拉米夫定抗乙肝病毒治疗及YMDD变异的研究
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)08-0697-03
我国是乙型肝炎高发区，约有2700万需要抗病毒治疗的慢性肝病患者。长期以来，干扰素-α是治疗慢性乙肝较有效的药物，但总的应答率较低，非选择病人中仅有20%～30%HBeAg消失，经过筛选的病人疗效也仅有40%～60%的疗效，且临床应用范围较为狭窄，副作用明显，故影响其临床应用。近年出现的新抗病毒药物拉米夫定(Lamivudine)具有明显的抗病毒活性，是目前临床应用较多的药物。现综述如下。
1 拉米夫定的抗HBV机制
拉米夫定(化学名称为:2，3-双脱氧-3-硫胞苷)作为一种胞嘧啶核苷类似物，是RNA逆转录酶的有效抑制剂，通过抑制HBV-DNA聚合酶而减少复制中间体，阻断DNA的合成，使HBV感染不能持续。
拉米夫定是通过结合到新合成的病毒DNA中来直接抑制病毒合成，这种结合使DNA链的延长终止，并且竞争性抑制HBV编码的聚合酶，从而发挥很强的抑制HBV复制的作用 [1] 。它与病毒多聚酶结合后，竞争抑制了多聚酶活性，同时造成了HBV-DNA链合成终止，从而抑制病毒复制。
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2 拉米夫定的治疗效应
Nery等报道40例HBV感染者因慢性晚期肝病而行肝脏移植术，手术前后均予拉米夫定治疗，治疗开始时20例患者处于HBV复制状态，治疗结束后随访9～39个月(平均19个月)。结果33/40(82.5%)例病人无再感染征象，7/40(17.5%)例再感染者病情较轻 [2] 。
组织学显示9名进展性或晚期肝病、HBV-DNA阳性的HBV感染者参加的研究，研究结束时HBV-DNA均阴性，同时血清ALT下降;4例同时予免疫抑制疗法的肝移植病人，其HBV-DNA也持续阴性，肝活检显示HBcAg、HBˉsAg阴性，无HBV再感染征象 [3] 。
世界各地多中心临床实验 [4] 表明用拉米夫定100mg/d治疗慢性HBV感染者，2周时HBV-DNA下降90%以上，8周时绝大多数受试者血清HBV-DNA低于检测水平，同时伴ALT正常;24～36周后部分患者可以出现HBV-DNA突变。
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3 拉米夫定治疗中耐药性变异株的产生
拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎中显示了令人鼓舞的效应。但在长期的单治疗过程中，部分病人的乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因区的酪氨酸—蛋氨酸—天门冬氨酸—天门冬氨酸基序(tyrosine-methionine-asparticacid-aspartic acid，YMDD)，可产生基因变异，其中编码蛋氨酸的codon550出现核苷酸的替代。至今已报告有两种常见的变异形式:M550V(伴随L526M)和M550I，对拉米夫定的治疗产生了抗药性 [5，6] 。
3.1 慢性乙型肝炎患者的耐药性变异株 YMDD变异株最早可产生于抗病毒治疗后第6个月，其发生率各家报道不一。亚洲的一项研究表明，拉米夫定用药1年YMDD变异株发生率为14% [7] 。在中国地区进行的拉米夫定临床实验结果显示12.1%的患者治疗48周时出现YMDD变异 [8] 。Lau等 [9] 使用拉米夫定治疗27例慢性乙型肝炎患者，治疗8个月时有患者开始出现耐药，并同时出现YMDD变异，治疗2～4年时，共有14例(51.4%)出现耐药和YMDD变异。
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3.2 肝移植患者的耐药性变异性 Ling等 [10] 报道2例慢性乙型肝炎患者行肝移植术，在拉米夫定治疗后约10个月出现YMDD变异，此外还有其他位点变异，分别为第528位L被M替换及第512位苯丙氨酸被L替换。美国多中心研究资料显示，52例接受肝移植术后长期使用拉米夫定的患者中，14例发生了YMDD变异，发生率为27% [11] 。Mutimer等 [12] 报告19例接受拉米夫定治疗的肝移植患者，术前应用拉米夫定预防、术后长期服用拉米夫定，结果有4例发生了YMDD变异，发生率为2.1%。
3.3 影响变异株出现的机理和可能因素 已有的研究表明，拉米夫定耐药性的产生与HBVP基因突变有关，耐药株中多见P基因变异且相对集中于YMDD基序 [13] 。YMDD变异分为两种，一种是HBV P基因第550位氨基酸由M突变为V，另一种是HBV P基因第550位氨基酸由M突变为Ⅰ，此两种变异分别由HBV第739位碱基A突变为G和741位G突变为T所引起。Tassopuoulos等 [14] 发现，治疗基线时血清HBV-DNA滴度的中位数较高者发生变异的可能性增高，前C区变异株产生耐药性的机会高于野毒株。Allen等 [5] 报道在20例发生治疗耐药的患者中，YVDD/L528M变异株为18例，而YIDD变异株仅为2例。提示YVDD变异株较YIDD常见，而Pessoa等 [15] 认为YIDD变异株发生率高于YVDD发生率。
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4 体外实验中拉米夫定对变异株复制的影响
在感染野毒株HBV血清的肝细胞培养液中加入浓度仅0.03μmol/L的拉米夫定即可将HBV-DNA浓度降低到6%以下，而用YMDD变异的HBV血清处理的肝细胞培养液加入浓度高达30μmol/L的拉米夫定后，其HBV-DNA浓度仍保持在20%以上 [6] 。Fischer等 [16] 报告2mg/ml的拉米夫定可使鸭HBV野毒株病毒DNA下降92%，而使变异株DNA下降超过80%的剂量则需要40mg/ml。Melegari等 [17] 报道利用定点诱突变技术将ayw亚型的野毒株的YMDD基序诱变为YIDD、YVDD及产生L528M变异，将野毒株及诱变产生的变异株与质粒结合后转染入HCC细胞及人胚肾细胞，对细胞分泌的HBV-DNA、HBeAg及HBsAg进行检测，发现与野毒株相比，含有单个点突变的变异株(分别含L528M、YIDD、YVDD)的病毒复制减少。
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5 耐药性变异株对病情的影响
Schiff等 [18，19] 报告236例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎，口服拉米夫定2年以上，结果无YMDD变异者几乎均有临床和组织学改善，HBeAg血清转换继续增加;发生变异者，部分患者仍有组织学改善;只有少数原为失代偿肝病者，可能会发生临床和组织学的恶化，甚至肝衰竭。Perrillo等 [20] 报道在接受拉米夫定治疗的52例肝移植术后患者中有14例出现YMDD基序的变异，伴有对拉米夫定的耐药性。在这14例患者中有7例接受肝组织活检，结果显示与变异发生前相比，肝组织炎症无改变、好转及恶化的例数分别为2、2和3例。即使发生HBV变异，拉米夫定治疗仍能使大部分病人的血清HBV-DNA继续抑制，ALT维持正常，并伴有HBeAg阴转和血清转换，只有少数病人出现病情波动，需要停药观察。
6 耐药性的产生机制
YMDD变异是在逆转录酶编码区出现变异导致YMDD基序中的蛋氨酸(methionine，M)被异亮氨酸(isoleucine，Ⅰ)或缬氨酸(valine，V)替换，后者常伴有第528位亮氨酸(leucine，L)被M替换，可伴有其他逆转录酶编码区和HBV基因组其他位点的变异。YMDD基序是HBV和HIV逆转录酶的活性部分，在逆转录酶中，YMDD基序是高度保守的序列。在乙型肝炎病毒的逆转录过程中，YMDD基序中的YM能与模板—引物复合物相作用，其中的M能与模板的核苷末端的糖基相作用，并直接影响寡核苷酸与模板链的结合 [21] 。有学者 [22] 认为在YMDD基序中发生YIDD或YVDD变异后，多聚酶能选择寡核苷酸的结合，也就是说可能变异株能区分拉米夫定(dCTP的类似物)与dCTP，从而能结合dCTP而不能结合拉米夫定，使DNA链能继续合成。但其确切机制尚未清楚。
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7 变异株的检测方法
对YMDD变异检测的方法主要是DNA测序，包括PCR产物测定和克隆测序。
国内有人 [23] 分别采用聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、PCR产物直接测序和重组克隆测序检测P基因YMDD变异，认为克隆后测序的结果最精确，而PCR-RFLP更实用和经济。有学者 [24] 采用荧光标记的探针利用快速的PCR法检测HBV的耐药变异株，与直接测序的结果比较，显示此方法结果的灵敏度及特异性相差不大，而更为经济快捷。国内亦有人采用核酸杂交-微板法进行YMDD变异检测 [25] 。
8 防治耐药性发生的对策在治疗中联合其他药物治疗，有助于减少耐药变异株的出现。体外实验证实喷昔洛韦(Penciclovir)与拉米夫定联合对抑制HBV可产生协同作用 [26] 。
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国内有人 [27] 报告应用拉米夫定、干扰素α-2b、黄芪注射液三联叠加疗法，比单用拉米夫定比较，三联叠加疗法可增加慢性乙型肝炎患者HBV-DNA阴转率和HBeAg-抗HBe血清转换率，显著降低血清HBV-DNA浓度，并减少YMDD变异。
新出现的一些核苷类似物如阿的福韦(Adefovir)、奈韦拉平(Nevirapine)等，对YMDD变异株仍然有效，将来上市后可作为治疗这种变异株的有效药物。
目前拉米夫定作为一种抗HBV药物，其疗效肯定，但 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的耐药性的产生与病毒变异的关系还需进一步研究。明确HBV逃避拉米夫定治疗的机制，对于如何减少耐药性、出现耐药株后采取对策等有重要的意义。停药后复发及DNA聚合酶变异将是今后有待解决的问题。
参考文献
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(编辑 黄杰), 百拇医药(杨景毅)
我国是乙型肝炎高发区，约有2700万需要抗病毒治疗的慢性肝病患者。长期以来，干扰素-α是治疗慢性乙肝较有效的药物，但总的应答率较低，非选择病人中仅有20%～30%HBeAg消失，经过筛选的病人疗效也仅有40%～60%的疗效，且临床应用范围较为狭窄，副作用明显，故影响其临床应用。近年出现的新抗病毒药物拉米夫定(Lamivudine)具有明显的抗病毒活性，是目前临床应用较多的药物。现综述如下。
1 拉米夫定的抗HBV机制
拉米夫定(化学名称为:2，3-双脱氧-3-硫胞苷)作为一种胞嘧啶核苷类似物，是RNA逆转录酶的有效抑制剂，通过抑制HBV-DNA聚合酶而减少复制中间体，阻断DNA的合成，使HBV感染不能持续。
拉米夫定是通过结合到新合成的病毒DNA中来直接抑制病毒合成，这种结合使DNA链的延长终止，并且竞争性抑制HBV编码的聚合酶，从而发挥很强的抑制HBV复制的作用 [1] 。它与病毒多聚酶结合后，竞争抑制了多聚酶活性，同时造成了HBV-DNA链合成终止，从而抑制病毒复制。
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2 拉米夫定的治疗效应
Nery等报道40例HBV感染者因慢性晚期肝病而行肝脏移植术，手术前后均予拉米夫定治疗，治疗开始时20例患者处于HBV复制状态，治疗结束后随访9～39个月(平均19个月)。结果33/40(82.5%)例病人无再感染征象，7/40(17.5%)例再感染者病情较轻 [2] 。
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世界各地多中心临床实验 [4] 表明用拉米夫定100mg/d治疗慢性HBV感染者，2周时HBV-DNA下降90%以上，8周时绝大多数受试者血清HBV-DNA低于检测水平，同时伴ALT正常;24～36周后部分患者可以出现HBV-DNA突变。
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3 拉米夫定治疗中耐药性变异株的产生
拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎中显示了令人鼓舞的效应。但在长期的单治疗过程中，部分病人的乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因区的酪氨酸—蛋氨酸—天门冬氨酸—天门冬氨酸基序(tyrosine-methionine-asparticacid-aspartic acid，YMDD)，可产生基因变异，其中编码蛋氨酸的codon550出现核苷酸的替代。至今已报告有两种常见的变异形式:M550V(伴随L526M)和M550I，对拉米夫定的治疗产生了抗药性 [5，6] 。
3.1 慢性乙型肝炎患者的耐药性变异株 YMDD变异株最早可产生于抗病毒治疗后第6个月，其发生率各家报道不一。亚洲的一项研究表明，拉米夫定用药1年YMDD变异株发生率为14% [7] 。在中国地区进行的拉米夫定临床实验结果显示12.1%的患者治疗48周时出现YMDD变异 [8] 。Lau等 [9] 使用拉米夫定治疗27例慢性乙型肝炎患者，治疗8个月时有患者开始出现耐药，并同时出现YMDD变异，治疗2～4年时，共有14例(51.4%)出现耐药和YMDD变异。
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3.2 肝移植患者的耐药性变异性 Ling等 [10] 报道2例慢性乙型肝炎患者行肝移植术，在拉米夫定治疗后约10个月出现YMDD变异，此外还有其他位点变异，分别为第528位L被M替换及第512位苯丙氨酸被L替换。美国多中心研究资料显示，52例接受肝移植术后长期使用拉米夫定的患者中，14例发生了YMDD变异，发生率为27% [11] 。Mutimer等 [12] 报告19例接受拉米夫定治疗的肝移植患者，术前应用拉米夫定预防、术后长期服用拉米夫定，结果有4例发生了YMDD变异，发生率为2.1%。
3.3 影响变异株出现的机理和可能因素 已有的研究表明，拉米夫定耐药性的产生与HBVP基因突变有关，耐药株中多见P基因变异且相对集中于YMDD基序 [13] 。YMDD变异分为两种，一种是HBV P基因第550位氨基酸由M突变为V，另一种是HBV P基因第550位氨基酸由M突变为Ⅰ，此两种变异分别由HBV第739位碱基A突变为G和741位G突变为T所引起。Tassopuoulos等 [14] 发现，治疗基线时血清HBV-DNA滴度的中位数较高者发生变异的可能性增高，前C区变异株产生耐药性的机会高于野毒株。Allen等 [5] 报道在20例发生治疗耐药的患者中，YVDD/L528M变异株为18例，而YIDD变异株仅为2例。提示YVDD变异株较YIDD常见，而Pessoa等 [15] 认为YIDD变异株发生率高于YVDD发生率。
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4 体外实验中拉米夫定对变异株复制的影响
在感染野毒株HBV血清的肝细胞培养液中加入浓度仅0.03μmol/L的拉米夫定即可将HBV-DNA浓度降低到6%以下，而用YMDD变异的HBV血清处理的肝细胞培养液加入浓度高达30μmol/L的拉米夫定后，其HBV-DNA浓度仍保持在20%以上 [6] 。Fischer等 [16] 报告2mg/ml的拉米夫定可使鸭HBV野毒株病毒DNA下降92%，而使变异株DNA下降超过80%的剂量则需要40mg/ml。Melegari等 [17] 报道利用定点诱突变技术将ayw亚型的野毒株的YMDD基序诱变为YIDD、YVDD及产生L528M变异，将野毒株及诱变产生的变异株与质粒结合后转染入HCC细胞及人胚肾细胞，对细胞分泌的HBV-DNA、HBeAg及HBsAg进行检测，发现与野毒株相比，含有单个点突变的变异株(分别含L528M、YIDD、YVDD)的病毒复制减少。
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5 耐药性变异株对病情的影响
Schiff等 [18，19] 报告236例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎，口服拉米夫定2年以上，结果无YMDD变异者几乎均有临床和组织学改善，HBeAg血清转换继续增加;发生变异者，部分患者仍有组织学改善;只有少数原为失代偿肝病者，可能会发生临床和组织学的恶化，甚至肝衰竭。Perrillo等 [20] 报道在接受拉米夫定治疗的52例肝移植术后患者中有14例出现YMDD基序的变异，伴有对拉米夫定的耐药性。在这14例患者中有7例接受肝组织活检，结果显示与变异发生前相比，肝组织炎症无改变、好转及恶化的例数分别为2、2和3例。即使发生HBV变异，拉米夫定治疗仍能使大部分病人的血清HBV-DNA继续抑制，ALT维持正常，并伴有HBeAg阴转和血清转换，只有少数病人出现病情波动，需要停药观察。
6 耐药性的产生机制
YMDD变异是在逆转录酶编码区出现变异导致YMDD基序中的蛋氨酸(methionine，M)被异亮氨酸(isoleucine，Ⅰ)或缬氨酸(valine，V)替换，后者常伴有第528位亮氨酸(leucine，L)被M替换，可伴有其他逆转录酶编码区和HBV基因组其他位点的变异。YMDD基序是HBV和HIV逆转录酶的活性部分，在逆转录酶中，YMDD基序是高度保守的序列。在乙型肝炎病毒的逆转录过程中，YMDD基序中的YM能与模板—引物复合物相作用，其中的M能与模板的核苷末端的糖基相作用，并直接影响寡核苷酸与模板链的结合 [21] 。有学者 [22] 认为在YMDD基序中发生YIDD或YVDD变异后，多聚酶能选择寡核苷酸的结合，也就是说可能变异株能区分拉米夫定(dCTP的类似物)与dCTP，从而能结合dCTP而不能结合拉米夫定，使DNA链能继续合成。但其确切机制尚未清楚。
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7 变异株的检测方法
对YMDD变异检测的方法主要是DNA测序，包括PCR产物测定和克隆测序。
国内有人 [23] 分别采用聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、PCR产物直接测序和重组克隆测序检测P基因YMDD变异，认为克隆后测序的结果最精确，而PCR-RFLP更实用和经济。有学者 [24] 采用荧光标记的探针利用快速的PCR法检测HBV的耐药变异株，与直接测序的结果比较，显示此方法结果的灵敏度及特异性相差不大，而更为经济快捷。国内亦有人采用核酸杂交-微板法进行YMDD变异检测 [25] 。
8 防治耐药性发生的对策在治疗中联合其他药物治疗，有助于减少耐药变异株的出现。体外实验证实喷昔洛韦(Penciclovir)与拉米夫定联合对抑制HBV可产生协同作用 [26] 。
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国内有人 [27] 报告应用拉米夫定、干扰素α-2b、黄芪注射液三联叠加疗法，比单用拉米夫定比较，三联叠加疗法可增加慢性乙型肝炎患者HBV-DNA阴转率和HBeAg-抗HBe血清转换率，显著降低血清HBV-DNA浓度，并减少YMDD变异。
新出现的一些核苷类似物如阿的福韦(Adefovir)、奈韦拉平(Nevirapine)等，对YMDD变异株仍然有效，将来上市后可作为治疗这种变异株的有效药物。
目前拉米夫定作为一种抗HBV药物，其疗效肯定，但 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的耐药性的产生与病毒变异的关系还需进一步研究。明确HBV逃避拉米夫定治疗的机制，对于如何减少耐药性、出现耐药株后采取对策等有重要的意义。停药后复发及DNA聚合酶变异将是今后有待解决的问题。
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(编辑 黄杰), 百拇医药(杨景毅)