维生素C和维生素K 3 的氧化应激作用在诱导肝癌细胞凋亡中的研究
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中华中西医杂志 2003年11月 第4卷 第22期
【摘要】 目的 研究氧化应激在维生素C和维生素K 3 联合诱导人肝癌细胞凋亡作用的实验研究。方法 以Hep G2细胞株为实验对象，采用体外培养技术，MTT法观察细胞生长抑制作用;用生化方法测定丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢(H 2 O 2 )，蛋白水平指标;流式细胞仪计算凋亡率，并借助共聚焦显微镜了解细胞内钙离子水平。结果维生素C和维生素K 3 (CK 3 )能以生理剂量联合后显著抑制肝癌细胞Hep G2的生长。流式细胞仪DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”，且细胞内丙二醛和过氧化氢水平明显增高，超氧化物歧化酶水平显著降低;细胞内钙离子升高。结论 维生素C、K 3 可能通过氧化应激作用，诱导肝癌细胞凋亡。
关键词 维生素C 维生素K 3 肝胚细胞瘤G2(Hep G2) 凋亡 氧化应激 自由基 [Ca2+ ]i
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)22-3047-03
Effects of oxidative stress on apoptosis in the human hepatoblastoma
cells by the combination of vitamin C and vitamin K 3 .
Yu Yi，Ma Li
Lanzhou Medical College，Lanzhou730030.
【Abstract】 Objective To explore the effects of oxidative stress on the human hepatoblastoma G2(Hep G2)cell line apoptosis by the combination of vitamin C and vitamin K 3 .Methods On the hepatoblastoma G2(Hep G2)cell line cultured in vitro，anti-proliferation effects of Vitamin C and Vitamin K 3 were assessed with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay.The activity of superoxide dismutase(SOD)，the content of malondialdehyde(MDA)，hydrogen peroxide(H 2 O 2 )and protein in the cell were determined with biochemical method.The flow cytomˉetry was used to detect apoptotic rate，and confocal microscopy toobserve intracellular calcium concentration.Results Combination of Vitamin c and Vitamin K 3 showed a remarkable anti-proliferation on Hep G2，and a typical subˉdiploid peak before GO/G1phase was observed by flow cytometry.The content of malondialdehyde(MDA)and hydroˉgen peroxide in the cell were increased，but depleting the activity of superoxide dismutase(SOD)significantly.The levˉel of intracellular calcium concentration was step up，too.Conclusion Oxidative stress may play a great role in the Hep G2cell line apoptosis induced by combinating vitamin c and vitamin K 3 .
, 百拇医药
Key words vitamin C vitamin K 3 hepatoblastoma G2(Hep G2) apoptosis oxidative strees free radical [Ca 2+ ]i
正常生物体内自由基的产生和清除处于平衡状态，自由基可引起人体组织细胞的损伤，已为大量实验所证实，在自由基体系中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)占据主要地位，在体内的过度积累可引起基因突变 [1] ;但对于癌细胞或肿瘤细胞，过量自由基特别是活性氧类(ROS)的蓄积与细胞凋亡率的上升具有密切关系，可遏止肿瘤的发展和转移。近年来对于维生素在肿瘤预防和治疗方面所发挥的作用，引起国内外学者的广泛关注。其中，作为抗氧化剂维生素C具有抗肿瘤细胞的细胞毒活性以及诱导肿瘤细胞分化各诱导凋亡等作用。而氧化剂的维生素K 3 也可抑制人类的乳腺癌等肿瘤的生长及转移，二者联合作用 [2，4] 抑制肿瘤的发展也多有研究，是否通过诱导产生自由基，仍为值得研究的问题。
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本实验前阶段已证实维生素C、维生素K 3 联合应 用后，可诱导Hep G2细胞发生凋亡。本次研究二者联合后，是否促进自由基的产生而诱导癌细胞凋亡的抗癌作用。
1 材料与方法
1.1 材料 维生素C、维生素K 3 分析纯由北京巴斯夫公司提供，RPMI1640培养基，Gibco公司产品。人肝癌细胞株Hep G2，由西安第四军医大实验室提供。各生化测试试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 细胞及细胞培养 人肝癌细胞株Hep G2，用含10%的胎牛血清、青霉素(100U/ml)及链霉素(100μg/ml)的RPMI1640培养液培养，37℃、5%CO 2 培养。
, 百拇医药 1.2.2 MTT检测法 试验分为4组:(1)无药细胞对照组;(2)单加维生素C组:分100、250、400、500μmol/L不同浓度维生素C;(3)单加维生素K 3 组:其中分2、5、8、10μmol/L;(4)维生素C、维生素K 3 (ratio:100:2) [2] 联合用药组:100:2、250:5、400:8、500:10μmol/L。按此设计，接种于预先将对数生长期的肝癌细胞以1×10 4 /ml加入并培养24h后的96孔培养板中，使终浓度达设定浓度，每浓度设4个复孔。分别培养24h和72h后，PBS液洗2遍，每孔加入MIT10ml(1g/L)，作用4h后，加入10%SDS100μl，孵育30min，在酶标仪570nm处测吸光度A值，按以下公式计算细胞增殖抑制率(IR):IR(%)=(1-实验孔A值/对照组A值)×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集经过不同浓度药物处理的肝癌细胞Hep G2(500μmol/L VitC;10μmol/L VitK 3 ;500:10μmol/L CK3)，24、48、72h后，经PBS洗涤后，用4℃乙醇固定12h以上，离心除去乙醇，加入10g/L RNA酶溶液200μl，37℃水浴15min，加入碘化啶(PI，Sigma公司)，上FACS tarplus流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料均经lysisⅡ软件收集、贮存和分析。
, 百拇医药
1.2.4 生化指标测定 收集经过500μmol/L VitC，10μmol/L VitK 3 ，500:10μmol/LCK 3 药物处理的细胞48h后，将细胞反复冻融3次后，按照说明书进行检测其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、蛋白质、过氧化氢(H 2 O 2 )的含量。
1.2.5 激光共聚焦扫描技术观察细胞内Ca 2+ 浓度的变化，收集被处理48h后的细胞，消化，PBS液洗两遍，取50μl加PBS5μl后加FITC-3A探针12.5μl，37℃孵育30min，于激光共聚焦显微镜观察荧光，Leica SP2软件系统分析。
1.3 统计学处理 所有实验计量数据经转换后，用SPSS8.00统计软件作处理，计量数据描述用(ˉx±s)，检验采用单因素方差分析。
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2 结果
2.1 不同浓度维生素C与维生素K 3 单用或两药合用时的效应 细胞经药物作用24h，F=2.720，P=0.055，各组之间无统计学意义。其后48h F=31.026，P=0.000，72h F=10.304，P=0.000，但VitC、VitK 3 组与对照组相比，并未对肝癌细胞生长造成影响(P=0.596，P=0.134);而CK 3 组则能明显抑制肝癌细胞Hep G2的生长(P=0.000)(表1)。
2.2 细胞凋亡率无论药物单独作用，抑或联合作用，24h的细胞凋亡率与对照组F=2.853，P=0.105，未见统计学意义。CK 3 药物作用48、72h在DNA直方图上出现典型的亚二倍体的凋亡峰(图1)，与对照组比较P=0.000(见表2)。
表1 维生素C与维生素K 3 单用或两药合用时的效应
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注: ˇ P<0.05， ▲ P<0.01，VS control group(本文以下表指标均同此说明)
VitC和VitK 3 组间不同浓度对吸光度差异无显著性(P>0.05)
表2 流式细胞仪检测细胞凋亡率
2.3 生化指标测定结果(表3) H 2 O 2 各指标方差不齐，全部数据经对数转换后，F=12.612，P=0.002，各组H 2 O 2 含量与对照组比较明显升高。MDA全部数据经方差分析，F=14.187，P=0.001，VitC、VitK 3 、CK 3 组值较对照组明显升高，P值分别为0.017、0.007、0.000。T-SOD与CUZN-SOD的F值分别为16.286(P=0.001)，27.990(P=0.000)，各组值明显低于对照组，表明经药物处理48h后，细胞内丙二醛、过氧化氢含量升高，而抗氧化应激的超氧化物歧化酶下降。蛋白含量，F=4.013，P=0.052，不具有统计学意义。
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2.4 细胞内Ca 2+ 浓度变化(表4，图2) 细胞内钙离子含量是数据在经平方根转换后，F=8.751，P=0.005，CK 3 组细胞内钙含量明显高于对照组和其它两组药物组。
表3 48h各生化指标
表4 48h细胞内Ca 2+ 浓度的变化
3 讨论
当前，抗癌主要研究方向是抑制肿瘤发生、诱导肿瘤细胞的分化或凋亡 [3] 。凋亡是细胞死亡的一种方式，以保证机体的正常功能。氧化应激(Oxidative Stress)是导致化学的或代谢来源的ROS产生的一种细胞内或外的状态。适量自由基可刺激细胞生长，一旦产生过量的ROS如O 2 ·- 、H 2 O 2 、OH·、脂质过氧化物等可引起不同程度的细胞毒性，并导致瞬时的不可逆的损伤。在现已探明肿瘤细胞中氧自由基及其代谢产物明显高于正常组织，这些自由基是癌细胞内某些基因(如Ras等)生长信号传导途径的重要环节，可刺激肿瘤细胞分裂、增殖，进而影响细胞凋亡等代谢活动 [4] 。但过量自由基则极易侵害细胞脂中的不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引起脂质过氧化反应，反应中产生的自由基可以不加区别地与细胞中其它物质如蛋白质和核酸作用，造成酶、染色体DNA分子功能或结构的破坏。过氧化脂质反应的产物丙二醛(MDA)又可通过蛋白质一级氨基基团反应与蛋白质交联，造成细胞功能的破坏。
, 百拇医药
近年来有研究者发现，CK 3 可通过氧化应激 [4，7] 发挥抑瘤作用，其中与维生素C对pH值的影响及单纯还原反应无关 [5] ，维生素C可通过促进Fenton反应的发生，使得羟自由基大量积累，而羟自由基是目前已知ROS中氧化能力最强的。CK 3 促凋亡的机制初步证据显示，与细胞的ROS水平有关。综合本研究结果，在接近生理剂量的CK 3 ，细胞内ROS生成系统及清除系统的动态平衡发生变化，促使细胞内ROS水平增高，从而增加细胞凋亡率。但同时也注意到VitC、VitK 3 单独作用其脂质过氧化水平增高，但未见明显凋亡，提示在此过程中不单纯是氧化应激起作用，而是联合作用后，效果进一步加强，自由基的产生引起了一系列反应。
自由基通过引发线粒体膜脂质过氧化或细胞内形成脂质过氧化物，使线粒体膜的液态及流动性改变，导致线粒体功能障碍，高能磷酸化物产生减少，细胞丧失能量贮备。由于能量不足，依靠能量的质膜及肌浆网膜钙泵，不能将肌浆中过多的Ca 2+ 泵出或吸收入肌浆网，致细胞内Ca 2+ 浓度大为增加，终致细胞内Ca 2+ 超载。钙超载也同样会触发·OH和O 2 ·- 的过量产生(Peruche等，1993)，往复循环，导致细胞最终死亡。Ca 2+ 也是细胞内重要的信号转导分子，在细胞生 命活动中起重要的调控作用。[Ca 2+ ] i 升高常伴有肿瘤细胞增殖抑制或凋亡的发生 [8] 。用Ca 2+ 载体(如A23187，ionˉomycin等)人为的使脑瘤细胞内[Ca 2+ ]i水平升高后发现，更加证实了胞内高钙对肿瘤细胞增殖的影响 [9，10] 。本实验研究显示，CK 3 在抑制Hep G2细胞增殖的同时，细胞内钙稳态被破坏，[Ca 2+ ]i升高。故推测[Ca 2+ ]i升高及相关信号通路的变化可能参与了CK 3 对Hep G2细胞增殖抑制的调控。
, 百拇医药
正如共识，细胞凋亡是一种主动受基因凋控的细胞自杀过程，许多基因如p53，C-myc，bcl-2及其相关基因bcl-x，bax，bad等均参与凋亡的调控，凋亡信号是通过一系列细胞信号传导系统而被细胞接受的，CK 3 诱导肿瘤细胞凋亡，导致一系列氧化应激的反应，活化凋亡相关基因的参与，有关具体机制如何，尚有待进一步研究。
参考文献
1 惠宏襄，赵小宁，金明，等.自由基与细胞凋亡.生物化学与生物物理进展，1996，23:12.
2 Venugopal M，Jamison JM，Gilloteaux J，Koch JA，Summers M，Hoke J，Sowick C，Summers JL.Synergistic antitumour activity of vitamins C and K 3 against humanprostate carcinoma cell lines.Cell Biol Int，1996，20(12):787-797.
, 百拇医药
3 孙靖中，邹雄.肿瘤分子生物学.北京:人民卫生出版社，1998，127.
4 Vaux DL.Toward an understanding of the molecular mechanisms of physiological cell death.Proc Natl Acad Sci USA.1993，90(3):786-789.
5 Park CH，Amare M，Savin MA，et al.Growth Suppression of human leukemic cells in vitro by L-ascorbic acid.Cancer Res，1980，40(8):1062-10653.
6 Calderon PB，Cadrobbi J，Marques C，et al.Potential therapeutic appliˉcation of the association of vitamins C and k(3)in cancer treatment.Curr Med Chem，2002，9(24):2271-2285.
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7 JM，Gilloteaux J，Taper HS，Calderon PB，et al.Autoschizis:a novel cell death.Biochem Pharmacol，2002，63(10):1773-1783.
8 Florio T，Thellung S，Arena S，et al.Somatostatin and its analog lanˉreotide inhibit the proliferation of dispersed human non-functioning piˉtuitary adenoma cells in vitro.Eur J Endocrinol，1999，141(4):396-408.
9 Miyake H，Hara I，Yamanaka K，et al.Calcium ionophore，ionomycin inˉhibits growth of human bladder cancer cells both in vitro and in vivowith alteration of Bcl-2and Bax expression levels.J Urol，1999，162(3Pt1):916-921.
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10 Popescu BO，Cedaxo-Minguez A，Popescu LM，et al.Caspase cleavage of exon9deleted presenilin-1is an early event in apoptosis induced by calcium ionophore A23187in SH-SY5Y neuroblastoma cells.J Neurosci Res，2001，66(1):122-134.
作者单位:730030甘肃兰州医学院2001级消化专业研究生
730030兰州医学院第二附属医院消化科
(编辑运 河), 百拇医药(于忆 马 力)
关键词 维生素C 维生素K 3 肝胚细胞瘤G2(Hep G2) 凋亡 氧化应激 自由基 [Ca2+ ]i
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)22-3047-03
Effects of oxidative stress on apoptosis in the human hepatoblastoma
cells by the combination of vitamin C and vitamin K 3 .
Yu Yi，Ma Li
Lanzhou Medical College，Lanzhou730030.
【Abstract】 Objective To explore the effects of oxidative stress on the human hepatoblastoma G2(Hep G2)cell line apoptosis by the combination of vitamin C and vitamin K 3 .Methods On the hepatoblastoma G2(Hep G2)cell line cultured in vitro，anti-proliferation effects of Vitamin C and Vitamin K 3 were assessed with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay.The activity of superoxide dismutase(SOD)，the content of malondialdehyde(MDA)，hydrogen peroxide(H 2 O 2 )and protein in the cell were determined with biochemical method.The flow cytomˉetry was used to detect apoptotic rate，and confocal microscopy toobserve intracellular calcium concentration.Results Combination of Vitamin c and Vitamin K 3 showed a remarkable anti-proliferation on Hep G2，and a typical subˉdiploid peak before GO/G1phase was observed by flow cytometry.The content of malondialdehyde(MDA)and hydroˉgen peroxide in the cell were increased，but depleting the activity of superoxide dismutase(SOD)significantly.The levˉel of intracellular calcium concentration was step up，too.Conclusion Oxidative stress may play a great role in the Hep G2cell line apoptosis induced by combinating vitamin c and vitamin K 3 .
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Key words vitamin C vitamin K 3 hepatoblastoma G2(Hep G2) apoptosis oxidative strees free radical [Ca 2+ ]i
正常生物体内自由基的产生和清除处于平衡状态，自由基可引起人体组织细胞的损伤，已为大量实验所证实，在自由基体系中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)占据主要地位，在体内的过度积累可引起基因突变 [1] ;但对于癌细胞或肿瘤细胞，过量自由基特别是活性氧类(ROS)的蓄积与细胞凋亡率的上升具有密切关系，可遏止肿瘤的发展和转移。近年来对于维生素在肿瘤预防和治疗方面所发挥的作用，引起国内外学者的广泛关注。其中，作为抗氧化剂维生素C具有抗肿瘤细胞的细胞毒活性以及诱导肿瘤细胞分化各诱导凋亡等作用。而氧化剂的维生素K 3 也可抑制人类的乳腺癌等肿瘤的生长及转移，二者联合作用 [2，4] 抑制肿瘤的发展也多有研究，是否通过诱导产生自由基，仍为值得研究的问题。
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本实验前阶段已证实维生素C、维生素K 3 联合应 用后，可诱导Hep G2细胞发生凋亡。本次研究二者联合后，是否促进自由基的产生而诱导癌细胞凋亡的抗癌作用。
1 材料与方法
1.1 材料 维生素C、维生素K 3 分析纯由北京巴斯夫公司提供，RPMI1640培养基，Gibco公司产品。人肝癌细胞株Hep G2，由西安第四军医大实验室提供。各生化测试试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 细胞及细胞培养 人肝癌细胞株Hep G2，用含10%的胎牛血清、青霉素(100U/ml)及链霉素(100μg/ml)的RPMI1640培养液培养，37℃、5%CO 2 培养。
, 百拇医药 1.2.2 MTT检测法 试验分为4组:(1)无药细胞对照组;(2)单加维生素C组:分100、250、400、500μmol/L不同浓度维生素C;(3)单加维生素K 3 组:其中分2、5、8、10μmol/L;(4)维生素C、维生素K 3 (ratio:100:2) [2] 联合用药组:100:2、250:5、400:8、500:10μmol/L。按此设计，接种于预先将对数生长期的肝癌细胞以1×10 4 /ml加入并培养24h后的96孔培养板中，使终浓度达设定浓度，每浓度设4个复孔。分别培养24h和72h后，PBS液洗2遍，每孔加入MIT10ml(1g/L)，作用4h后，加入10%SDS100μl，孵育30min，在酶标仪570nm处测吸光度A值，按以下公式计算细胞增殖抑制率(IR):IR(%)=(1-实验孔A值/对照组A值)×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集经过不同浓度药物处理的肝癌细胞Hep G2(500μmol/L VitC;10μmol/L VitK 3 ;500:10μmol/L CK3)，24、48、72h后，经PBS洗涤后，用4℃乙醇固定12h以上，离心除去乙醇，加入10g/L RNA酶溶液200μl，37℃水浴15min，加入碘化啶(PI，Sigma公司)，上FACS tarplus流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料均经lysisⅡ软件收集、贮存和分析。
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1.2.4 生化指标测定 收集经过500μmol/L VitC，10μmol/L VitK 3 ，500:10μmol/LCK 3 药物处理的细胞48h后，将细胞反复冻融3次后，按照说明书进行检测其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、蛋白质、过氧化氢(H 2 O 2 )的含量。
1.2.5 激光共聚焦扫描技术观察细胞内Ca 2+ 浓度的变化，收集被处理48h后的细胞，消化，PBS液洗两遍，取50μl加PBS5μl后加FITC-3A探针12.5μl，37℃孵育30min，于激光共聚焦显微镜观察荧光，Leica SP2软件系统分析。
1.3 统计学处理 所有实验计量数据经转换后，用SPSS8.00统计软件作处理，计量数据描述用(ˉx±s)，检验采用单因素方差分析。
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2 结果
2.1 不同浓度维生素C与维生素K 3 单用或两药合用时的效应 细胞经药物作用24h，F=2.720，P=0.055，各组之间无统计学意义。其后48h F=31.026，P=0.000，72h F=10.304，P=0.000，但VitC、VitK 3 组与对照组相比，并未对肝癌细胞生长造成影响(P=0.596，P=0.134);而CK 3 组则能明显抑制肝癌细胞Hep G2的生长(P=0.000)(表1)。
2.2 细胞凋亡率无论药物单独作用，抑或联合作用，24h的细胞凋亡率与对照组F=2.853，P=0.105，未见统计学意义。CK 3 药物作用48、72h在DNA直方图上出现典型的亚二倍体的凋亡峰(图1)，与对照组比较P=0.000(见表2)。
表1 维生素C与维生素K 3 单用或两药合用时的效应
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注: ˇ P<0.05， ▲ P<0.01，VS control group(本文以下表指标均同此说明)
VitC和VitK 3 组间不同浓度对吸光度差异无显著性(P>0.05)
表2 流式细胞仪检测细胞凋亡率
2.3 生化指标测定结果(表3) H 2 O 2 各指标方差不齐，全部数据经对数转换后，F=12.612，P=0.002，各组H 2 O 2 含量与对照组比较明显升高。MDA全部数据经方差分析，F=14.187，P=0.001，VitC、VitK 3 、CK 3 组值较对照组明显升高，P值分别为0.017、0.007、0.000。T-SOD与CUZN-SOD的F值分别为16.286(P=0.001)，27.990(P=0.000)，各组值明显低于对照组，表明经药物处理48h后，细胞内丙二醛、过氧化氢含量升高，而抗氧化应激的超氧化物歧化酶下降。蛋白含量，F=4.013，P=0.052，不具有统计学意义。
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2.4 细胞内Ca 2+ 浓度变化(表4，图2) 细胞内钙离子含量是数据在经平方根转换后，F=8.751，P=0.005，CK 3 组细胞内钙含量明显高于对照组和其它两组药物组。
表3 48h各生化指标
表4 48h细胞内Ca 2+ 浓度的变化
3 讨论
当前，抗癌主要研究方向是抑制肿瘤发生、诱导肿瘤细胞的分化或凋亡 [3] 。凋亡是细胞死亡的一种方式，以保证机体的正常功能。氧化应激(Oxidative Stress)是导致化学的或代谢来源的ROS产生的一种细胞内或外的状态。适量自由基可刺激细胞生长，一旦产生过量的ROS如O 2 ·- 、H 2 O 2 、OH·、脂质过氧化物等可引起不同程度的细胞毒性，并导致瞬时的不可逆的损伤。在现已探明肿瘤细胞中氧自由基及其代谢产物明显高于正常组织，这些自由基是癌细胞内某些基因(如Ras等)生长信号传导途径的重要环节，可刺激肿瘤细胞分裂、增殖，进而影响细胞凋亡等代谢活动 [4] 。但过量自由基则极易侵害细胞脂中的不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引起脂质过氧化反应，反应中产生的自由基可以不加区别地与细胞中其它物质如蛋白质和核酸作用，造成酶、染色体DNA分子功能或结构的破坏。过氧化脂质反应的产物丙二醛(MDA)又可通过蛋白质一级氨基基团反应与蛋白质交联，造成细胞功能的破坏。
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近年来有研究者发现，CK 3 可通过氧化应激 [4，7] 发挥抑瘤作用，其中与维生素C对pH值的影响及单纯还原反应无关 [5] ，维生素C可通过促进Fenton反应的发生，使得羟自由基大量积累，而羟自由基是目前已知ROS中氧化能力最强的。CK 3 促凋亡的机制初步证据显示，与细胞的ROS水平有关。综合本研究结果，在接近生理剂量的CK 3 ，细胞内ROS生成系统及清除系统的动态平衡发生变化，促使细胞内ROS水平增高，从而增加细胞凋亡率。但同时也注意到VitC、VitK 3 单独作用其脂质过氧化水平增高，但未见明显凋亡，提示在此过程中不单纯是氧化应激起作用，而是联合作用后，效果进一步加强，自由基的产生引起了一系列反应。
自由基通过引发线粒体膜脂质过氧化或细胞内形成脂质过氧化物，使线粒体膜的液态及流动性改变，导致线粒体功能障碍，高能磷酸化物产生减少，细胞丧失能量贮备。由于能量不足，依靠能量的质膜及肌浆网膜钙泵，不能将肌浆中过多的Ca 2+ 泵出或吸收入肌浆网，致细胞内Ca 2+ 浓度大为增加，终致细胞内Ca 2+ 超载。钙超载也同样会触发·OH和O 2 ·- 的过量产生(Peruche等，1993)，往复循环，导致细胞最终死亡。Ca 2+ 也是细胞内重要的信号转导分子，在细胞生 命活动中起重要的调控作用。[Ca 2+ ] i 升高常伴有肿瘤细胞增殖抑制或凋亡的发生 [8] 。用Ca 2+ 载体(如A23187，ionˉomycin等)人为的使脑瘤细胞内[Ca 2+ ]i水平升高后发现，更加证实了胞内高钙对肿瘤细胞增殖的影响 [9，10] 。本实验研究显示，CK 3 在抑制Hep G2细胞增殖的同时，细胞内钙稳态被破坏，[Ca 2+ ]i升高。故推测[Ca 2+ ]i升高及相关信号通路的变化可能参与了CK 3 对Hep G2细胞增殖抑制的调控。
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正如共识，细胞凋亡是一种主动受基因凋控的细胞自杀过程，许多基因如p53，C-myc，bcl-2及其相关基因bcl-x，bax，bad等均参与凋亡的调控，凋亡信号是通过一系列细胞信号传导系统而被细胞接受的，CK 3 诱导肿瘤细胞凋亡，导致一系列氧化应激的反应，活化凋亡相关基因的参与，有关具体机制如何，尚有待进一步研究。
参考文献
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作者单位:730030甘肃兰州医学院2001级消化专业研究生
730030兰州医学院第二附属医院消化科
(编辑运 河), 百拇医药(于忆 马 力)