甲壳低聚糖对非肥胖性小鼠血糖影响的研究
【摘要】 目的 观察甲壳低聚糖对NOD小鼠血糖的影响。方法 (1)取12周龄NOD小鼠，分离纯化胰岛β细胞，分别观察干预组(在细胞培养液中加入3%甲壳低聚糖)及对照组(在细胞培养液中加入生理盐水)细胞增殖情况和急性胰岛细胞释放胰岛素实验。(2)测定12周龄NOD小鼠血糖值，分为高血糖组(Ⅰ)和低血糖组(Ⅱ)，分别随机分成对照组Ⅰ-1，Ⅱ-1和治疗组Ⅰ-2，Ⅱ-2，治疗组和对照组分别用3%甲壳低聚糖和冷开水做饮用水，连续15周，定期测定血糖值。期间对治疗显效组随机让8只NOD小鼠饮用一定时间低聚糖后，改饮冷开水，定期测血糖值，观察反弹现象。结果 (1)干预组细胞增殖优于对照组(P<0.05)，而急性胰岛素释放则两组相比较差异无显著性。(2)治疗组Ⅰ-2有65%降血糖作用显著，35%降血糖有效，血糖较长时间得到控制，寿命延长，治疗组Ⅱ-2血糖未见升高。对照组Ⅰ-1寿命很短并陆续发生死亡，对照组Ⅱ-1陆续出现高血糖。显效组NOD小鼠停饮甲壳低聚糖后血糖反弹上升。结论 甲壳低聚糖能够促进胰岛β细胞的增殖并且对NOD小鼠高血糖有控制和治疗作用，延长糖尿病NOD小鼠生存期。
, http://www.100md.com
关键词 甲壳低聚糖 NOD小鼠 胰岛素 糖尿病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)21-1936-04
Study on chito-oligosaccharides on blood glucose in NOD mice
Qiao Xinhui，
Song Lan，Li Bangliang，et al.
Department of Biochemistry and Meolecullar Nanhua Universituy，Hengyang，421001.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of chito-oligosaccharides on blood glucose in NOD mice.Methods (1)The islets cells were separated and purified.Then the purified islet cell were divided into two groups:treating groupand control group.3%chito-oligosaccharides were added to culture media of the former and0.9%Nacl to those of the latter，respectively.The cellular proliferating activity was detected and acute experiment of insulin releasing from these islets cells was performed in both groups.(2)The NOD mice were divided into two groups accordˉing to their blood glucose:group-Ⅰ(hyperglycemia group)，group-Ⅱ(hypoglycemia group).Then，the group-Ⅰand-Ⅱwere divided into the control groupsⅠ-1、Ⅱ-1and the treating groupsⅠ-2、Ⅱ-2randomly.The control groups and the treated groups received cool water or3%chito-oligosaccharides as drinking water for15weeks respectively.Then these mice were measured the blood glucose at the given time.At this span，to investigate the rebound phenomena，taking8mice received cool water randomlywhen they had received3%chito-oligosaccharides a periodof time and measured their blood glucose at the given time.Results (1)The cellular proliferating activity in the treating group was better than that in the controls(P<0.05).But there was no significant difference between the insulin releasing ability of two groups.(2)In the groupⅡ-2，the blood glucose of these mice were controlled long time and their life-span were prolong.There were65%micewhose glucose were markedly decreased and were35%mice whose blood glucose were availably decreased.The life-span of the groupⅠ-1were very short and died in succession.The mice of the groupⅡ-1appear hyperglycemia in succession.If the mice stop drinking chito-oligosaccharides，their blood glucose were rebounded.Conclusion It was indicated that the chito-oligosaccharides not only can increase the cellular proliferating activity of the islets cell but also have the treating effects on the diabetes NOD mice which can prolong their life-span.
, 百拇医药
Key words chito-oligosaccharides NOD mice insulin diabetes
NOD(non-obese diabetes，非肥胖性糖尿病)小鼠是一种自发性1型糖尿病动物模型。在正常喂养中，它自3周龄起自发地出现胰岛炎，12周龄可发生糖尿病，甚至死亡，是1型糖尿病最常用的理想的动物模型 [1] 。而甲壳低聚糖(chito-oligosaccha rides)是高分子水不溶性壳聚糖(chitosan)经氧化降解的产物，具有水溶性，是自然界少有的阳离子可食用类纤维素。有文献报道，它具有增强机体免疫作 用，有降脂、降血糖作用 [2，3] 。本实验选用12周龄NOD小鼠，观察用甲壳低聚糖处理前后其胰岛细胞的生长情况及胰岛素分泌量。然后，观察甲壳低聚糖对NOD小鼠血糖的调节作用以及其对1型糖尿病的治疗作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 甲壳低聚糖由南华大学生物化学教研室制备。聚合度3～7的寡聚糖占降解产物的60% [4] 。NOD鼠，由南华大学尹卫东教授引进。RPMI-1640培养基(Gibo产品)。胎牛血清(杭州四季青公司产品)，MTT(Amˉreson产品)，胰岛素放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所产品)，胰蛋白酶(Sigma公司产品)，Ⅺ型胶原酶(Sigma公司，1920U/mg)，Ficoll(Pharmacia公司)，碘乙酸(CP级，上海试剂二厂)，Hank’s平衡盐溶液(HBSS)及D-Hank’s液(自配)，DMSO(Amreson，分析纯)。血糖测定试剂盒(北京北化精细化学品有限责任公司)。
1.1.2 主要器材 毛细玻璃管(自制)、不锈钢筛网(500μm/孔径)、医用净化工作台、CO 2 培养箱、倒置显微镜、酶联免疫检测仪、γ-计数器、高速冷冻离心机。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞生长及胰岛素分泌量的影响。
(1)胰岛细胞的制备与培养:按蒋铁建等 [5] 的方法，12周龄NOD鼠，3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。固定小鼠后无菌状态下打开腹腔，用丝线结扎胆总管近十二指肠远端处并接上41/2号静脉穿刺针。用注射器取2ml含Ⅺ型胶原酶(1920U/mg，浓度为1mg/ml)的HBSS，将其注入胆总管，使HBSS逆胰管注入胰腺，将胰腺充分扩张以破坏，消化胰腺组织，将扩张的胰腺取下放入试管中，37℃水浴中温浴40min后加入4℃HBSS15ml终止消化。轻摇试管，然后以320g速度离心10～15s，弃去上清，沉淀用4℃HBSS洗涤3次后用不锈钢丝网过滤组织悬液，将过滤后的组织再用HBSS洗涤1次。将消化后的沉淀重悬于1ml HBSS中，然后加入11%的Ficoll液(HBSS配制)将消化组织的HBSS悬起，然后依次在11%的Ficoll液层下加入20.5%及23%的Ficoll液各1ml，最后在试管底部加入Ficoll液2ml，4℃、800g离心10min。吸出11%和20.5%界面处的细胞团。
, 百拇医药
将上述取得的细胞团用无菌D-Hanks液悬浮离心，重复2次，然后用含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞并计数，调整细胞浓度为2×10 5 个/ml。以每孔1ml接种于24孔培养板中，置于37℃，5%的CO 2 ，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养15h后轻摇培养板，将上面未贴壁的细胞接种于新的24孔培养板以除去部分成纤维细胞。继续培养48h后，更换含2.5mg/ml的碘乙酸的培养液继续培养5h，以除去大部分成纤维细胞，然后用不含碘乙酸的培养液洗涤2次，加入含血清的培养液培养(条件同前)，每3天换液1次，获单层胰岛细胞，备用。
(2)干预组和对照组胰岛细胞增殖活力的测定:按Janˉjic D等 [6] 用0.05%EDTA-0.125%胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×10 5 个/ml，加入24孔培养板中，每孔1ml，培养24h后吸弃培养液。将细胞分为干预组和对照组，每组12个复孔，干预组加入含3%的甲壳低聚糖的培养液1ml，对照组加入含同样浓度的生理盐水的培养液1ml，继续培养，分别于第2、4、6、8、12天后取出，每孔加入200μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h，吸弃培养液，每孔加入800μl DMSO，振荡10min后用酶联免疫检测仪于490nm处测定吸光度(OD 490 值)。
, 百拇医药
(3)干预组和对照组胰岛素分泌量的测定:按邵建华 [7] 等方法将培养的胰岛细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×10 5 个/ml，以每孔1ml接种于24孔培养板中，培养6天后吸弃培养液，分为干预组及对照组，干预组加入含3%的甲壳低聚糖的培养液，对照组加入含相同浓度的生理盐水的培养液，37℃培养4h，吸取培养液，用放射免疫法测定培养液中的胰岛素含量。
(4)结果判断:以OD 490 值大小反映胰岛β细胞的增殖情况。培养液中胰岛素含量用mIU/L表示。
1.2.2 甲壳低聚糖对NOD小鼠降血糖作用观察
(1)动物分组:12周龄NOD小鼠称体重30±4g，测血糖值，血糖在11.1mmol/L以上者为高血糖。选取血糖在11.1mmol/L以上者和血糖低于8mmol/L以下者，确定为高血糖组(Ⅰ)和低血糖组(Ⅱ)，在Ⅰ和Ⅱ组再分别随机分成对照组Ⅰ-1，Ⅱ-1和治疗组Ⅰ-2，Ⅱ-2。每只分笼，正常饲料喂养，对照组用冷开水作饮用水，治疗组用3%甲壳低聚糖溶液作饮用水，每天对治疗组测定用甲壳低聚糖溶液体积，并及时补充。连续15周。
, 百拇医药
(2)血糖测定:用断尾采血，对各组NOD小鼠间隔19～25天称体重，测血糖值，血糖测定用试剂盒方法。
(3)统计学处理:数据用X±s表示，行成组设计t检验及配对样本t检验。
2 结果
2.1 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞生长及胰岛素分泌量的影响。
2.1.1 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞增殖的影响 在细胞培养液中加入3%的甲壳低聚糖后第4、6天细胞增殖程度较对照组明显增加。第2、8、12天促进增值不明显。详见表1。
表1 甲壳低聚糖对NOD鼠胰岛β细胞增殖的影响
注:与对照组相比， ˇ P<0.05
, 百拇医药 2.1.2 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞胰岛素分泌量的影响 在细胞培养液中加入3%的甲壳低聚糖后，培养液中胰岛素含量为27.041±3.52mIU/L。而对照组培养液中胰岛素含量为32.85±2.63mIU/L，两者比较差异无显著性 (P>0.05)。
2.2 甲壳低聚糖对NOD小鼠降血糖作用观察
2.2.1 高血糖组(Ⅰ)，低血糖组(Ⅱ)在实验开始时测定血糖值，见表2。
表2 高血糖(Ⅰ)组和低血糖(Ⅱ)组血糖值比较 (X±s)
注:两组比较P<0.01
2.2.2 高血糖组(Ⅰ)随机分成对照组Ⅰ-1(12只)和治疗组Ⅰ-2(20只)，对照组用冷开水作饮用水。治疗组用3% 甲壳低聚糖作饮用水。每天测量饮用体积。一般平均19±10ml/天，实验后间隔19～25天测血糖值。对治疗组喂甲壳低聚糖后，血糖均有降低，但降低数值个体差异较大。随喂低聚糖时间越长血糖越趋于正常。为统计方便，把血糖值降到11.1mmol/L以下者为显效组(a)占65%，而血糖值降到11.1mmol/L以上者为有效组(b)，占35%。对照组不断有鼠死亡，仅列剩余只数血糖值。体重测定治疗组略增加，不列入表中。结果见表3。
, http://www.100md.com
2.3 低血糖组(Ⅱ)，随机分成对照组Ⅱ-1和治疗组Ⅱ-2，喂低聚糖后间隔19～25天测血糖值，见表4。
表3 高血糖组(Ⅰ)实验后血糖变化
表4 低血糖组(Ⅱ)实验后血糖变化 (mmol/L)
2.4 反弹实验 在糖尿病NOD鼠治疗显效组(a)中，作反弹实验。在喂养低聚糖38天后，随机取4只[a(1)]，停喂养低聚糖，改饮冷开水，63天后再随机取4只[a(2)]停喂低聚糖，改饮冷开水，观察血糖变化。见表5。
表5 低聚糖治疗显效组停喂低聚糖后血糖变化
注:与停喂前比较， ˇ P<0.001; ˇˇ P<0.05
3 讨论
, http://www.100md.com
本实验观察到甲壳低聚糖对NOD糖尿病小鼠有较好的治疗作用，既降低了血糖，又改善了多饮多尿症状。其中65%有明显治疗效果，其余35%血糖虽然没有下降到正常水平，但可维持生命，而对照组NOD鼠陆续死亡。证明甲壳低聚糖对NOD高血糖确有治疗作用。而且也可预防高血糖过早出现。在反弹实验中，喂低聚糖时间越长，停喂后血糖反弹呈上升趋缓，说明甲壳低聚糖对NOD糖尿病鼠不仅能治标，也能治本。同时本实验证实:在体外培养情况下甲壳低聚糖能有效地促进胰岛细胞的增殖。培养4、6天增殖显著，而培养8天后该促进作用不明显是由于此时细胞 铺满平板，达到最大细胞生长密度，随时间延长，细胞逐渐衰变，细胞量下降所致。而用急性胰岛细胞释放胰岛素实验则表明，甲壳低聚糖无明显刺激细胞增加胰岛素释放的能力，说明甲壳低聚糖降低血糖的功能不是由于促进胰岛细胞释放胰岛素所致。
大量研究表明，NOD糖尿病的发生与免疫调节功能障碍有关，在人和NOD鼠均有证据显示1型糖尿病中存在针对胰岛β细胞的自身免疫反应导致的β细胞的破坏。Caloinaro F等用完全弗氏佐剂(CFA)通过非特异性免疫刺激作用纠正这种免疫功能异常，可有效降低NOD鼠糖尿病的发生率 [8] 。在人和NOD鼠均有证据显示1型糖尿病为T细胞介导的免疫性疾病，针对胰岛β细胞的损伤性自身免疫反应导致了β细胞的破坏。苏恒 [1] 等用脂质体预防NOD鼠胰岛炎的发生也很有效果。而壳聚糖是几丁质脱乙酰基的产物，甲壳低聚糖又是脱乙酰基85%以上的壳聚糖高分子降解产物。文献报道 [9] ，70%脱乙酰基几丁质有最强的免疫佐剂活性。在小鼠中可诱导特异异源杀伤T细胞。激活自然杀伤细胞(NK)，并诱导IL-1和CsF等细胞因子的产生，因此甲壳低聚糖是一种有效的非特异性免疫调节剂。它能激活补体系统，介导补体系统的生物学效应，增强巨噬细胞在免疫应答中的协同效应，从而实现机体对T细胞、NK细胞和B细胞的调节 [10] ，因此它对NOD小鼠糖尿病有一定的治疗作用是通过免疫调节来实现的。 糖尿病在我国是高发病，目前还缺少特效药，通过饮食治疗，达到降低血糖或者稳定病情的目的，不失为一种较好的控制途径，甲壳低聚糖价廉易得，无异味，无毒副作用，无免疫原性，而且由于20世纪80年代以来，国内甲壳多糖研究的兴起，由甲壳多糖开发的各种产品得到广泛的应用。完全可以作为1型糖尿病人的保健饮料，为糖尿病人带来健康或提高其生活质量。
, 百拇医药
参考文献
1 苏恒，蒋铁建，周智广.脂质体与完全弗氏佐剂预防NOD鼠胰岛炎探讨.湖南医科大学学报，2002，27(1):32-34.
2 任林，李邦良，高仕英，等.甲壳低聚糖对糖尿病小鼠血糖和肠道菌群的影响.中国生化药物的杂志，2001，22(5):227-229.
3 魏涛，唐粉芳，国豫，等.壳聚糖降脂、降糖、增强免疫作用研究.中国甲壳资源研究开发应用学术研讨会论文集，1997，11青岛.
4 李邦良，高仕英，乔新惠，等.甲壳低聚糖的制备和分析.中国生 化药物杂志，2001，22(5):227-229.
5 蒋铁建，苏恒，周智广.NOD小鼠胰岛分离与纯化的方法研究.湖南医科大学学报，2002，27(1):85-87.
, 百拇医药
6 Janjic D，Wollheim CB.Islet cells metabolism is reflected by the MTT(tetrazolium)colorimetic assay.Diabetologia，1992，35:482-485.
7 邵建华，袁振芳.游离脂肪酸促进基础状态胰岛细胞生长和分泌胰岛素.中华内科杂志，1997，12，36(12):831-832.
8 Caloinaro F，Gambelunghe G，Lafferty KJ.Protection from autoimmune diabetes by adjuvant therapy in the non-obese diabetic mouse:the role of interleukin-4and inerleukin-10.J Immunol，1993，150:2072-2080.
9 郭淑玲.合成免疫佐剂在宿主非特异性免疫刺激和增强疫苗免疫原性中的应用.国外医药·抗生素分册，1994，15(6):462-464.
10 张澄波，梅学文，都本业，等.脱乙酰壳聚糖对肿瘤及免疫系统的影响.中国实验临床免疫学杂志，1992，4(1):1-4.
作者单位:421001南华大学生物化学与分子生物教研室
(编辑晓 勇), 百拇医药(乔新惠 宋岚 李邦良 周弟先)
, http://www.100md.com
关键词 甲壳低聚糖 NOD小鼠 胰岛素 糖尿病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)21-1936-04
Study on chito-oligosaccharides on blood glucose in NOD mice
Qiao Xinhui，
Song Lan，Li Bangliang，et al.
Department of Biochemistry and Meolecullar Nanhua Universituy，Hengyang，421001.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of chito-oligosaccharides on blood glucose in NOD mice.Methods (1)The islets cells were separated and purified.Then the purified islet cell were divided into two groups:treating groupand control group.3%chito-oligosaccharides were added to culture media of the former and0.9%Nacl to those of the latter，respectively.The cellular proliferating activity was detected and acute experiment of insulin releasing from these islets cells was performed in both groups.(2)The NOD mice were divided into two groups accordˉing to their blood glucose:group-Ⅰ(hyperglycemia group)，group-Ⅱ(hypoglycemia group).Then，the group-Ⅰand-Ⅱwere divided into the control groupsⅠ-1、Ⅱ-1and the treating groupsⅠ-2、Ⅱ-2randomly.The control groups and the treated groups received cool water or3%chito-oligosaccharides as drinking water for15weeks respectively.Then these mice were measured the blood glucose at the given time.At this span，to investigate the rebound phenomena，taking8mice received cool water randomlywhen they had received3%chito-oligosaccharides a periodof time and measured their blood glucose at the given time.Results (1)The cellular proliferating activity in the treating group was better than that in the controls(P<0.05).But there was no significant difference between the insulin releasing ability of two groups.(2)In the groupⅡ-2，the blood glucose of these mice were controlled long time and their life-span were prolong.There were65%micewhose glucose were markedly decreased and were35%mice whose blood glucose were availably decreased.The life-span of the groupⅠ-1were very short and died in succession.The mice of the groupⅡ-1appear hyperglycemia in succession.If the mice stop drinking chito-oligosaccharides，their blood glucose were rebounded.Conclusion It was indicated that the chito-oligosaccharides not only can increase the cellular proliferating activity of the islets cell but also have the treating effects on the diabetes NOD mice which can prolong their life-span.
, 百拇医药
Key words chito-oligosaccharides NOD mice insulin diabetes
NOD(non-obese diabetes，非肥胖性糖尿病)小鼠是一种自发性1型糖尿病动物模型。在正常喂养中，它自3周龄起自发地出现胰岛炎，12周龄可发生糖尿病，甚至死亡，是1型糖尿病最常用的理想的动物模型 [1] 。而甲壳低聚糖(chito-oligosaccha rides)是高分子水不溶性壳聚糖(chitosan)经氧化降解的产物，具有水溶性，是自然界少有的阳离子可食用类纤维素。有文献报道，它具有增强机体免疫作 用，有降脂、降血糖作用 [2，3] 。本实验选用12周龄NOD小鼠，观察用甲壳低聚糖处理前后其胰岛细胞的生长情况及胰岛素分泌量。然后，观察甲壳低聚糖对NOD小鼠血糖的调节作用以及其对1型糖尿病的治疗作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 甲壳低聚糖由南华大学生物化学教研室制备。聚合度3～7的寡聚糖占降解产物的60% [4] 。NOD鼠，由南华大学尹卫东教授引进。RPMI-1640培养基(Gibo产品)。胎牛血清(杭州四季青公司产品)，MTT(Amˉreson产品)，胰岛素放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所产品)，胰蛋白酶(Sigma公司产品)，Ⅺ型胶原酶(Sigma公司，1920U/mg)，Ficoll(Pharmacia公司)，碘乙酸(CP级，上海试剂二厂)，Hank’s平衡盐溶液(HBSS)及D-Hank’s液(自配)，DMSO(Amreson，分析纯)。血糖测定试剂盒(北京北化精细化学品有限责任公司)。
1.1.2 主要器材 毛细玻璃管(自制)、不锈钢筛网(500μm/孔径)、医用净化工作台、CO 2 培养箱、倒置显微镜、酶联免疫检测仪、γ-计数器、高速冷冻离心机。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞生长及胰岛素分泌量的影响。
(1)胰岛细胞的制备与培养:按蒋铁建等 [5] 的方法，12周龄NOD鼠，3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。固定小鼠后无菌状态下打开腹腔，用丝线结扎胆总管近十二指肠远端处并接上41/2号静脉穿刺针。用注射器取2ml含Ⅺ型胶原酶(1920U/mg，浓度为1mg/ml)的HBSS，将其注入胆总管，使HBSS逆胰管注入胰腺，将胰腺充分扩张以破坏，消化胰腺组织，将扩张的胰腺取下放入试管中，37℃水浴中温浴40min后加入4℃HBSS15ml终止消化。轻摇试管，然后以320g速度离心10～15s，弃去上清，沉淀用4℃HBSS洗涤3次后用不锈钢丝网过滤组织悬液，将过滤后的组织再用HBSS洗涤1次。将消化后的沉淀重悬于1ml HBSS中，然后加入11%的Ficoll液(HBSS配制)将消化组织的HBSS悬起，然后依次在11%的Ficoll液层下加入20.5%及23%的Ficoll液各1ml，最后在试管底部加入Ficoll液2ml，4℃、800g离心10min。吸出11%和20.5%界面处的细胞团。
, 百拇医药
将上述取得的细胞团用无菌D-Hanks液悬浮离心，重复2次，然后用含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞并计数，调整细胞浓度为2×10 5 个/ml。以每孔1ml接种于24孔培养板中，置于37℃，5%的CO 2 ，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养15h后轻摇培养板，将上面未贴壁的细胞接种于新的24孔培养板以除去部分成纤维细胞。继续培养48h后，更换含2.5mg/ml的碘乙酸的培养液继续培养5h，以除去大部分成纤维细胞，然后用不含碘乙酸的培养液洗涤2次，加入含血清的培养液培养(条件同前)，每3天换液1次，获单层胰岛细胞，备用。
(2)干预组和对照组胰岛细胞增殖活力的测定:按Janˉjic D等 [6] 用0.05%EDTA-0.125%胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×10 5 个/ml，加入24孔培养板中，每孔1ml，培养24h后吸弃培养液。将细胞分为干预组和对照组，每组12个复孔，干预组加入含3%的甲壳低聚糖的培养液1ml，对照组加入含同样浓度的生理盐水的培养液1ml，继续培养，分别于第2、4、6、8、12天后取出，每孔加入200μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h，吸弃培养液，每孔加入800μl DMSO，振荡10min后用酶联免疫检测仪于490nm处测定吸光度(OD 490 值)。
, 百拇医药
(3)干预组和对照组胰岛素分泌量的测定:按邵建华 [7] 等方法将培养的胰岛细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×10 5 个/ml，以每孔1ml接种于24孔培养板中，培养6天后吸弃培养液，分为干预组及对照组，干预组加入含3%的甲壳低聚糖的培养液，对照组加入含相同浓度的生理盐水的培养液，37℃培养4h，吸取培养液，用放射免疫法测定培养液中的胰岛素含量。
(4)结果判断:以OD 490 值大小反映胰岛β细胞的增殖情况。培养液中胰岛素含量用mIU/L表示。
1.2.2 甲壳低聚糖对NOD小鼠降血糖作用观察
(1)动物分组:12周龄NOD小鼠称体重30±4g，测血糖值，血糖在11.1mmol/L以上者为高血糖。选取血糖在11.1mmol/L以上者和血糖低于8mmol/L以下者，确定为高血糖组(Ⅰ)和低血糖组(Ⅱ)，在Ⅰ和Ⅱ组再分别随机分成对照组Ⅰ-1，Ⅱ-1和治疗组Ⅰ-2，Ⅱ-2。每只分笼，正常饲料喂养，对照组用冷开水作饮用水，治疗组用3%甲壳低聚糖溶液作饮用水，每天对治疗组测定用甲壳低聚糖溶液体积，并及时补充。连续15周。
, 百拇医药
(2)血糖测定:用断尾采血，对各组NOD小鼠间隔19～25天称体重，测血糖值，血糖测定用试剂盒方法。
(3)统计学处理:数据用X±s表示，行成组设计t检验及配对样本t检验。
2 结果
2.1 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞生长及胰岛素分泌量的影响。
2.1.1 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞增殖的影响 在细胞培养液中加入3%的甲壳低聚糖后第4、6天细胞增殖程度较对照组明显增加。第2、8、12天促进增值不明显。详见表1。
表1 甲壳低聚糖对NOD鼠胰岛β细胞增殖的影响
注:与对照组相比， ˇ P<0.05
, 百拇医药 2.1.2 甲壳低聚糖对NOD小鼠胰岛细胞胰岛素分泌量的影响 在细胞培养液中加入3%的甲壳低聚糖后，培养液中胰岛素含量为27.041±3.52mIU/L。而对照组培养液中胰岛素含量为32.85±2.63mIU/L，两者比较差异无显著性 (P>0.05)。
2.2 甲壳低聚糖对NOD小鼠降血糖作用观察
2.2.1 高血糖组(Ⅰ)，低血糖组(Ⅱ)在实验开始时测定血糖值，见表2。
表2 高血糖(Ⅰ)组和低血糖(Ⅱ)组血糖值比较 (X±s)
注:两组比较P<0.01
2.2.2 高血糖组(Ⅰ)随机分成对照组Ⅰ-1(12只)和治疗组Ⅰ-2(20只)，对照组用冷开水作饮用水。治疗组用3% 甲壳低聚糖作饮用水。每天测量饮用体积。一般平均19±10ml/天，实验后间隔19～25天测血糖值。对治疗组喂甲壳低聚糖后，血糖均有降低，但降低数值个体差异较大。随喂低聚糖时间越长血糖越趋于正常。为统计方便，把血糖值降到11.1mmol/L以下者为显效组(a)占65%，而血糖值降到11.1mmol/L以上者为有效组(b)，占35%。对照组不断有鼠死亡，仅列剩余只数血糖值。体重测定治疗组略增加，不列入表中。结果见表3。
, http://www.100md.com
2.3 低血糖组(Ⅱ)，随机分成对照组Ⅱ-1和治疗组Ⅱ-2，喂低聚糖后间隔19～25天测血糖值，见表4。
表3 高血糖组(Ⅰ)实验后血糖变化
表4 低血糖组(Ⅱ)实验后血糖变化 (mmol/L)
2.4 反弹实验 在糖尿病NOD鼠治疗显效组(a)中，作反弹实验。在喂养低聚糖38天后，随机取4只[a(1)]，停喂养低聚糖，改饮冷开水，63天后再随机取4只[a(2)]停喂低聚糖，改饮冷开水，观察血糖变化。见表5。
表5 低聚糖治疗显效组停喂低聚糖后血糖变化
注:与停喂前比较， ˇ P<0.001; ˇˇ P<0.05
3 讨论
, http://www.100md.com
本实验观察到甲壳低聚糖对NOD糖尿病小鼠有较好的治疗作用，既降低了血糖，又改善了多饮多尿症状。其中65%有明显治疗效果，其余35%血糖虽然没有下降到正常水平，但可维持生命，而对照组NOD鼠陆续死亡。证明甲壳低聚糖对NOD高血糖确有治疗作用。而且也可预防高血糖过早出现。在反弹实验中，喂低聚糖时间越长，停喂后血糖反弹呈上升趋缓，说明甲壳低聚糖对NOD糖尿病鼠不仅能治标，也能治本。同时本实验证实:在体外培养情况下甲壳低聚糖能有效地促进胰岛细胞的增殖。培养4、6天增殖显著，而培养8天后该促进作用不明显是由于此时细胞 铺满平板，达到最大细胞生长密度，随时间延长，细胞逐渐衰变，细胞量下降所致。而用急性胰岛细胞释放胰岛素实验则表明，甲壳低聚糖无明显刺激细胞增加胰岛素释放的能力，说明甲壳低聚糖降低血糖的功能不是由于促进胰岛细胞释放胰岛素所致。
大量研究表明，NOD糖尿病的发生与免疫调节功能障碍有关，在人和NOD鼠均有证据显示1型糖尿病中存在针对胰岛β细胞的自身免疫反应导致的β细胞的破坏。Caloinaro F等用完全弗氏佐剂(CFA)通过非特异性免疫刺激作用纠正这种免疫功能异常，可有效降低NOD鼠糖尿病的发生率 [8] 。在人和NOD鼠均有证据显示1型糖尿病为T细胞介导的免疫性疾病，针对胰岛β细胞的损伤性自身免疫反应导致了β细胞的破坏。苏恒 [1] 等用脂质体预防NOD鼠胰岛炎的发生也很有效果。而壳聚糖是几丁质脱乙酰基的产物，甲壳低聚糖又是脱乙酰基85%以上的壳聚糖高分子降解产物。文献报道 [9] ，70%脱乙酰基几丁质有最强的免疫佐剂活性。在小鼠中可诱导特异异源杀伤T细胞。激活自然杀伤细胞(NK)，并诱导IL-1和CsF等细胞因子的产生，因此甲壳低聚糖是一种有效的非特异性免疫调节剂。它能激活补体系统，介导补体系统的生物学效应，增强巨噬细胞在免疫应答中的协同效应，从而实现机体对T细胞、NK细胞和B细胞的调节 [10] ，因此它对NOD小鼠糖尿病有一定的治疗作用是通过免疫调节来实现的。 糖尿病在我国是高发病，目前还缺少特效药，通过饮食治疗，达到降低血糖或者稳定病情的目的，不失为一种较好的控制途径，甲壳低聚糖价廉易得，无异味，无毒副作用，无免疫原性，而且由于20世纪80年代以来，国内甲壳多糖研究的兴起，由甲壳多糖开发的各种产品得到广泛的应用。完全可以作为1型糖尿病人的保健饮料，为糖尿病人带来健康或提高其生活质量。
, 百拇医药
参考文献
1 苏恒，蒋铁建，周智广.脂质体与完全弗氏佐剂预防NOD鼠胰岛炎探讨.湖南医科大学学报，2002，27(1):32-34.
2 任林，李邦良，高仕英，等.甲壳低聚糖对糖尿病小鼠血糖和肠道菌群的影响.中国生化药物的杂志，2001，22(5):227-229.
3 魏涛，唐粉芳，国豫，等.壳聚糖降脂、降糖、增强免疫作用研究.中国甲壳资源研究开发应用学术研讨会论文集，1997，11青岛.
4 李邦良，高仕英，乔新惠，等.甲壳低聚糖的制备和分析.中国生 化药物杂志，2001，22(5):227-229.
5 蒋铁建，苏恒，周智广.NOD小鼠胰岛分离与纯化的方法研究.湖南医科大学学报，2002，27(1):85-87.
, 百拇医药
6 Janjic D，Wollheim CB.Islet cells metabolism is reflected by the MTT(tetrazolium)colorimetic assay.Diabetologia，1992，35:482-485.
7 邵建华，袁振芳.游离脂肪酸促进基础状态胰岛细胞生长和分泌胰岛素.中华内科杂志，1997，12，36(12):831-832.
8 Caloinaro F，Gambelunghe G，Lafferty KJ.Protection from autoimmune diabetes by adjuvant therapy in the non-obese diabetic mouse:the role of interleukin-4and inerleukin-10.J Immunol，1993，150:2072-2080.
9 郭淑玲.合成免疫佐剂在宿主非特异性免疫刺激和增强疫苗免疫原性中的应用.国外医药·抗生素分册，1994，15(6):462-464.
10 张澄波，梅学文，都本业，等.脱乙酰壳聚糖对肿瘤及免疫系统的影响.中国实验临床免疫学杂志，1992，4(1):1-4.
作者单位:421001南华大学生物化学与分子生物教研室
(编辑晓 勇), 百拇医药(乔新惠 宋岚 李邦良 周弟先)