RP-HPLC法测定人血清中水杨酸的浓度
【摘要】 目的 建立测定人血清中水杨酸浓度的方法。方法 采用反相高效液相色谱法，HYPERSIL ODS(200mm×4.6mm，5μl)色谱柱;流动相:甲醇∶1%乙酸(45∶55);流速:0.9ml/min;检测波长:299nm;柱温:35℃。结果 水杨酸在0.51%～32.64μg/ml范围内有良好的线性关系，r=0.9999，血清中药物最低检测浓度为0.1μg/ml(S/N=3)，提取回收率为90%，血清中3种浓度回收率分别为103.92%、99.68%、99.51%，日内、日间RSD分别为3.9%、1.6%、1.0%及5.9%、3.2%、1.9%。结论 本法操作简单、快捷，方法灵敏度和准确度较高，适用于血药浓度及生物利用度的测定。
关键词 水杨酸 反相高效液相色谱法 血药浓度
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)01-0047-02
Determination of the concentrations of salicylic acid in serum with RP-HPLC
, 百拇医药
Tian Zuoming，Gao Shangwei，Cui Yanping，et al.
Liaoning Provincial Hospital，Shenyang110016.
【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for the determination ofSalicylic acid in human serum.Methods A RP-HPLC method was adopted，with the Hypersil ODS(200mm×4.6mm，5μl)column;mobile phase:methanol-1%acetic acid(45∶55);the flow rate was0.9ml/min;the detection wavelength was299nm;and the columntemperature was35℃.Results The linear range was0.5～32.64μg/ml，r=0.9999，thelowest detectable concentration in serum was0.1g/ml(s/n=3)，the extraction recovery was90%，the recovery of three kind of concentration in serum was103.92%，99.68%，99.51%separately，and the within-day and between-day RSDS was3.9%，1.6%，1.0%and5.9%，3.2%，1.9%separately.Conclusion The method is simple，sensitive，acurate and suitable for bioavailability and pharmacokinetic study of salicylic acid.
, 百拇医药
Key words salicylic acid RP-HPLC concentration in serum
阿司匹林(Asprin)即乙酰水杨酸，用于解热、镇静、抗风湿已有百年历史;近年临床广泛用于抗血小板凝聚、预防心肌梗死、动脉血栓及动脉粥样硬化等 [1] 。阿司匹林服用后在体内迅速水解为活性代谢物水杨酸。由于其作用广泛，而产生作用时体内水杨酸的浓度各异，因此建立水杨酸血药浓度监测的方法，对临床用药具有指导作用。本文建立了反相HPLC色谱法测定血清中水杨酸的浓度。本法方便、快捷，适合用于临床血药浓度测定。
1 仪器与试药
LC-10A高效液相色谱仪:HPLC系统(日本岛津LC-10A，配有SPD-10A紫外检测器，CT0-10A柱箱，LC-10AD泵，C-R6A记录仪)，Force-7高速台式离心机(美国丹法)，甲醇(色谱纯)山东禹王实业有限公司禹城化工厂;乙酸、高氯酸均为分析纯;水为重蒸馏水。
, 百拇医药
2 方法
2.1 血清样品处理 取血清样品0.5ml，置于1.5ml具塞离心管中，加入0.8ml高氯酸(6%)，涡旋振荡1min，于10000r/min离心10min，取上清液20μl进样，峰面积外标法定量计算。
2.2 色谱条件 色谱柱LHYPERSIL ODS(200mm×4.6mm，5μl，大连依利特分析仪器有限公司);流动相:甲醇∶1%乙酸(45∶55);流速:0.9ml/min;检测波长:299nm;灵敏度:0.005AUFS;柱温:35℃。进样量20μl。空白血清及样品色谱图见图1。 图1 水杨酸HPLC色谱图 A空白血清色谱图B水杨酸血清样品色谱图
2.3 标准溶液配制 精密称取水杨酸对照品102.90mg，置于250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，取得411.6μg/ml的标准储备液。精密吸取标准储备液一定量，稀释定容至2个50ml量瓶中，配成浓度为205.80μg/ml、25.74μg/ml标准溶液。
, 百拇医药
3 结果
3.1 标准曲线制备 取空白血浆7份，加入水杨酸标准溶液适量，配制成水杨酸浓度为0.51、1.02、2.04、4.08、8.16、16.32、32.64μg/ml的标准血清样品。按“2.1”项下方法操作，并进行色谱分析。以水杨酸对照品的峰面积(Y)对相应的浓度(C)进行线性回归，得标准回归曲线方程Y=0.05741+4.838X，r=0.999(N=5)，线性范围为0.51～32.64μg/ml。最低检测限为0.1μg/ml(S/N=3)。
3.2 回收率实验 取标准血清配制浓度为1.02、8.16、32.64μg/ml的水杨酸血清样品，按“2.1”项下方法操作，结果见表1。
表1 回收率试验结果加入值
3.3 精密度考察 取标准血清配制浓度为1.02、8.16、32.64μg/ml的水杨酸血清样品，按“2.1”项下方法操作，同一天内重复测定5次，同批血样连续测定数日，结果见表2。
, 百拇医药
表2精密度考察结果浓度
3.4 提取回收率考察 取标准血清配制浓度为1.02、8. 16、32.64μg/ml的水杨酸血清样品，进样得水杨酸峰面积A 1 ，配制相同浓度的水杨酸对照品，进样得水杨酸峰面积A 2 ，提取回取率=A 1 /A 2 ×100%，3种样品平均提取回收率为90%(n=5)。
4 讨论
水杨酸血药浓度测定常用紫外法和液相法。紫外法水杨酸样品提取复杂，灵敏度低;液相法报道很多 [2，3] ，但本法操作简单、快捷，流动相配制容易，样品不需提取和氮气吹干。经高氯酸蛋白沉淀后可直接进样。适用于临床血药浓度测定。试验中发现柱温对分离度和保留时间影响较大，柱温大于40℃，血清峰将影响水杨酸的分离。本方法柱温采用35℃，水杨酸与血清能很好的分离。水杨酸保留时间为9.8min。
, 百拇医药
参考文献
1 陈新谦.新编药物学，第15版.北京:人民卫生出版社，2003，180.
2 张黎，罗顺德.阿司匹林淀粉微球在兔体内的药动学.中国医院药学杂志，2001，21(4):203.
3 乔海灵，张莉蓉.阿司匹林缓释片健康人体药动学.中国医院药学杂志，2000，20(10):584.
作者单位:110016辽宁省人民医院药剂科
110023辽宁省沈阳市第五人民医院药剂科
(编辑依 依), 百拇医药(田作明)
关键词 水杨酸 反相高效液相色谱法 血药浓度
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)01-0047-02
Determination of the concentrations of salicylic acid in serum with RP-HPLC
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Tian Zuoming，Gao Shangwei，Cui Yanping，et al.
Liaoning Provincial Hospital，Shenyang110016.
【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for the determination ofSalicylic acid in human serum.Methods A RP-HPLC method was adopted，with the Hypersil ODS(200mm×4.6mm，5μl)column;mobile phase:methanol-1%acetic acid(45∶55);the flow rate was0.9ml/min;the detection wavelength was299nm;and the columntemperature was35℃.Results The linear range was0.5～32.64μg/ml，r=0.9999，thelowest detectable concentration in serum was0.1g/ml(s/n=3)，the extraction recovery was90%，the recovery of three kind of concentration in serum was103.92%，99.68%，99.51%separately，and the within-day and between-day RSDS was3.9%，1.6%，1.0%and5.9%，3.2%，1.9%separately.Conclusion The method is simple，sensitive，acurate and suitable for bioavailability and pharmacokinetic study of salicylic acid.
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Key words salicylic acid RP-HPLC concentration in serum
阿司匹林(Asprin)即乙酰水杨酸，用于解热、镇静、抗风湿已有百年历史;近年临床广泛用于抗血小板凝聚、预防心肌梗死、动脉血栓及动脉粥样硬化等 [1] 。阿司匹林服用后在体内迅速水解为活性代谢物水杨酸。由于其作用广泛，而产生作用时体内水杨酸的浓度各异，因此建立水杨酸血药浓度监测的方法，对临床用药具有指导作用。本文建立了反相HPLC色谱法测定血清中水杨酸的浓度。本法方便、快捷，适合用于临床血药浓度测定。
1 仪器与试药
LC-10A高效液相色谱仪:HPLC系统(日本岛津LC-10A，配有SPD-10A紫外检测器，CT0-10A柱箱，LC-10AD泵，C-R6A记录仪)，Force-7高速台式离心机(美国丹法)，甲醇(色谱纯)山东禹王实业有限公司禹城化工厂;乙酸、高氯酸均为分析纯;水为重蒸馏水。
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2 方法
2.1 血清样品处理 取血清样品0.5ml，置于1.5ml具塞离心管中，加入0.8ml高氯酸(6%)，涡旋振荡1min，于10000r/min离心10min，取上清液20μl进样，峰面积外标法定量计算。
2.2 色谱条件 色谱柱LHYPERSIL ODS(200mm×4.6mm，5μl，大连依利特分析仪器有限公司);流动相:甲醇∶1%乙酸(45∶55);流速:0.9ml/min;检测波长:299nm;灵敏度:0.005AUFS;柱温:35℃。进样量20μl。空白血清及样品色谱图见图1。 图1 水杨酸HPLC色谱图 A空白血清色谱图B水杨酸血清样品色谱图
2.3 标准溶液配制 精密称取水杨酸对照品102.90mg，置于250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，取得411.6μg/ml的标准储备液。精密吸取标准储备液一定量，稀释定容至2个50ml量瓶中，配成浓度为205.80μg/ml、25.74μg/ml标准溶液。
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3 结果
3.1 标准曲线制备 取空白血浆7份，加入水杨酸标准溶液适量，配制成水杨酸浓度为0.51、1.02、2.04、4.08、8.16、16.32、32.64μg/ml的标准血清样品。按“2.1”项下方法操作，并进行色谱分析。以水杨酸对照品的峰面积(Y)对相应的浓度(C)进行线性回归，得标准回归曲线方程Y=0.05741+4.838X，r=0.999(N=5)，线性范围为0.51～32.64μg/ml。最低检测限为0.1μg/ml(S/N=3)。
3.2 回收率实验 取标准血清配制浓度为1.02、8.16、32.64μg/ml的水杨酸血清样品，按“2.1”项下方法操作，结果见表1。
表1 回收率试验结果加入值
3.3 精密度考察 取标准血清配制浓度为1.02、8.16、32.64μg/ml的水杨酸血清样品，按“2.1”项下方法操作，同一天内重复测定5次，同批血样连续测定数日，结果见表2。
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表2精密度考察结果浓度
3.4 提取回收率考察 取标准血清配制浓度为1.02、8. 16、32.64μg/ml的水杨酸血清样品，进样得水杨酸峰面积A 1 ，配制相同浓度的水杨酸对照品，进样得水杨酸峰面积A 2 ，提取回取率=A 1 /A 2 ×100%，3种样品平均提取回收率为90%(n=5)。
4 讨论
水杨酸血药浓度测定常用紫外法和液相法。紫外法水杨酸样品提取复杂，灵敏度低;液相法报道很多 [2，3] ，但本法操作简单、快捷，流动相配制容易，样品不需提取和氮气吹干。经高氯酸蛋白沉淀后可直接进样。适用于临床血药浓度测定。试验中发现柱温对分离度和保留时间影响较大，柱温大于40℃，血清峰将影响水杨酸的分离。本方法柱温采用35℃，水杨酸与血清能很好的分离。水杨酸保留时间为9.8min。
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参考文献
1 陈新谦.新编药物学，第15版.北京:人民卫生出版社，2003，180.
2 张黎，罗顺德.阿司匹林淀粉微球在兔体内的药动学.中国医院药学杂志，2001，21(4):203.
3 乔海灵，张莉蓉.阿司匹林缓释片健康人体药动学.中国医院药学杂志，2000，20(10):584.
作者单位:110016辽宁省人民医院药剂科
110023辽宁省沈阳市第五人民医院药剂科
(编辑依 依), 百拇医药(田作明)