纳米磷灰石体外抑制肝癌作用的实验研究(基金项目)
http://www.100md.com
中华实用医药杂志 2004年1月 第4卷 第1期
基金项目:湖北省科技攻关重大项目(2002AA105A)
【摘要】 目的 探讨纳米磷灰石的抑癌机制。方法 利用sol-gel法制备出稳定单分散的纳米磷灰石体系，应用粒径电位仪和透射电镜(TEM)对纳米磷灰石进行表征;采用MTT比色法研究纳米磷灰石对细胞系Bel-7402人肝癌细胞的作用;从超微结构的改变研究其作用机制。结果 实验结果表明，纳米磷灰石在体外对Bel-7402人肝癌细胞具有明显的抑制作用。结论通过进入到癌细胞内，导致癌细胞胀亡。
关键词 纳米磷灰石 肝细胞癌 肿瘤病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)01-0004-03
Experimental study on inhibition of nanoapatite on hepatocellular carcinoma in vitro
, http://www.100md.com
Cheng Jun，Cao Xianying，Li Shipu
The First Hospital of Wuhan University of Technology，Wuhan430070.
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition mechanism of Nanoapatite on the human hepatocelluar carcinoma.Methods Stable and single-dispersed Nanoapatite were synthesized with sol-gel method.Nanoapatite were surveyed by Zataplus and TEM.Their effect on the Bel-7402human hepatoma cell lines was investigated by the MTT methods，and the mechanism was studied from changes in ultrastructure.Results The result showed that inhibition of Nanoapatite on the Bel-7402human hepatocellular carcinoma cell lines was presended obviously in vitro.Conclusion Nanoapatite entered into cancer cytoplasm，and cancer cells result in oncosis.
, 百拇医药
Key words nanoapatite hepatocellular carcinoma oncosis
纳米技术与生物技术的结合，开拓了纳米生物材料新的应用领域。无机纳米粒子在医学上的应用已经成为医学家和材料学家共同关注的焦点。文献报道 [1～8] ，某些无机纳米粒子可阻止癌细胞的增殖、抑制癌细胞的生长，而对正常细胞影响较小。为了进一步证实无机纳米粒子的抑癌生物学特性，围绕纳米粒子与肿瘤细胞之间的相互作用进行了一系列的研究。本实验选用纳米磷灰石，以细胞系Bel-7402人肝癌细胞为作用对象，探讨了纳米磷灰石的抑癌机制。
1 材料与方法
1.1 纳米磷灰石的制备及其表征 采用sol-gel法制备稳定的纳米磷灰石，用电位粒度仪(ZETASIZER3000HS，MALVERN，Britain)和透射电镜(H-600，Hitachi，Japan)分别测定其粒度分布、平均粒径、形貌和分散性。临用前常规高压灭菌，RPMI-1640培养液稀释到所需浓度。
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1.2 细胞系及其培养条件 细胞系Bel-7402人肝癌细胞，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所，由武汉大学典型培养物保藏中心保存。用RPMI-1640培养液(Gibco)，添加10%新生牛血清(Gibco)，在37℃、5%CO 2 的条件下培养，取健康的细胞进行实验。
1.3 细胞增殖特性的检测 将细胞调整浓度为1×10 6 /ml，接种于96孔培养板上。待细胞贴壁后，加入不同浓度的纳米磷灰石，置于培养箱中连续培养4天。按照噻唑蓝(MTT)法[9] 测定细胞的存活情况，用吸光度(A 570nm )值表示，并计算细胞生长抑制率。实验重复3次。实验统计结果进行t检验。抑制率IR(%)=(1-实验孔A值/对照组A值)×100%。
1.4 TEM样本制备 收集纳米磷灰石作用3天的细胞，离心后加入3%戊二醛固定，PBS清洗;1%锇酸后固定;常规脱水，包埋、聚合、修块，LKB-V超薄切片;柠檬酸铅和醋酸双氧铀双重染色;在分析透射电镜下观察细胞超微结构的变化并摄片。
, 百拇医药
2 实验结果
2.1 纳米磷灰石的粒度分布及形貌 粒度电位仪检测纳米磷灰石的平均粒径为67.5～88.3nm，粒度分布显示为一个狭窄的单峰(图1)。TEM观察纳米磷灰石呈均匀、稳定、分散的针状(图2)，平均尺寸为15nm×60nm左右。图1 纳米磷灰石的粒度分布
2.2 纳米磷灰石对肝癌细胞增殖的影响 表1显示0.7～7.0×10 -4 mol/L的纳米磷灰石作用3天后，对Bel-7402细胞的增殖抑制作用。≤3.5×10 -4 mol/L的纳米磷灰石作用图2纳米磷灰石 TEM×45K3天后抑制率仅为18.8%，而浓度超过5.6×10 -4 mol/L则对肝癌细胞的抑制作用明显增加，与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。
表1 纳米磷灰石对肝癌细胞的抑制作用
, 百拇医药
2.3 细胞超微结构的变化 Bel-7402细胞在正常培养情况下表面具有丰富的微绒毛，胞核形态不规则，核膜显示齿状或深凹陷，染色质浓密(见图3);胞浆内线粒体、滑面及粗面内质网少、变形、轻度扩张。纳米磷灰石处理3天的肝癌细胞，部分出现胞质空泡，细胞胞核染色质浓缩、边集，核膜间隙不等，胞浆溶解等(见图4)。
图3 Bel-7402细胞 TEM×8000
图4 纳米磷灰石作用后的肝癌细胞 TEM×10000
3 讨论
原发性肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，严重危胁人 类的健康。我国肝癌的发病率持高不下，目前仍采用化学药物为主的综合疗法，许多抗肝癌的化学药物通过不同的机制作用于肝癌细胞，但其疗效不佳，相互之间可产生交叉耐药性，并增加毒副作用。无机纳米粒子在抗肿瘤方面初步显示了独特的优势。纳米粒子通常是指尺度在1～100nm之间的微粒，由于其具有大的比表面积和表面能，表现出了很强的吸附性和生物活性。对纳米材料的表征，目前多采用粒度电位仪和透射电镜的进行检测。粒度电位仪是应用激光散射的方法测试粒子平均粒径和粒度分布，检测结果显示二次粒子的平均大小。我们研制的纳米磷灰石，平均粒径为67.5～88.3nm;结合透射电镜观察，颗粒生长均匀，分散性良好，纳米粒子呈单分散状态。
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MTT法的原理是:活细胞的线粒体可代谢MTT，形成不溶性的formazen，用二甲基亚砜溶解后，应用酶标仪测定特定波长下的吸光度。一般情况下，formazen的量与活细胞数相一致，因此吸光度值的大小间接反映存活的细胞数量。笔者采用MTT检测方法，探讨了纳米磷灰石对肝癌细胞的抑制作用，结果提示浓度超过5.6×10 -4 mol/L的纳米磷灰石可引起癌细胞的明显死亡，说明其具有明显的体外抗肝癌作用。而且使用较小剂量的纳米磷灰石也显示了良好的时效关系，这为临床上选用小剂量纳米磷灰石长期使用提供了实验依据，从而避免短时间使用大剂量纳米磷灰石所带来的不良反应。观察细胞超微结构的改变是目前确定细胞形态变化的最可靠方法之一。纳米磷灰石由于高的表面能以及表面存在大量缺陷，推测通过吸附在癌细胞的表面，并进入到癌细胞内，改变癌细胞的内环境，出现胞质空泡，细胞胞核染色质浓缩、边集，核膜间隙不等，胞浆溶解等改变，最后使肝癌细胞呈现既不同于细胞凋亡，也不是细胞坏死的一种死亡方式———胀亡 [10] 。
总之，体外纳米磷灰石能有效地抑制肝癌细胞株增殖。这有益于开拓纳米磷灰石的应用前景，且该药易得、价廉，因而深入研究其作用机制和体内抗癌的理想剂量，以求提高疗效，减少不良反应，无疑将有重大的临床意义。
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参考文献
1 Aoki.H.Medical applications of hydroxyapatite.Tokyyo:Takayama Press，1994，14-20.
2 Li Shipu，Zhang Shicheng，Chen Wenjie，et al.Effects of hydroxyapatite ultrafine powder on colony formation and cytoskeleton s of MGc80-3cell.Bioceramics，1996，9:225-227.
3 冯凌云，闫玉华，陈闻杰，等.羟基磷灰石溶胶对W-256癌肉瘤细胞内钙离子浓度及细胞形态结构的影响.中国生物医学工程学报，1998，17(4):374-377.
4 张士成，李世普，陈芳.羟基磷灰石超微粉对癌细胞作用的初步研究.武汉工业大学学报，1996，18(1):5-8.
, http://www.100md.com
5 Feng Lingyun，Yan Yuhua，Li Shipu，et al.Synthesis of HAP-sol by ultrasonic irradiation and its acute toxicity research.The Third Far-Eastern Symposium onBiomedical Materials，Editor:Zhang Xingdong，Aoki H.Chengdu:Kobunshi Kankokai Press，1997，158-159.
6 冯凌云，李世普，陈闻杰，等.羟基磷灰石溶胶及其对瘤细胞增殖的影响.中国有色金属学报，1999，9(3):651-654.
7 曹献英，李世普，闫玉华，等.羟基磷灰石超微粉对肝癌抑制的实验研究.北京:化学工业出版社，2000，372-375.
8 Feng Lingyun，Li Shipu，Yan Yuhua，et al.Inhibition ofNanoapatite on W-256sarcoma of rats in vivo.Chinese J.of Biomedical Engineering，2001，10:302-306.
, http://www.100md.com
9 曹献英，李世普，闫玉华，等.二氧化钛纳米粒子对人肝癌细胞抑制作用的实验研究.中华医药杂志，2002，2(10):865-867.
10 Elsasser A，Suzuki K，Schaper J.Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathpgenesis of ischemic injury and heart failure.JMol Cell Cardiol，2000，32:711-724.
作者单位:430070武汉理工大学第一医院
430070武汉理工大学生物中心
(编辑青 山), http://www.100md.com(陈筠 曹献英 李世普)
【摘要】 目的 探讨纳米磷灰石的抑癌机制。方法 利用sol-gel法制备出稳定单分散的纳米磷灰石体系，应用粒径电位仪和透射电镜(TEM)对纳米磷灰石进行表征;采用MTT比色法研究纳米磷灰石对细胞系Bel-7402人肝癌细胞的作用;从超微结构的改变研究其作用机制。结果 实验结果表明，纳米磷灰石在体外对Bel-7402人肝癌细胞具有明显的抑制作用。结论通过进入到癌细胞内，导致癌细胞胀亡。
关键词 纳米磷灰石 肝细胞癌 肿瘤病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)01-0004-03
Experimental study on inhibition of nanoapatite on hepatocellular carcinoma in vitro
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Cheng Jun，Cao Xianying，Li Shipu
The First Hospital of Wuhan University of Technology，Wuhan430070.
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition mechanism of Nanoapatite on the human hepatocelluar carcinoma.Methods Stable and single-dispersed Nanoapatite were synthesized with sol-gel method.Nanoapatite were surveyed by Zataplus and TEM.Their effect on the Bel-7402human hepatoma cell lines was investigated by the MTT methods，and the mechanism was studied from changes in ultrastructure.Results The result showed that inhibition of Nanoapatite on the Bel-7402human hepatocellular carcinoma cell lines was presended obviously in vitro.Conclusion Nanoapatite entered into cancer cytoplasm，and cancer cells result in oncosis.
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Key words nanoapatite hepatocellular carcinoma oncosis
纳米技术与生物技术的结合，开拓了纳米生物材料新的应用领域。无机纳米粒子在医学上的应用已经成为医学家和材料学家共同关注的焦点。文献报道 [1～8] ，某些无机纳米粒子可阻止癌细胞的增殖、抑制癌细胞的生长，而对正常细胞影响较小。为了进一步证实无机纳米粒子的抑癌生物学特性，围绕纳米粒子与肿瘤细胞之间的相互作用进行了一系列的研究。本实验选用纳米磷灰石，以细胞系Bel-7402人肝癌细胞为作用对象，探讨了纳米磷灰石的抑癌机制。
1 材料与方法
1.1 纳米磷灰石的制备及其表征 采用sol-gel法制备稳定的纳米磷灰石，用电位粒度仪(ZETASIZER3000HS，MALVERN，Britain)和透射电镜(H-600，Hitachi，Japan)分别测定其粒度分布、平均粒径、形貌和分散性。临用前常规高压灭菌，RPMI-1640培养液稀释到所需浓度。
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1.2 细胞系及其培养条件 细胞系Bel-7402人肝癌细胞，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所，由武汉大学典型培养物保藏中心保存。用RPMI-1640培养液(Gibco)，添加10%新生牛血清(Gibco)，在37℃、5%CO 2 的条件下培养，取健康的细胞进行实验。
1.3 细胞增殖特性的检测 将细胞调整浓度为1×10 6 /ml，接种于96孔培养板上。待细胞贴壁后，加入不同浓度的纳米磷灰石，置于培养箱中连续培养4天。按照噻唑蓝(MTT)法[9] 测定细胞的存活情况，用吸光度(A 570nm )值表示，并计算细胞生长抑制率。实验重复3次。实验统计结果进行t检验。抑制率IR(%)=(1-实验孔A值/对照组A值)×100%。
1.4 TEM样本制备 收集纳米磷灰石作用3天的细胞，离心后加入3%戊二醛固定，PBS清洗;1%锇酸后固定;常规脱水，包埋、聚合、修块，LKB-V超薄切片;柠檬酸铅和醋酸双氧铀双重染色;在分析透射电镜下观察细胞超微结构的变化并摄片。
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2 实验结果
2.1 纳米磷灰石的粒度分布及形貌 粒度电位仪检测纳米磷灰石的平均粒径为67.5～88.3nm，粒度分布显示为一个狭窄的单峰(图1)。TEM观察纳米磷灰石呈均匀、稳定、分散的针状(图2)，平均尺寸为15nm×60nm左右。图1 纳米磷灰石的粒度分布
2.2 纳米磷灰石对肝癌细胞增殖的影响 表1显示0.7～7.0×10 -4 mol/L的纳米磷灰石作用3天后，对Bel-7402细胞的增殖抑制作用。≤3.5×10 -4 mol/L的纳米磷灰石作用图2纳米磷灰石 TEM×45K3天后抑制率仅为18.8%，而浓度超过5.6×10 -4 mol/L则对肝癌细胞的抑制作用明显增加，与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。
表1 纳米磷灰石对肝癌细胞的抑制作用
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2.3 细胞超微结构的变化 Bel-7402细胞在正常培养情况下表面具有丰富的微绒毛，胞核形态不规则，核膜显示齿状或深凹陷，染色质浓密(见图3);胞浆内线粒体、滑面及粗面内质网少、变形、轻度扩张。纳米磷灰石处理3天的肝癌细胞，部分出现胞质空泡，细胞胞核染色质浓缩、边集，核膜间隙不等，胞浆溶解等(见图4)。
图3 Bel-7402细胞 TEM×8000
图4 纳米磷灰石作用后的肝癌细胞 TEM×10000
3 讨论
原发性肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，严重危胁人 类的健康。我国肝癌的发病率持高不下，目前仍采用化学药物为主的综合疗法，许多抗肝癌的化学药物通过不同的机制作用于肝癌细胞，但其疗效不佳，相互之间可产生交叉耐药性，并增加毒副作用。无机纳米粒子在抗肿瘤方面初步显示了独特的优势。纳米粒子通常是指尺度在1～100nm之间的微粒，由于其具有大的比表面积和表面能，表现出了很强的吸附性和生物活性。对纳米材料的表征，目前多采用粒度电位仪和透射电镜的进行检测。粒度电位仪是应用激光散射的方法测试粒子平均粒径和粒度分布，检测结果显示二次粒子的平均大小。我们研制的纳米磷灰石，平均粒径为67.5～88.3nm;结合透射电镜观察，颗粒生长均匀，分散性良好，纳米粒子呈单分散状态。
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MTT法的原理是:活细胞的线粒体可代谢MTT，形成不溶性的formazen，用二甲基亚砜溶解后，应用酶标仪测定特定波长下的吸光度。一般情况下，formazen的量与活细胞数相一致，因此吸光度值的大小间接反映存活的细胞数量。笔者采用MTT检测方法，探讨了纳米磷灰石对肝癌细胞的抑制作用，结果提示浓度超过5.6×10 -4 mol/L的纳米磷灰石可引起癌细胞的明显死亡，说明其具有明显的体外抗肝癌作用。而且使用较小剂量的纳米磷灰石也显示了良好的时效关系，这为临床上选用小剂量纳米磷灰石长期使用提供了实验依据，从而避免短时间使用大剂量纳米磷灰石所带来的不良反应。观察细胞超微结构的改变是目前确定细胞形态变化的最可靠方法之一。纳米磷灰石由于高的表面能以及表面存在大量缺陷，推测通过吸附在癌细胞的表面，并进入到癌细胞内，改变癌细胞的内环境，出现胞质空泡，细胞胞核染色质浓缩、边集，核膜间隙不等，胞浆溶解等改变，最后使肝癌细胞呈现既不同于细胞凋亡，也不是细胞坏死的一种死亡方式———胀亡 [10] 。
总之，体外纳米磷灰石能有效地抑制肝癌细胞株增殖。这有益于开拓纳米磷灰石的应用前景，且该药易得、价廉，因而深入研究其作用机制和体内抗癌的理想剂量，以求提高疗效，减少不良反应，无疑将有重大的临床意义。
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参考文献
1 Aoki.H.Medical applications of hydroxyapatite.Tokyyo:Takayama Press，1994，14-20.
2 Li Shipu，Zhang Shicheng，Chen Wenjie，et al.Effects of hydroxyapatite ultrafine powder on colony formation and cytoskeleton s of MGc80-3cell.Bioceramics，1996，9:225-227.
3 冯凌云，闫玉华，陈闻杰，等.羟基磷灰石溶胶对W-256癌肉瘤细胞内钙离子浓度及细胞形态结构的影响.中国生物医学工程学报，1998，17(4):374-377.
4 张士成，李世普，陈芳.羟基磷灰石超微粉对癌细胞作用的初步研究.武汉工业大学学报，1996，18(1):5-8.
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5 Feng Lingyun，Yan Yuhua，Li Shipu，et al.Synthesis of HAP-sol by ultrasonic irradiation and its acute toxicity research.The Third Far-Eastern Symposium onBiomedical Materials，Editor:Zhang Xingdong，Aoki H.Chengdu:Kobunshi Kankokai Press，1997，158-159.
6 冯凌云，李世普，陈闻杰，等.羟基磷灰石溶胶及其对瘤细胞增殖的影响.中国有色金属学报，1999，9(3):651-654.
7 曹献英，李世普，闫玉华，等.羟基磷灰石超微粉对肝癌抑制的实验研究.北京:化学工业出版社，2000，372-375.
8 Feng Lingyun，Li Shipu，Yan Yuhua，et al.Inhibition ofNanoapatite on W-256sarcoma of rats in vivo.Chinese J.of Biomedical Engineering，2001，10:302-306.
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9 曹献英，李世普，闫玉华，等.二氧化钛纳米粒子对人肝癌细胞抑制作用的实验研究.中华医药杂志，2002，2(10):865-867.
10 Elsasser A，Suzuki K，Schaper J.Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathpgenesis of ischemic injury and heart failure.JMol Cell Cardiol，2000，32:711-724.
作者单位:430070武汉理工大学第一医院
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