基因治疗载体的最新研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)01-0054-03
在生命进化的漫长历程中，生物体通过基因的突变来适应环境的改变，所以说生物突变是生物体进化的基础 [1] 。同时，不利的突变会造成细胞形状和功能的改变，从而导致疾病甚至死亡。人类的某些疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关，从而就引起了人们考虑从基因的角度来治疗某些用常规方法无法治疗的疾病。基因治疗(genethrapy)是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的，通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。20世纪80年代初，Anderson首先阐述了基因治疗的概况;1990年美国国立卫生研究院的Blease等成功地进行了世界上首例临床基因治疗，即腺脱氨酶(ADA)缺陷病的人体基因治疗;1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得成功。近年来，这一领域的研究取得了重大进展，基因治疗作为一种安全新的疾病治疗手段，将在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程。纵观基因治疗的整个过程，目的基因导入靶细胞并使之表达是其关键环节，因此介导的载体选择便显得格外有意义了。本文介绍了基因治疗的常用载体以及其最新的研究进展。
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1 常用的基因治疗的方法
基因治疗常用方法有两种，即体内疗法(in vivo)和体外疗法(ex vivo)。体内疗法是将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗目的，这是一种简便易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是基因转染率较低。目前研究和应用较多的还是体外疗法，即先在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物，以达到治疗目的。最常用的技术则有三种:(1)体外处理疗法:将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后再送回体内;(2)原位疗法:使用载体将目的基因直接导入靶细胞;(3)体内疗法:将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因安全有效地导入。
2 基因
治疗常用的载体有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。基因治疗载体可分两大类:病毒性载体 [2] 和非病毒性载体 [3] 。
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2.1 病毒性载体 病毒性载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等。逆转录病毒应用最早，研究也相当深入，目前仍被广泛应用。
2.1.1 逆转录病毒载体 反转录病毒(retrovirus)是一类已知的RNA病毒。该载体系统有两部分组成，一是带有外源基因的重组反转录病毒载体分子，二是能以反式提供病毒结构蛋白的包装细胞，其要求是能高效产生感染靶细胞的重组病毒颗粒，且无野生型的反转录病毒存在，后者是基因治疗安全性的关键问题。逆转录病毒载体最大优点是:(1)转染谱广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2)转入的外源基因可完全整合;(3)对细胞感染率高，达到100%;(4)感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。但也有不足之处，如:(1)只能整合至分裂相细胞;(2)可插入外源基因片断小(<10kb)，难以满足较大基因的插入;(3)病毒滴度是限制临床应用的主要方面;(4)有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能，随机整合可能产生不良作用。根据报道利用逆转录病毒作为载体来进行血友病A的基因治疗已经有了很大的进展。在累积了大量动物实验成功的经验基础上，目前已有一个运用浓缩的含双嗜性病毒外壳蛋白的假型MO-MLV病毒载体介导FⅧ在体内表达的Ⅰ期临床试验正在进行之中 [4] 。1999年Gao [4] 等人在大鼠实验中先肌肉内注射由腺病毒介导的肝细胞生长因子基因(HGF)，然后经逆转录病毒转染目标基因，观察其表达情况。在研究组中发现血液和肝内有高水平的HGF表达，且测得3%～12%肝细胞进行分裂。肌肉内注射腺病毒介导的HGF在第1天浓度最高，此时立刻输注逆转录病毒介导的β半乳糖苷酶(目标基因)，约有8%肝细胞被转染。这一研究成果给临床伴有肝纤维化、肝功失代偿的患者带来一丝曙光。根据逆转录病毒的亲嗜性不同，可将其分为单嗜性逆转录病毒、兼嗜性逆转录病毒和异嗜性逆转录病毒3类，目前研究使用较多的是兼嗜性逆转录病毒。
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2.1.2 腺病毒载体 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，可以感染非分裂期细胞，在体内疗法的基因转移中具有很大的优势，而且由于其感染细胞时DNA不整合到宿主染色体上，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，制备容易，操作简单，因此倍受人们关注。腺病毒(adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体由Ad5和Ad2构建而来，载体需要在其包装系的帮助下扩增，另外，通过同源重组的方法，与一带外源基因和适当的腺病毒序列的质粒共转染，亦可产生载体。近年来，利用Ad载体对各种载体进行体外转移，并用动物实验也取得了满意结果。此外，临床上已运用Ad载体系统对囊性纤维病进行基因治疗，取得良好的效果。因此Ad载体具有以下优点:(1)人类是Ad的自然宿主，因此比较安全;(2)靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，也能感染非分裂细胞，它可介导体内多种组织的基因转移，如肺、脑、肌肉、神经系统、血管等;(3)滴度高，可达1011～1012pfu/ml;(4)可在肠道及呼吸道内繁殖，其重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方式给予，已达到有效的基因转移和治疗;(5)该载体没有包膜，不易被其补体所灭活，可直接在体内应用。但载体也有不足之处:(1)基因转移缺乏特异性。(2)载体是一种非整合载体，对于非分裂相细胞，其介导的基因转移可持续表达几个月，但对于增殖旺盛的细胞，要达到长期的基因表达，则需重复给予;(3)重复给予时机体可能产生免疫应答，影响基因表达和治疗效果。产生免疫反应的机制主要和TCD4+、CTLS介导的免疫有关。B淋巴细胞也可能参与 [5] 。最新研究发现免疫反应早期先有炎症介质(CXC、CC、MCP1，2、IP10等)聚集，然后吸引中性粒细胞、CD11b加细胞参与介导免疫反应。为克服免疫反应，人们采取一些对策:(1)小剂量免疫抑制剂(环磷酰胺、FK506)、CTLA4Ig、抗CD40抗体等都能延长基因表达的时间 [6] 。(2)诱导免疫耐受:在新生小鼠的胸腺内注射腺病毒或腺病毒蛋白质外壳或受腺病毒感染的肝细胞，使T细胞对其不能发生免疫应答 [7] 。(3)对腺病毒载体进行修饰、改进以消除或减少免疫反应。
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2.1.3 腺相关病毒载体 腺相关病毒因其能将外源基因定点整合至宿主细胞上，因而具有一般病毒载体所不具有的特性。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)单链DNA病毒，是一种缺陷型病毒，只有与腺病毒、单纯疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。与其他载体病毒相比:(1)AAV无致病性，并且在受染体上不会引发免疫反应;(2)宿主范围广，并可感染非分裂细胞;(3)AAV载体可将外源基因定点整合到人类19号染色体长臂，基因表达稳定;(4)AAV是一种无包膜病毒，对各种理化处理稳定，易于分离纯化。腺相关病毒也有一些缺陷，如病毒滴度低，感染效率低，外源基因容量小及病毒对细胞毒性。腺相关病毒载体目前已应用于临床治疗囊性纤维化病。
2.1.4 牛痘苗病毒 牛痘病毒(vaccinia virus)是一种有包膜的双链DNA病毒，分子量大，180～220kb，基因组特点为 [8] :(1)DNA末端的发夹结构;(2)DNA末端的反向重复序列;(3)具有保守区与变异区。可感染多种组织，其整合率低，可供短期的基因表达。牛痘苗病毒具有可感染静息期细胞、基因不整合在宿主染色体上、外源基因整体容量大等特点。主要缺点是引发免疫反应，使重复给药成问题。目前正在研制一种重组牛痘病毒载体，可插入并表达多个基因，易转染多种肿瘤细胞，并可高效表达目的基因。
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2.1.5 单纯疱疹病毒载体 单纯疱疹病毒载体(herps simplex virus HSV)是一种长约152kb的双链DNA病毒，可在受染细胞的核中复制。HSV载体具有以下优点;(1)宿主细胞广泛;(2)病毒滴度高;(3)外源基因容量大;(4)对神经细胞具有嗜向性，可在神经元细胞中建立终生潜伏性感染。HSV载体的不足之处在于它的毒性。Miyanohara等 [9] 利用HSV治疗Ⅸ因子缺乏(丙型血友病)获得成功，但IX因子表达并不持久。此外，HSV/AVV重组病毒似乎能延长基因表达(7d)，但随之又很快出现针对靶细胞的炎症和免疫反应。其它，人们利用肝炎病毒、HIV病毒作为载体直接注射肝叶获长期表达，但对其安全性还有待进一步证实。
2.1.6 噬菌体载体 近年来，噬菌体因其高增殖、安全、大容量等特性而受到人们重视，但由于噬菌体缺乏对哺乳类细胞的趋向性而受到限制。1998年Palillard [10] 等人设计出生物素-亲合素系统，利用M13噬菌体通过成纤维生长因子(FGF)介导连接靶细胞(图1)，从而达到目标基因的转移。但缺点是:(1)转染率低，目前实验仅有1%的细胞受转染;(2)易被肝吞噬细胞破坏;(3)易产生免疫反应。可采取的措施有:置换FGF为上皮生长因子(EGF)增强与靶细胞表面受体结合力;针对不同细胞表面的受体，连接相应“导弹”来提高特异性。还可利用其免疫源性作为疫苗载体而加强效果。 FGF为成纤维生长因子(连接靶细胞);B为生物素;A为亲和体;M 13 为噬菌体图1 噬菌体载体示意图
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当然，各种病毒性载体也各自具有缺点，目前最需要解决的问题，也是所有病毒性载体均存在的缺陷在于它们的靶向性和组织特异性差，可控性弱，对现有病毒性载体加以改良并得到能在临床上有效应用、靶向性好、组织特异性强且可精确调控的病毒性载体还需要做大量工作。目前为达到靶向性和精确调控的主要手段有:(1)将目的基因特异地导入靶细胞，即基因转移的靶向性 [11] 。其方法是:受体-配体或抗原-抗体介导的靶向基因转移以及病毒介导的靶向基因转移。而且以上两种方法是可以相互结合的。这对靶细胞表面没有特异表达的受体或其特异受体的表达水平不够高的情况尤其适用;(2)调控已导入靶细胞的目的基因，使之在特定的组织器官中表达，即达到基因表达的靶向性。其方法主要是利用组织特异性的基因启动子限制目的基因只在靶细胞内表达。最近，Hou等 [12] 将氯霉素乙酰基转移酶基因(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)置于骨钙素基因启动子的控制之下，转染粘着性骨髓细胞(adherentmarrowcells)，静脉输注经转染的骨髓细胞后，证实尽管骨髓细胞分布于各种组织内，但CAT基因仅在骨组织中表达;(3)控制目的基因表达的时间和表达的水平，即基因表达的时相性。目前大都是采用可口服的、非毒性的小分子药物如四环素、RU486、蜕皮激素(ecdysone)等来控制一个经基因工程修饰的转录因子，通过该转录因子来调控目的基因的表达。转录因子一般由专门设计的针对目的基因DNA的结合区域和一些其它转录因子的效应区域融合而成。服用这些小分子药物后，目的基因的表达可以在短时间内达到很高的水平，而且可以通过小分子药物给予的时间和剂量来调控目的基因的表达时间和表达水平;而不服用这类药物时，基因不表达或只有低水平的表达 [13] ;(4)用野生的正常的基因原位修复功能缺陷的或突变的基因，即突变基因的原位修复。人工合成一条含68个碱基的寡核苷酸链，使其一端能翻折回来与另一端配对形成假双链的结构。“双链”的两端是多聚T发夹(hairpin)，在其3′端还有G:C钳(clamp)，这种结构可以增加分子的化学和热力学稳定性，以及增强对细胞内各种核酶的抵抗力。“双链”中的一条链全为DNA，另一条链同时含有RNA和DNA，其中中央的5个碱基为DNA，两侧各是10个RNA，最中央的一个DNA就是用来修复突变基因的碱基。这项技术在体外修复镰刀状细胞贫血的基因突变 [14] 和体内修正鼠凝血因子基因的突变已经成功。Bandyopadhyay等 [15] 的研究显示这种方法的原位修复能力可以达到48%，而且这种修复后的基因很稳定，表达水平也正常，且在注射嵌合体分子后46周进行检测，修复率没有变化。
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当然无论哪种方法都有自己的缺陷:利用受体来获得靶向性并不总能成功，因为配体的插入会影响载体的空间结构，使其介导的载体构象变化在随后的内吞过程中不能发生改变，内吞后的内吞体很容易和细胞内的溶酶体融合，使目的基因被酶降解。使用外源性启动子或外源性DNA序列对于基因的长期表达也存在障碍，因为机体能识别外源性序列并降解它们。应尽量使用人源性序列以避免这种情况，然而这并不总是可以做到的。
2.2 非病毒性载体 目前常用的非病毒性载体包括脂质体、裸露DNA、DNA包装颗粒、多聚阳离子型载体等，它们都能进行自我复制，无免疫原性，但基因转移组织特异性和靶向性差，转染效率低。近年来发展起来的应用分子结合(molecularconjugates) [16] ，是由一些能与核酸结合的蛋白或配体介导的基因转移，它克服了以上载体的缺点，受到广泛关注，如去唾液酸糖蛋白-多聚赖氨酸共价连接物与DNA分子结合形成复合物颗粒成功的将外源基因导入体外培养的肝细胞，以及转铁蛋白和多聚赖氨酸的复合物等。Ruth等建立了表皮生长因子(EFG)介导的基因转染系统，成功的将外源基因转移至肺癌细胞;顾健人院士实验室已成功地建立了(EFG)介导的基因转染系统;汤建教授实验室的基因缝线技术为心血管疾病的基因治疗提供了新的技术方法。
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2.3 基因导入的新途径-基因枪技术 基因枪技术是近年来发展起来的一种能够快速介导基因转染技术。DNA可通过共沉淀粘附于金颗粒上，然后使用电火花或加压气体作为动力将其“射入”皮肤表层细胞或皮肤肿瘤内，这种动力装置称为基因枪。在动物模型上，基因枪转移DNA疫苗相当有效，因完成一个免疫反应仅需短暂的抗原表达，该法因其DNA穿入深度有限而仅限于表层细胞，而皮肤表层富含抗原，是理想的靶位置。这种DNA转移系统简单、安全、制备方便。Janssen等应用基因枪技术成功的开展了IL-12基因治疗肿瘤的研究;Widern等通过基因枪将携带抗原基因的质粒导入上皮细胞并使之有效表达，诱导出明显的体液和细胞免疫反应。
除了基因枪技术，还有几种新的基因转移途径，例如DNA-磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体介导、受体介导转移、DNA直接注射等。这里就不一一详述了。自从1989年人类首例基因治疗临床试验方案在美国批准实施以来，截至1998年底，世界范围内已有373个临床方案被实施，累计3134人接受了基因转移试验 [17] ，充分显示了其巨大开发潜力和应用前景。基因治疗这一新技术的出现将推动21世纪医学革命性变革，作为一种全新的医学生物学概念和治疗手段正走向临床，成为新世纪医疗新的增长点。由此，世界上几家大的国际性制药公司都早已成立了基因治疗开发部，斥巨资投入基因治疗研究。作为基因治疗的关键———载体的商业性生产将是基因治疗飞速发展的重要环节。基因治疗的目的基因、靶细胞的选择要由具体病例来决定，而只有载体有较强的通用性，可以大规模生产，才能满足基因治疗飞速发展的需要。人类基因治疗正处于发展的初级阶段，但已为许多疾病特别是遗传病的治疗及防治提供了可能性。随着基础及临床医学研究的发展，基因治疗将成为未来疾病治疗的一个重要领域。殷切期望中国的载体商业性开发能为我国21世纪基因治疗 事业带来一个惊喜。
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参考文献
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13 Rivera VM，Ye X，Courage NL，et al.Long-term regulated expression of growth horm one in mice after intramuscular gene transfer.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96:8657-8662.
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15 Bandyopadhyay P，Ma XM，L inehau-Stieers C，et al.Nucleotide exchange in genomic DNA of rat hepacytes using RNA/DNA oligonucleotide，targeted delivery of liposom es and polyethyleneimine to the asialoglycoprotein receptor.J Biol Chem，1999，274:10163-10172.
16 沈裕康.基因治疗研究进展.上海医药，1999，20:31-33.
17 陆华中，卢大儒，薛京伦.基因治疗:10年回顾与中国之发展浅析.高科技通，2000，1:104-107.
作者单位:250013山东省济南市中心医院
(编辑罗 彬), http://www.100md.com(邱丽筠)
在生命进化的漫长历程中，生物体通过基因的突变来适应环境的改变，所以说生物突变是生物体进化的基础 [1] 。同时，不利的突变会造成细胞形状和功能的改变，从而导致疾病甚至死亡。人类的某些疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关，从而就引起了人们考虑从基因的角度来治疗某些用常规方法无法治疗的疾病。基因治疗(genethrapy)是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的，通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。20世纪80年代初，Anderson首先阐述了基因治疗的概况;1990年美国国立卫生研究院的Blease等成功地进行了世界上首例临床基因治疗，即腺脱氨酶(ADA)缺陷病的人体基因治疗;1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得成功。近年来，这一领域的研究取得了重大进展，基因治疗作为一种安全新的疾病治疗手段，将在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程。纵观基因治疗的整个过程，目的基因导入靶细胞并使之表达是其关键环节，因此介导的载体选择便显得格外有意义了。本文介绍了基因治疗的常用载体以及其最新的研究进展。
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1 常用的基因治疗的方法
基因治疗常用方法有两种，即体内疗法(in vivo)和体外疗法(ex vivo)。体内疗法是将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗目的，这是一种简便易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是基因转染率较低。目前研究和应用较多的还是体外疗法，即先在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物，以达到治疗目的。最常用的技术则有三种:(1)体外处理疗法:将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后再送回体内;(2)原位疗法:使用载体将目的基因直接导入靶细胞;(3)体内疗法:将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因安全有效地导入。
2 基因
治疗常用的载体有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。基因治疗载体可分两大类:病毒性载体 [2] 和非病毒性载体 [3] 。
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2.1 病毒性载体 病毒性载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等。逆转录病毒应用最早，研究也相当深入，目前仍被广泛应用。
2.1.1 逆转录病毒载体 反转录病毒(retrovirus)是一类已知的RNA病毒。该载体系统有两部分组成，一是带有外源基因的重组反转录病毒载体分子，二是能以反式提供病毒结构蛋白的包装细胞，其要求是能高效产生感染靶细胞的重组病毒颗粒，且无野生型的反转录病毒存在，后者是基因治疗安全性的关键问题。逆转录病毒载体最大优点是:(1)转染谱广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2)转入的外源基因可完全整合;(3)对细胞感染率高，达到100%;(4)感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。但也有不足之处，如:(1)只能整合至分裂相细胞;(2)可插入外源基因片断小(<10kb)，难以满足较大基因的插入;(3)病毒滴度是限制临床应用的主要方面;(4)有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能，随机整合可能产生不良作用。根据报道利用逆转录病毒作为载体来进行血友病A的基因治疗已经有了很大的进展。在累积了大量动物实验成功的经验基础上，目前已有一个运用浓缩的含双嗜性病毒外壳蛋白的假型MO-MLV病毒载体介导FⅧ在体内表达的Ⅰ期临床试验正在进行之中 [4] 。1999年Gao [4] 等人在大鼠实验中先肌肉内注射由腺病毒介导的肝细胞生长因子基因(HGF)，然后经逆转录病毒转染目标基因，观察其表达情况。在研究组中发现血液和肝内有高水平的HGF表达，且测得3%～12%肝细胞进行分裂。肌肉内注射腺病毒介导的HGF在第1天浓度最高，此时立刻输注逆转录病毒介导的β半乳糖苷酶(目标基因)，约有8%肝细胞被转染。这一研究成果给临床伴有肝纤维化、肝功失代偿的患者带来一丝曙光。根据逆转录病毒的亲嗜性不同，可将其分为单嗜性逆转录病毒、兼嗜性逆转录病毒和异嗜性逆转录病毒3类，目前研究使用较多的是兼嗜性逆转录病毒。
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2.1.2 腺病毒载体 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，可以感染非分裂期细胞，在体内疗法的基因转移中具有很大的优势，而且由于其感染细胞时DNA不整合到宿主染色体上，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，制备容易，操作简单，因此倍受人们关注。腺病毒(adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体由Ad5和Ad2构建而来，载体需要在其包装系的帮助下扩增，另外，通过同源重组的方法，与一带外源基因和适当的腺病毒序列的质粒共转染，亦可产生载体。近年来，利用Ad载体对各种载体进行体外转移，并用动物实验也取得了满意结果。此外，临床上已运用Ad载体系统对囊性纤维病进行基因治疗，取得良好的效果。因此Ad载体具有以下优点:(1)人类是Ad的自然宿主，因此比较安全;(2)靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，也能感染非分裂细胞，它可介导体内多种组织的基因转移，如肺、脑、肌肉、神经系统、血管等;(3)滴度高，可达1011～1012pfu/ml;(4)可在肠道及呼吸道内繁殖，其重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方式给予，已达到有效的基因转移和治疗;(5)该载体没有包膜，不易被其补体所灭活，可直接在体内应用。但载体也有不足之处:(1)基因转移缺乏特异性。(2)载体是一种非整合载体，对于非分裂相细胞，其介导的基因转移可持续表达几个月，但对于增殖旺盛的细胞，要达到长期的基因表达，则需重复给予;(3)重复给予时机体可能产生免疫应答，影响基因表达和治疗效果。产生免疫反应的机制主要和TCD4+、CTLS介导的免疫有关。B淋巴细胞也可能参与 [5] 。最新研究发现免疫反应早期先有炎症介质(CXC、CC、MCP1，2、IP10等)聚集，然后吸引中性粒细胞、CD11b加细胞参与介导免疫反应。为克服免疫反应，人们采取一些对策:(1)小剂量免疫抑制剂(环磷酰胺、FK506)、CTLA4Ig、抗CD40抗体等都能延长基因表达的时间 [6] 。(2)诱导免疫耐受:在新生小鼠的胸腺内注射腺病毒或腺病毒蛋白质外壳或受腺病毒感染的肝细胞，使T细胞对其不能发生免疫应答 [7] 。(3)对腺病毒载体进行修饰、改进以消除或减少免疫反应。
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2.1.3 腺相关病毒载体 腺相关病毒因其能将外源基因定点整合至宿主细胞上，因而具有一般病毒载体所不具有的特性。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)单链DNA病毒，是一种缺陷型病毒，只有与腺病毒、单纯疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。与其他载体病毒相比:(1)AAV无致病性，并且在受染体上不会引发免疫反应;(2)宿主范围广，并可感染非分裂细胞;(3)AAV载体可将外源基因定点整合到人类19号染色体长臂，基因表达稳定;(4)AAV是一种无包膜病毒，对各种理化处理稳定，易于分离纯化。腺相关病毒也有一些缺陷，如病毒滴度低，感染效率低，外源基因容量小及病毒对细胞毒性。腺相关病毒载体目前已应用于临床治疗囊性纤维化病。
2.1.4 牛痘苗病毒 牛痘病毒(vaccinia virus)是一种有包膜的双链DNA病毒，分子量大，180～220kb，基因组特点为 [8] :(1)DNA末端的发夹结构;(2)DNA末端的反向重复序列;(3)具有保守区与变异区。可感染多种组织，其整合率低，可供短期的基因表达。牛痘苗病毒具有可感染静息期细胞、基因不整合在宿主染色体上、外源基因整体容量大等特点。主要缺点是引发免疫反应，使重复给药成问题。目前正在研制一种重组牛痘病毒载体，可插入并表达多个基因，易转染多种肿瘤细胞，并可高效表达目的基因。
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2.1.5 单纯疱疹病毒载体 单纯疱疹病毒载体(herps simplex virus HSV)是一种长约152kb的双链DNA病毒，可在受染细胞的核中复制。HSV载体具有以下优点;(1)宿主细胞广泛;(2)病毒滴度高;(3)外源基因容量大;(4)对神经细胞具有嗜向性，可在神经元细胞中建立终生潜伏性感染。HSV载体的不足之处在于它的毒性。Miyanohara等 [9] 利用HSV治疗Ⅸ因子缺乏(丙型血友病)获得成功，但IX因子表达并不持久。此外，HSV/AVV重组病毒似乎能延长基因表达(7d)，但随之又很快出现针对靶细胞的炎症和免疫反应。其它，人们利用肝炎病毒、HIV病毒作为载体直接注射肝叶获长期表达，但对其安全性还有待进一步证实。
2.1.6 噬菌体载体 近年来，噬菌体因其高增殖、安全、大容量等特性而受到人们重视，但由于噬菌体缺乏对哺乳类细胞的趋向性而受到限制。1998年Palillard [10] 等人设计出生物素-亲合素系统，利用M13噬菌体通过成纤维生长因子(FGF)介导连接靶细胞(图1)，从而达到目标基因的转移。但缺点是:(1)转染率低，目前实验仅有1%的细胞受转染;(2)易被肝吞噬细胞破坏;(3)易产生免疫反应。可采取的措施有:置换FGF为上皮生长因子(EGF)增强与靶细胞表面受体结合力;针对不同细胞表面的受体，连接相应“导弹”来提高特异性。还可利用其免疫源性作为疫苗载体而加强效果。 FGF为成纤维生长因子(连接靶细胞);B为生物素;A为亲和体;M 13 为噬菌体图1 噬菌体载体示意图
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当然，各种病毒性载体也各自具有缺点，目前最需要解决的问题，也是所有病毒性载体均存在的缺陷在于它们的靶向性和组织特异性差，可控性弱，对现有病毒性载体加以改良并得到能在临床上有效应用、靶向性好、组织特异性强且可精确调控的病毒性载体还需要做大量工作。目前为达到靶向性和精确调控的主要手段有:(1)将目的基因特异地导入靶细胞，即基因转移的靶向性 [11] 。其方法是:受体-配体或抗原-抗体介导的靶向基因转移以及病毒介导的靶向基因转移。而且以上两种方法是可以相互结合的。这对靶细胞表面没有特异表达的受体或其特异受体的表达水平不够高的情况尤其适用;(2)调控已导入靶细胞的目的基因，使之在特定的组织器官中表达，即达到基因表达的靶向性。其方法主要是利用组织特异性的基因启动子限制目的基因只在靶细胞内表达。最近，Hou等 [12] 将氯霉素乙酰基转移酶基因(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)置于骨钙素基因启动子的控制之下，转染粘着性骨髓细胞(adherentmarrowcells)，静脉输注经转染的骨髓细胞后，证实尽管骨髓细胞分布于各种组织内，但CAT基因仅在骨组织中表达;(3)控制目的基因表达的时间和表达的水平，即基因表达的时相性。目前大都是采用可口服的、非毒性的小分子药物如四环素、RU486、蜕皮激素(ecdysone)等来控制一个经基因工程修饰的转录因子，通过该转录因子来调控目的基因的表达。转录因子一般由专门设计的针对目的基因DNA的结合区域和一些其它转录因子的效应区域融合而成。服用这些小分子药物后，目的基因的表达可以在短时间内达到很高的水平，而且可以通过小分子药物给予的时间和剂量来调控目的基因的表达时间和表达水平;而不服用这类药物时，基因不表达或只有低水平的表达 [13] ;(4)用野生的正常的基因原位修复功能缺陷的或突变的基因，即突变基因的原位修复。人工合成一条含68个碱基的寡核苷酸链，使其一端能翻折回来与另一端配对形成假双链的结构。“双链”的两端是多聚T发夹(hairpin)，在其3′端还有G:C钳(clamp)，这种结构可以增加分子的化学和热力学稳定性，以及增强对细胞内各种核酶的抵抗力。“双链”中的一条链全为DNA，另一条链同时含有RNA和DNA，其中中央的5个碱基为DNA，两侧各是10个RNA，最中央的一个DNA就是用来修复突变基因的碱基。这项技术在体外修复镰刀状细胞贫血的基因突变 [14] 和体内修正鼠凝血因子基因的突变已经成功。Bandyopadhyay等 [15] 的研究显示这种方法的原位修复能力可以达到48%，而且这种修复后的基因很稳定，表达水平也正常，且在注射嵌合体分子后46周进行检测，修复率没有变化。
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当然无论哪种方法都有自己的缺陷:利用受体来获得靶向性并不总能成功，因为配体的插入会影响载体的空间结构，使其介导的载体构象变化在随后的内吞过程中不能发生改变，内吞后的内吞体很容易和细胞内的溶酶体融合，使目的基因被酶降解。使用外源性启动子或外源性DNA序列对于基因的长期表达也存在障碍，因为机体能识别外源性序列并降解它们。应尽量使用人源性序列以避免这种情况，然而这并不总是可以做到的。
2.2 非病毒性载体 目前常用的非病毒性载体包括脂质体、裸露DNA、DNA包装颗粒、多聚阳离子型载体等，它们都能进行自我复制，无免疫原性，但基因转移组织特异性和靶向性差，转染效率低。近年来发展起来的应用分子结合(molecularconjugates) [16] ，是由一些能与核酸结合的蛋白或配体介导的基因转移，它克服了以上载体的缺点，受到广泛关注，如去唾液酸糖蛋白-多聚赖氨酸共价连接物与DNA分子结合形成复合物颗粒成功的将外源基因导入体外培养的肝细胞，以及转铁蛋白和多聚赖氨酸的复合物等。Ruth等建立了表皮生长因子(EFG)介导的基因转染系统，成功的将外源基因转移至肺癌细胞;顾健人院士实验室已成功地建立了(EFG)介导的基因转染系统;汤建教授实验室的基因缝线技术为心血管疾病的基因治疗提供了新的技术方法。
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2.3 基因导入的新途径-基因枪技术 基因枪技术是近年来发展起来的一种能够快速介导基因转染技术。DNA可通过共沉淀粘附于金颗粒上，然后使用电火花或加压气体作为动力将其“射入”皮肤表层细胞或皮肤肿瘤内，这种动力装置称为基因枪。在动物模型上，基因枪转移DNA疫苗相当有效，因完成一个免疫反应仅需短暂的抗原表达，该法因其DNA穿入深度有限而仅限于表层细胞，而皮肤表层富含抗原，是理想的靶位置。这种DNA转移系统简单、安全、制备方便。Janssen等应用基因枪技术成功的开展了IL-12基因治疗肿瘤的研究;Widern等通过基因枪将携带抗原基因的质粒导入上皮细胞并使之有效表达，诱导出明显的体液和细胞免疫反应。
除了基因枪技术，还有几种新的基因转移途径，例如DNA-磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体介导、受体介导转移、DNA直接注射等。这里就不一一详述了。自从1989年人类首例基因治疗临床试验方案在美国批准实施以来，截至1998年底，世界范围内已有373个临床方案被实施，累计3134人接受了基因转移试验 [17] ，充分显示了其巨大开发潜力和应用前景。基因治疗这一新技术的出现将推动21世纪医学革命性变革，作为一种全新的医学生物学概念和治疗手段正走向临床，成为新世纪医疗新的增长点。由此，世界上几家大的国际性制药公司都早已成立了基因治疗开发部，斥巨资投入基因治疗研究。作为基因治疗的关键———载体的商业性生产将是基因治疗飞速发展的重要环节。基因治疗的目的基因、靶细胞的选择要由具体病例来决定，而只有载体有较强的通用性，可以大规模生产，才能满足基因治疗飞速发展的需要。人类基因治疗正处于发展的初级阶段，但已为许多疾病特别是遗传病的治疗及防治提供了可能性。随着基础及临床医学研究的发展，基因治疗将成为未来疾病治疗的一个重要领域。殷切期望中国的载体商业性开发能为我国21世纪基因治疗 事业带来一个惊喜。
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作者单位:250013山东省济南市中心医院
(编辑罗 彬), http://www.100md.com(邱丽筠)