地塞米松对大鼠脑缺血再灌注Bcl-2蛋白及Caspase3基因的影响

http://www.100md.com 《中华中西医杂志》 2003年第22期

     【摘要】 目的 研究地塞米松对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型Bcl-2蛋白及Caspase3基因表达的影响。方法 以大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血再灌注模型。实验随机分为三组:(1)正常假手术组;(2)地塞米松组(0.5mg·kg ^-1 ·d ^-1 );(3)生理盐水组。地塞米松组与生理盐水组分别于缺血2h后再灌6h，12h，24h，48h。采用HE、免疫组化及原位杂交等方法观察地塞米松对缺血再灌性脑损伤组织病理及Bcl-2蛋白及Caspase3基因表达的影响。结果 地塞米松可加重成年大鼠缺血再灌注脑损伤，使缺血2h后再灌注各时间点Bcl-2阳性细胞数与生理盐水组相比明显减少，而表达Caspase3基因的细胞数明显增加。结论 地塞米松通过下调抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达、上调凋亡执行基因Caspase3的基因表达调控梗塞灶边缘区的细胞凋亡过程。

    关键词 脑缺血 地塞米松 Bcl-2蛋白 Caspase3基因

    【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)22-3052-03

    Effects of dexamethasone on Bcl-2protein

    and Caspase3mRNA expression of focal cerebral injury

    following ischemia and reperfusion in rats

    Meng Zhaoxiang，Shao Yankun，Wang Xinrui，et al.

    Institute of Family Planning Researching，Jilin Province，Changchun130041.

    【Abstract】 Objective To investigate effects of dexamethasone on Bcl-2protein and Caspase3mRNA ex_ˉpression of focal cerebral injury following ischemia andreperfusion.Methods Middle cerebral artery occlusion/reper_ˉfusion rat’s models were induced by using modified filament method.Three groups were divided randomly:(1)sham group;(2)dexamethasone group(0.5mg·kg ^-1 ·d ^-1 );(3)saline group;Dexamethasone and saline groups were divided into reperfusion for6hours，12hours，24hours，48hours after ischemia for2hours.HE，immunohistochemistry and in situ hybridization were performed to observe effects of dexamethasone Bcl-2protein and Caspase3mRNA expression.Results Dexamethasone treatment aftrer ischemia aggravated cerebral injury.Compared with control group Bcl-2positive cells decreased obviously，and Caspase3positive cells increased significantly.Conclusion Dexamethasone in_ˉduced cell apoptosis in cerebral infracted marginal zone with down-regulating Bcl-2protein expression and up-regulating Caspase3mRNA expression.

    Key words cerebral ischemia dexamethasone bcl-2protein caspases3gene

    由于糖皮质激素具有减轻脑水肿、降低颅内压等作用，它被广泛用于缺血性脑血管病的治疗。随着对糖皮质激素在中枢神经系统缺血性损伤过程中作用的深入研究，其全身性副作用已经受到重视，但激素在缺血性脑血管病中的应用一直是脑血管病治疗中颇有争议的问题 ^[1] 。直到二十世纪九十年代初期以Tuor等为代表的学者仍然认为糖皮质激素有减轻缺血性脑损伤的作用 ^[2] ，因此，正确评价糖皮质激素在缺血性脑损伤中的药理作用，在神经病学的基础研究和临床应用中都是一个亟待解决的课题。本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，探讨地塞米松对Bcl-2蛋白及Caspase3基因表达的影响，为糖皮质激素在缺血性脑血管病治疗中的应用提供理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，鼠龄3～4个月，体重250～300g，由吉林大学实验动物中心提供。

    1.1.2 试剂 Bcl-2多克隆抗体、SP试剂盒、caspase3原位杂交检测试剂盒、DEPC水、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，多聚赖氨酸为Sigma产品。

    1.2 方法

    1.2.1 动物模型的制备 大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型参照Nagasawa、ZeaLonga等报道的方法加以改进，采用颈外动脉插入线栓法。栓子插入深度为20mm左右，该深度恰好堵塞MCA开口。假手术组线栓深度为10mm，尼龙线未进入MCA。缺血2h后再次麻醉大鼠，拔出栓线，使血流再通。

    1.2.2 实验动物分组 随机分为三组，(1)正常假手术组;(2)地塞米松组;(3)生理盐水组。地塞米松组与生理盐水组分别于缺血2h后再灌6h，12h，24h，48h。大脑中动脉线栓法闭塞后1h开始，地塞米松组腹腔注射地塞米松(0.5mg·kg ^-1 ·h ^-1 ，地塞米松磷酸钠注射液浓度2mg/ml，0.9%氯化钠注射液稀释为0.5ml)，生理盐水组大鼠腹腔注射氯化钠注射液(0.9%，0.5ml)。

    1.2.3 神经病学评分 参照Zea Longa等的5分制评分标准进行评分:0分，无神经损伤症状;1分，不能完全伸展对侧前爪;2分，行走时向对侧(右)转圈;3分，站立不稳，向对侧(右)倾倒;4分，不能自发行走，意识丧失。累积1分以上即为成功模型。动物苏醒后，观察缺血动物的神经功能缺失症状。

    1.2.4 病理标本的制备 各组大鼠先经行为学观察，再麻醉后打开胸腔，依次以温生理盐水、4%多聚甲醛进行灌注，断头取脑。脑组织继续用10%福尔马林4℃固定24h，然后进行常规脱水、浸蜡、透明、包埋。连续冠状切片厚度5μm，切片间距500μm。常规HE染色。

    1.2.5 梗死体积判定 常规HE染色切片用LeicaQ570图像分析系统检测。计算每张冠状切片上缺血侧半球及梗死灶的面积，每个组织块缺血侧半球体积、梗死灶体积按下述公式计算:V=t1+(A1+A2)/2+t2(A2+A3)/2+……+tn-1(an-1+an)/2(注:V为体积，t为两相邻冠状面的间距，A为每一张冠状面上梗死灶面积或缺血侧半球面积，n为冠状面序列号)。分别将每个鼠脑标本的所有含梗死灶组织块的梗死灶面积、缺血侧半球体积值相加，作为该标本的梗死灶体积值和缺血侧半球体积值。梗死灶体积百分比=梗死灶体积/缺血侧半球体积(用百分比可以减少脑水肿带来的误差)。

    1.2.6 Bcl-2的免疫组化染色 切片脱蜡至水，3%H ₂ O ₂ 封闭10min，非免疫动物血清室温孵育10min，兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体孵育(1∶100)37℃1h，生物素标记羊抗兔IgG工作液37℃孵育1h，辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液孵育37℃30min，DAB显色。阴性对照用0.01mol·L -1 PBS代替一抗。

    1.2.7 Caspase3原位杂交 所有用于原位杂交的器皿、液体常规高压灭菌。步骤如下:(1)切片脱蜡入水，3%H ₂ O ₂ 室温10min，蒸馏水洗，切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃20min。0.5mol/L PBS洗，蒸馏水洗。(2)杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度，按每张切片20μl加预杂交液，37℃3h。(3)每张切片加20μl杂交液，用原位杂交专用盖玻片覆盖，40℃过夜。(4)揭掉盖玻片，37℃2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC分别洗涤，滴加封闭液30min，保持37℃。(5)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃60min。0.5mol/L PBS洗后滴加SABC，37℃20min，0.5mol/L PBS洗，滴加生物素化过氧化物酶，37℃20min，0.5mol/L PBS洗。(6)DAB发色，复染核，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

    1.2.8 统计学处理 HE、免疫组化切片在镜下定位，有DIPAS-200型细胞图像分析系统输入计算机，在显示屏上选取10幅(10个视野，分别为浅层皮质4个、深层4个以及海马2个视野)作阳性率统计。数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，组间比较采用q检验，采用SPSS和Instat软件进行数据和统计处理。

    2 结果

    2.1 动物模型的评价 MCAO后，用于再灌注观察的大鼠，于麻醉清醒后出现了轻重不同的神经功能缺损症状。其神经功能评分为2.35±1.03，但术后24h时神经功能缺损症状基本恢复。进行HE染色的大鼠脑片均出现了大小不等的梗死脱失区。应用图像分析仪对大鼠的缺血侧梗死灶面积进行分析计算，结果为(245±50.48)mm ³ ，正常对照组未见梗死灶。说明本实验成功复制了大鼠大脑中动脉缺血/再灌模型。

    2.2 HE染色 光镜下，缺血2h再灌注6h即可见神经细胞核固缩，偏移，顶树突拉长，神经元呈梭形，神经元周围水肿明显，少量神经元深染。随着再灌注时间的延长，损害范围扩大，至再灌24h时达高峰，可见大量深染的神经元细胞核，核固缩、偏位、致密，胞浆呈嗜酸性增加。基底节区可见轴索肿胀变性。坏死中心区可见神经细胞坏死，神经元外形不易辨认，大部分细胞结构消失，胞浆空泡样变性。坏死灶内大量胶质细胞增生。交界区(半影区)可见细胞核固缩明显，核深染，胞浆呈嗜酸性明显增多。地塞米松组中心坏死区及半影区范围明显大于正常组。(见图1～2)

    2.3 地塞米松对脑缺血再灌注性脑损伤Bcl-2蛋白表达的影响 假手术组偶见Bcl-2染色阳性细胞。生理盐水组再灌注6h后在缺血区边缘见Bcl-2阳性细胞，12h达高峰，48h阳性细胞数仍处于高水平。地塞米松组与同期生理盐水组比较阳性细胞数明显减少，差异有显著性。Bcl-2阳性细胞主要为神经细胞，表现为胞浆出现棕黄色颗粒，位于缺血梗塞灶的边缘。(见表1和图3～4)。

    Table-1:The number of bcl-2positive cells after cerebral

    ischemia and reperfusion(cells/10×20view)

    Notes:Values are expressed as mean±SD; a P<0.01compared with sham-operate group， b P<0.01compared with same period control group after ischemia and post-ischemic reperfusion， c P<0.05compared with same period control group after ischemia and post-ischemic reperfusion

    2.4 地塞米松对脑缺血再灌注性脑损伤caspase-3mRNA表达的影响 假手术组偶见Caspase-3染色阳性细胞，生理盐水组Caspase-3染色阳性细胞数于再灌注24h达高峰，与假手术组比较差异有显著性，地塞米松组在各时间点Caspase-3染色阳性细胞数均高于生理盐水组，差异有显著性。(见表2和图5～6)。

    Table-2:The number of Caspase-3positive cells after cerebral

    ischemia and reperfusion(cells/10×20view)

    Notes:Values are expressed as mean±SD; a P<0.01compared with sham-operate group， b P<0.01compared with same period control group after ischemia and post-ischemic reperfusion

    3 讨论

    糖皮质激素是神经科的常用药物，但由于近年来对其在中枢神经系统缺血性损伤过程中的作用存在争议，如何评价糖皮质激素的药理作用，从而正确应用是目前基础研究和临床应用都急需解决的课题。

    地塞米松是具有代表性的合成类糖皮质激素，故对糖皮质激素的研究多选用地塞米松。关于给药时间，文献报道中多为预先给药，与临床实际相距较大，本研究采用缺血早期开始给药。脑缺血治疗的重点是挽救缺血半暗带 ^[3，4] ，而公认的治疗时间窗是3～6h，所以选择缺血1h开始给药有助于评价地塞米松对缺血半暗带早期变化的作用。研究采用尾静脉直接注射的方式可以保证药物的吸收。对于甾体激素受体饱和的数量和程度与药物的作用有直接关系，有报道证实不同的饱和程度可产生不同的药理作用。因此，实验采用已经建立的地塞米松剂量与糖皮质激素受体饱和程度的模型，选择饱和90%糖皮质激素受体的地塞米松剂量作为给药剂量，该剂量也接近常用剂量。

    脑细胞缺血凋亡是缺血细胞死亡方式之一 ^[5]。在缺血再灌损伤模型中，与细胞凋亡调节有关的基因及表达产物研究较多的有c-fos原癌基因、Bcl-2基因。c-fos基因是一种促细胞凋亡基因。Bcl-2基因是目前最受重视的抗凋亡基因，研究证实Bcl-2基因缺失加重脑损伤，说明Bcl -2在缺血再灌时发挥了重要作用 ^[6] 。Velier等 ^[7] 通过动物实验也证实，Caspase家族亦可诱导细胞凋亡。Caspase3作为细胞凋亡的关键性蛋白酶，直接导致凋亡细胞解体，酶解细胞结构蛋白，切断凋亡细胞与周围细胞的联系，关闭DNA的复制与修复，降解DNA，最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体。本研究选用Bcl-2、Caspase3作为观察指标，以期评价糖皮质激素对缺血凋亡相关基因表达的影响，进而探讨糖皮质激素在缺血性脑血管疾病中的应用。

    实验结果发现，地塞米松可显著降低缺血梗塞灶边缘的Bcl-2阳性细胞数，增加Caspase3阳性细胞数。本研究进一步证实，地塞米松可通过下调抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达、上调凋亡执行基因caspase3mRNA的表达而发挥促进梗塞灶边缘区的神经细胞凋亡过程。因此，在缺血性脑血管疾病的治疗中应慎用糖皮质激素。

    参考文献

    1 王嗣欣，周丽红，腾春芳，等.皮质激素在实验性缺血性脑血管病中应用进展.国外医学神经病学神经外科学分册，2001，28(3):220-223.

    2 Tuor UI，Manley JJ，Fyfe C，et al.Dexamethasone effects on cerebral protein synthesis prior to and following hypoxia-ischemia in immature rat.Brain Res Bull，1999，48(1):61-64.

    3 Kogure T，Kogure K.Molecular and biochemical events within the brain subjected to cerebral ischemia.Clin neurosci，1997，4(4):179-183.

    4 王玉洁，张瑞君，何维为，等.脑缺血后不同时间半影区内神经元损伤的实验研究.现代康复，2001，5(6):59-60.

    5 Li Y，Chopp M，Jiang N，et al.In situ detection of DNA fragment after focal cerebral ischemia in mice.Brain Res Mol Brain Res，1995，28(1):164-168.

    6 Hata R，Gillardon F，Michaelidis TM，et al.Targeted disruption of the Bcl-2gene in mice exacerbates focal ischemic brain injury.Metab Brain Dis，1999，14(2):117-124.

    7 Velier JJ，Elisson JA，Kikly KK，et al.Caspase8a and Caspase3a reex_ˉpressed by different populations of cortical neurons undergoing delayed cell death after focal stroke in the rat.J Neurosci，1999，19(14):5932-5941.

    作者单位:130041吉林省计划生育科学技术研究所2100053首都医科大学宣武医院神经内科

    130021吉林大学病理生物学教育部重点实验室

    (编辑秋 实)(孟召祥 邵延坤 王心蕊 王越晖)

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