CoV核酸扩增荧光检测试剂盒灵敏度低有关。由于进口Real-time PCR试剂盒价格高昂较难普及，因此nesting-PCR的方法更易于推广使用，我们同时研究了Nesting PCR方法特异性，选择40份标本，其中攻击病毒后恒河猴咽拭子标本20份，正常猴咽拭子标本20份，以攻击用SARS病毒Sino1株作为阳性对照，设立环境对照及未经病毒攻击的恒河猴标本作为阴性对照，用不同引物进行PCR检测，以扩增SARS病毒的不同区段，选取方法1扩增病毒1.8kb处核酸，目标条带为110bp;方法2扩增病毒9.0kb处核酸，目标条带为120bp。结果检测SARS病毒核酸，特异性为100%。说明本实验所扩增片段为SARS病毒，并排除了假阳性。Nesting PCR方法重复性的研究，2人采用Nesting PCR方法1检测相同5份样品，其中3份阳性2份阴性，进行3次重复实验，结果均一致。说明nesting PCR具有特异性强，重复性好，灵敏度高等特点，能及时反映病毒在体内的复制情况，可作为检测病毒核酸的主要手段。但是由于套式PCR的灵敏性极强，可同时存在假阳性的问题。所以对实验室的操作条件及试验人员的操作技术要求较高，提取核酸与进行PCR的场所要分开。且应重复PCR的实验结果。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Ng EK，Hui DS，Chan KC，et al.Quantitative Analysis and Prognostic Implication of SARS Coronavirus RNA in the Plasma and Serum of Paˉtients with Severe Acute Respiratory Syndrome.Clin Chem，2003Nov13[Epub ahead of print].
2 Yam WC，Chan KH，Poon LL，et al.Evaluation of reverse transcription-PCR assays for rapid diagnosis of severe acute respiratory syndrome associated with a novel coronavirus.J Clin Microbiol，2003，41(10):4521-4524.
, 百拇医药
3 Poon LL，Chan KH，Wong OK，et al.Early diagnosis of SARS Coronˉavirus infection by real time RT-PCR.J Clin Virol，2003，28(3):233-238.
4 Wu BQ，Zhong HH，Gao JP，et al.Gene detection of severe acute respiˉratory syndrome-related coronavirus.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2003，32(3):212-214.
基金项目:国家“十五计划”863课题(编号:2003AA208205)
作者单位:100021北京中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所
通讯作者Email:Chuanqin@vip.sina.com
(编辑曲 全), 百拇医药(张扬清 涂新明 朱 华 鲍琳琳 高 虹 张)
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关键词 SARS实验感染动物模型 RT-PCR nesting PCR
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2753-04
Application of RT-PCR on identifying and evaluating
of SARS animal model and vaccine
Zhang Yangqing，Tu Xinming，Zhu Hua，et al.
Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100021.
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【Abstract】 Objective Establish the RT-PCR method for verifying the SARS infection animal model and eˉvaluating the effect of vaccine.Methods We choose3years old SPF macaques，and inoculate the SARS corona virus by dropping in nose，those infected animals as SARS model and will be used to test SARS candidate vaccine.Colˉlect throat swab specimen and the plasma specimen at different time after monkeys were infected.Results After challenged，by the method of RT-PCR the throat swab specimens from vaccine immunize animal are positive only at the firstday，the plasma specimens from the monkeys of SARS infection animal model are positive，others are negative.We can only isolate virus from the throat swab specimens of SARS infection animal model.Conclusion This method is fast，efficient and special.We can use it in a large scope.It can be used to identify the SARS infection animal modˉel and evaluate the efficacy of vaccine.
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Key words SARS corona virus infected animal model RT-PCR nesting Real-time PCR
SARS又称急性重症呼吸系统综合征，临床表现为发热、咳嗽、呼吸窘迫。该疾病传染性强，病死率高，大量病人死于呼吸衰竭，且治愈后出现肺纤维化及股骨头坏死并发症，对人民生命健康造成巨大威胁。因此研究发病机制，降低发病率，减轻疾病症状成为迫在眉睫的事。而SARS疫苗的研制是解决问题最为直接有效的方法。SARS感染性动物模型的建立是进行疾病发生机制的研究、疫苗的评价及药物的筛选的关键环节。如何确认SARS感染性动物模型的成功建立并鉴定模型及评价相应的疫苗是否有效是当前面临的重要问题。目前WHO对SARS患者的标本进行鉴定的方法有病毒分离，ELISA及RT-PCR等。病毒分离耗时长且敏感性较低;ELISA可检测SARS抗原及抗体，但目前缺乏检测SARS病毒的单克隆抗体，无法特异性检测 SARS抗原，而抗体的出现较晚，无法及时判断病原体的入侵;其中RT-PCR的检测方法特异性强，敏感度高且耗时短，为模型的鉴定及疫苗的评价提供了最为直接快速有效的手段 [2] 。RT-PCR分为荧光PCR [3] 及套式PCR等方法 [4] 。均可在极少的样品中检测到其中的微量病毒。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 3岁龄健康恒河猴，购自医科院医学生物学研究所，遗传背景清楚，检查SARS病毒抗体为阴性，并按实验用猴国家标准微生物SPF级别检测排除病原体。共8只，雌雄各半。模型组3只，注射疫苗组4只，注射对照疫苗组1只。
1.2 病毒株 SARS病毒(SARS病毒Sino1株，由北京科兴生物制品有限公司提供)。
1.3 SARS灭活疫苗 北京科兴生物制品有限公司提供。批号:20030904，含量:10μg/ml。制备方法:用SARS病毒(SARS病毒Sino3株，由北京协和医院非典型肺炎患者鼻拭子分离，于Vero细胞传代至第11代)接种Vero细胞[美国ATCC(American Tissue Culture Collection)提供]。培养后，用β-丙内酯灭活，纯化制成。保存条件:4℃，溶剂:PBS。
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1.4 对照疫苗 北京科兴生物制品有限公司提供。批号:20030909，含量:10μg/ml。制备方法:按照疫苗生产工艺制备的Vero细胞对照疫苗。保存条件:4℃。
1.5 试剂及仪器 MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolaˉtion Kit(购自Roche);One Step RT-PCR Kit(购自TaKaRa);SARS-CoV核酸扩增荧光检测试剂盒(上海复兴实业医学科技发展有限公司惠赠);MagNA Pure LC系统(Roche);PCR仪(eppendorf5330);RocheReal-time PCR仪(Lightcycler)。
1.6 标本
1.6.1 咽拭子 每日清晨进食前用灭菌棉签伸入恒河猴咽喉部蘸取分泌物，浸入1ml DMES中放置-80℃冰箱保存备用。
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1.6.2 血浆 取抗凝静脉血1ml分离出血浆放置-80℃冰箱保存备用。
1.7实验设计 (1)将试验用猴随机分组，每组3～4只动物，模型组不采取任何防护措施，另两组分别注射疫苗，分为SARS灭活疫苗及对照疫苗，然后将动物同时用病毒进行攻击。分别在模型组及疫苗组恒河猴攻击前及病毒攻击后第1～7天采取咽拭子标本，病毒攻击后第2、第5、第7天采血浆标本。以攻击的毒株作为阳性对照，以未被病毒攻击的空白猴咽拭子及血浆作为阴性对照，并设立未加样品的空白对照，进行nesting-PCR，同时将标本进行病毒分离。(2)将标本提取的核酸同时进行Real-time PCR及nesting-PCR比较其灵敏度。(3)与病毒分离相对比，比较其灵敏度。将原始毒株进行病毒滴定，将病毒分离可检测到的病毒浓度向下稀释，稀释至10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 、10 -6 进行RT-PCR，比较两种方法的灵敏度。
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1.8 实验方法
1.8.1 nesting PCR实验方法 取200μl标本以MagNA Pure LC系统(Roche)自动提取标本中病毒的总核酸。取5μl作为模板进行RT-PCR，反应体系如下10×one step RT-PCR buffer5μl，MgCl 2 (25mM)10μl，dNTP Mixture(10mM)5μl，Rnase Inhibitor(40U/μl)1μl，AMV RTase XL(5U/μl)1μl，AMV-Optiˉmized Taq(5U/μl)1μl，1st Primer Pair(20uM)1μl，样品RNA1μl，加RNAse Free dH 2 O至50μl。按以下条件进行RT-PCR反应:50℃15min，94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles。引物序列为1st sense:5′-ATGAATTACCAAGTˉCAATGGTTAC-3′antisense，5′-CATAACCAGTCGˉGTACAGCTAC-3′，2nd sense:5′GAAGCTATTCGTCACGTT-3′antisense，5′CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG-3′，反应结束后，取RT-PCR产物作为下一轮PCR反应的模板，进行nesting PCR，反应条件如下:RT-PCR反应液1μl，10×one step RT-PCR buffer5μl，MgCl 2 (25mM)5μl，dNTP Mixture(10mM)2μl，AMV-Optimized Taq(5U/μl)1μl，2nd Primer Pair(20uM)1μl，加dH2 O至50μl。按以下条件进行PCR反应。94℃30s，55℃30s，72℃30s，30cycles。反应结束后，取10μl PCR反应产物在2%琼脂糖上进行凝胶电泳，出现110bp目的条带判定为SARS PCR阳性，未出现110bp目的条带判定为SARS PCR阴性。当空白对照、环境对照、阴性对照均为阴性，阳性对 照为阳性时，该实验成立并可判定结果。
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1.8.2 Real-time PCR实验方法 取200μl标本以MagNA Pure LC系统(Roche)自动提取标本中病毒的总核酸。取待测样品的核酸液10μl，加入18μl SARS RT-PCR反应液，混合酶2μl。上游引物:TTATC ACCCG CGAAG AAGCT，下游引物:CTGTA GAAAA TCCTA GCTGG AG，荧光探针:FAM-TCGTG CGTGG ATTGG CTTTG ATGT-TAMRA按以下条件进行RT-PCR反应:37℃30min，95℃2min，95℃5s，55℃10s，72℃20s，50个循环。结果判定:出现阳性曲线判定为SARS病毒核酸检测阳性，未出现阳性曲线判定为SARS病毒核酸RT-PCR检测阴性。
1.8.3 SARS病毒分离 接种病毒、观察:将对照疫苗接种于24孔板上。待对照疫苗长成单层，吸去生长液。每孔加咽拭子液(经0.2μm过滤器除菌过滤)400μl或血浆150μl或组织匀浆100μl后，37℃孵箱吸附1h。吸出液体后用PBS(加2%双抗)洗两遍，后加DMEM液补至1ml，37℃孵箱培养5～7天，观察细胞病变。将第一代上清接种于对照疫苗传代，盲传三代，进行病毒鉴定。
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2 结果
2.1 RT-PCR检测 显示注射SARS灭活疫苗及注射对照疫苗组恒河猴在注射后第3天采集的咽拭子标本经RT-PCR检测均为阴性。攻毒后模型组恒河猴及对照疫苗组恒河猴每天采集的咽拭子经RT-PCR检测均为阳性;疫苗组恒河猴仅在攻毒后前三天采集的咽拭子标本经RT-PCR检测为阳性，以后均为阴性。模型组恒河猴攻毒后第7天的血浆标本经RT-PCR检测为阳性，疫苗组各天血浆标本经检测均为阴性。见表1，图1。
2.2 病毒分离结果 显示模型组动物攻毒后的第2、第5、第7天的咽拭子均分离出病毒，注射对照疫苗的动物在攻毒后的第2天的咽拭子分离出病毒，注射疫苗组动物咽拭子未分离到病毒。所有动物的血浆标本均未分离出病毒。见表2。
2.3 将一批标本同时进行病毒分离与nesting PCR 其结果见表3。
2.4 选取相同的100份样本，以MagNA Pure LC系统(Roche)提取总核酸，分别进行nesting PCR及Real time PCR，比较其PCR结果 结果Nesting PCR比Real-time PCR检测SARS病毒核酸方法灵敏。见表4。
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表1疫苗组模型组恒河猴攻毒后RT-PCR检测结果
表2 疫苗组模型组恒河猴攻毒后病毒分离结果
表3 Nesting PCR与细胞培养法检测SARS病毒结果
表2 Nesting PCR与Real-time PCR 检测SARS病毒结果
2.5 提取RNA并进行RT-PCR 通过病毒分离的方法可检测浓度达10 -7 ，RT-PCR的检测灵敏度达10 -12 。见图 2。
图27为10 -8 病毒稀释液，8为10 -9 病毒稀释液，9为10 -10 病毒稀释液，10为10 -11 病毒稀释液，11为10 -12 病毒稀释液，12为10 -13 病毒稀释液，13为病毒原液。14为阴性对照，15为空白对照。余为阴性标本。
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3 讨论
感染性动物模型是指动物能模拟病毒在人类体内的活动情况，通过病毒学检测及免疫学检测说明病毒在体内的复制情况。为我们研究发病机制，评价疫苗，筛选药物提供了良好的平台。我们通过病毒分离与RT-PCR来说明病毒在体内的复制。与用Trizol提取总RNA相比，用罗氏的核酸分离纯分系统(磁珠法)提取的核酸纯度高且产率大，但是由于该仪器及其耗材、试剂盒价格高昂故难以推广使用。RT-PCR结果与病毒分离结果相大致相同，与病毒分离相比RT-PCR有敏感、快速、特异性强等特点。故在模型鉴定及疫苗评价中发挥重要作用。该实验可在实验室中推广使用。nesting-PCR与Real-time PCR相比，敏感度高，可能与上海复兴公司的SARS-CoV核酸扩增荧光检测试剂盒灵敏度低有关。由于进口Real-time PCR试剂盒价格高昂较难普及，因此nesting-PCR的方法更易于推广使用，我们同时研究了Nesting PCR方法特异性，选择40份标本，其中攻击病毒后恒河猴咽拭子标本20份，正常猴咽拭子标本20份，以攻击用SARS病毒Sino1株作为阳性对照，设立环境对照及未经病毒攻击的恒河猴标本作为阴性对照，用不同引物进行PCR检测，以扩增SARS病毒的不同区段，选取方法1扩增病毒1.8kb处核酸，目标条带为110bp;方法2扩增病毒9.0kb处核酸，目标条带为120bp。结果检测SARS病毒核酸，特异性为100%。说明本实验所扩增片段为SARS病毒，并排除了假阳性。Nesting PCR方法重复性的研究，2人采用Nesting PCR方法1检测相同5份样品，其中3份阳性2份阴性，进行3次重复实验，结果均一致。说明nesting PCR具有特异性强，重复性好，灵敏度高等特点，能及时反映病毒在体内的复制情况，可作为检测病毒核酸的主要手段。但是由于套式PCR的灵敏性极强，可同时存在假阳性的问题。所以对实验室的操作条件及试验人员的操作技术要求较高，提取核酸与进行PCR的场所要分开。且应重复PCR的实验结果。
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参考文献
1 Ng EK，Hui DS，Chan KC，et al.Quantitative Analysis and Prognostic Implication of SARS Coronavirus RNA in the Plasma and Serum of Paˉtients with Severe Acute Respiratory Syndrome.Clin Chem，2003Nov13[Epub ahead of print].
2 Yam WC，Chan KH，Poon LL，et al.Evaluation of reverse transcription-PCR assays for rapid diagnosis of severe acute respiratory syndrome associated with a novel coronavirus.J Clin Microbiol，2003，41(10):4521-4524.
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3 Poon LL，Chan KH，Wong OK，et al.Early diagnosis of SARS Coronˉavirus infection by real time RT-PCR.J Clin Virol，2003，28(3):233-238.
4 Wu BQ，Zhong HH，Gao JP，et al.Gene detection of severe acute respiˉratory syndrome-related coronavirus.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2003，32(3):212-214.
基金项目:国家“十五计划”863课题(编号:2003AA208205)
作者单位:100021北京中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所
通讯作者Email:Chuanqin@vip.sina.com
(编辑曲 全), 百拇医药(张扬清 涂新明 朱 华 鲍琳琳 高 虹 张)