川芎嗪对大鼠脓毒血症时核因子-κB活性的抑制作用
【摘要】 目的 研究大鼠脓毒血症时肠道组织匀浆TNF-α、MCP-1的含量与肠道组织细胞中NF-κB活性的相关性，并且利用中药川芎嗪治疗脓毒血症，找到抑制NF-κB的药物和方法。方法 采用盲肠结扎穿孔术做大鼠的脓毒血症模型。分别在术后1、3、6、12、24、48h活杀大鼠，取大鼠肠粘膜组织，用酶联免疫法测TNF-α、MCP-1的含量，用凝胶电泳迁移法测NF-κB的活性。同时有同时间对照组检测;然后在脓毒血症模型基础上，利用川芎嗪和生理盐水治疗，分别在治疗后12、24、48、72h活杀大鼠，用同样的方法检测TNF-α、MCP-1的含量以及NF-κB的活性。结果 治疗前，NF-κB的活性、TNF-α、MCP-1的含量在大鼠脓毒血症时明显升高，与对照组对比差异有显著性(P<0.01);治疗后，NF-κB的活性、TNF-α、MCP-1的含量与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。结论 TNF-α、MCP-1是脓毒血症早期激活的细胞因子，它们的释放与NF-κB的活性密切相关;川芎嗪可以抑制NF-κB的活性，并因此使炎症细胞因子的释放减少，从而达到抑制炎症反应的作用，为临床上治疗危重病提供了新的方法和途径。
, 百拇医药
关键词 真核转录因子-κB 脓毒血症 川芎嗪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)03-0196-04
Inhibited effect of tetramethylpyrazine to nuclear factor-kappaB
activation by sepsis in rats
Jiang Li
The First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective Nuclear factor-kappaB is the central role of sepsis.To investigate activation of nucleˉar factor-kappaB，and effect of tetramethylpyrazine in intestines tissues in rat.Methods Sepsis was produced in rats by cecal ligation and puncture.Changes in NF-κB actitivty、TNF-αlevels in intestinestissues were determined by electrophoretic mobility gel-shift assay and enzyme-linked immunosorbent assay，respectively.Results NF-κB activity、TNF-αlevels in intestines tissues were significantly increase in rats with sepsis;After tetramethylpyrazine treatment，those index were restrained obviously，and there was asignificant difference between the treatment group and control group(P<0.05).Conclusion Tetramethylpyrazine can restrain nuclear factor-kappaB activation，and reˉstrain development of sepsis.
, http://www.100md.com
Key words nuclear factor-kappaB sepsis tetramethylpyrazine
脓毒血症是感染因素所导致的系统性炎症反应(SIRS)，感染来源于细菌、原虫或病毒。严重的脓毒血症伴随单一或多器官的功能失常。细胞因子被认为是对人体防御功能起重要作用的大量细胞所产生的一组小信号蛋白。虽然细胞因子对自身防御功能很重要，但是过度的产生和释放会造成广泛的组织损伤而导致多器官功能障碍综合征(MODS) [1] 。脓毒血症正是由于细胞因子过度释放入血而产生系统过强的炎症反应所致。真核细胞转录因子-κB(NF-κB)是一组近年来发现的核转录调节因子;NF-κB在调节重症疾病的免疫调节基因方面有特殊的作用，尤其在调节ARDS或MODS等疾病的细胞转录因子、粘附分子等方面起到核心作用。广泛的细胞外刺激(包括细菌、病毒等的产物)可以刺激激活NF-κB的活性。NF-κB活化而发生核易位，其目的靶基因的启动因子或增强子上特定的κB系列特异结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子表达而介导SIRS甚至MODS的产生。TNF-α是引起多种促炎细胞因子和炎症介质失控性释放，导致SIRS或MODS的关键细胞因子。TNF已经被认为是机体在慢性局限性或系统炎症的发病机制中的潜在的前炎症分子 [2] 。最近研究表明，在脓毒血症患者肠道的完整性对临床痊愈起重要的决定性作用。在正常生理状态下，肠道提供了抵御有毒的肠内容物包括细菌和内毒素的关键屏障作用 [3] 。脓毒血症引起的MODS一个可能的机制是无法控制的系统性炎症反应(SIRS)，而SIRS是宿主的免疫系统不适当的激活从而导致一系列的器官损伤和功能不全 [4] 。而这种损害会造成免疫介导的细胞坏死或激活细胞凋亡的通道 [5，6] 。本实验研究大鼠的脓毒血症时肠道组织匀浆TNF-α的含量与肠道组织细胞中NF-κB的活性的相关性，找出其间的联系。并且利用中药川芎嗪治疗脓毒血症，找到抑制NF-κB的药物和方法。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂 健康雄性SD大鼠，体重180～230g(由大连医科大学动物中心提供);二硫苏糖醇(DTT)、NP-40、苯*****(PSMF)、考马斯亮蓝(CBBG-250)、POLY(di-dc)HEPES、Leupeptin、胶原酶、Aprotinin、Pepstatin、α- 32 PdATP、兔抗人P 50 单克隆抗体(以上试剂均来自USA)、氯胺酮、双链寡核苷酸探针:5′-AGC TTC AGA GCG GGG GAC TTTCCG AGA GG-3′;3′-AGTCTC CCC TGA AAG GCT CTC CAG CT-5′(大连宝生物细胞研究所提供)、TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂;流式细胞仪、低温离心机、分光仪、垂直电泳槽、电泳仪、凝胶干燥仪等。
1.2 实验步骤 (1)大鼠分组SD大鼠48只，分成12组，每组4只，其中6组为致伤组，分别在伤后1、3、6、12、24、48h活杀;另外6组为对照组，同样时间活杀。(2)两组大鼠均采用腹腔麻醉，12h前禁食水。致伤组采用盲肠结扎穿孔术后编号(使用两种染料，一种个位，一种十位)，置入笼内自由活动，不限饮食，每隔3～4h观察1次;对照组，同样开腹，但是不结扎、不穿孔，同样时间活杀，编号。(3)组织匀浆液的提取:依照Tulzo [7] 的方法，收集匀浆上清-20℃保存，取匀浆上清测定TNF-α含量，ELISA法测定按照试剂盒说明进行。(4)组织核蛋白提取和κB序列双链寡核苷酸探针的标记依据Deryckere [8] 的方法，组织收集上清，用Bradford法测定其浓度，核蛋白-70℃保存备用。(5)含κB序列的双链寡核苷酸探针T4多核苷酸激酶催化下，用αˉ 32 PdATP标记探针5′端，纯化后测定探针的比放射性。(6)胃肠组织核蛋白提取物中NF-κB活性及特异性的检测:参照Shenkar [9] 的方法，用凝胶电泳迁移率改变法(EMSA)检测，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳毕将凝胶置干燥仪中烘烤，室温下放射自显影24～48h。(7)大鼠分组:SD大鼠8只，分2组，每组4只。均用盲肠穿孔法(CLP)致伤，然后分川芎嗪组、温生理盐水对照组二组，均治疗后观察12、24、48、72h相应点活杀大鼠采取同样步骤测定上述几项指标。药物治疗:川芎嗪与生理盐水(60mg/kg)均为腹腔内注射，每次10ml，每3h1次，共3次。
, http://www.100md.com
1.3 统计学方法 实验数据以(ˉx±s)表示，SPSS软件分析。数据分析使用t检验和方差分析。
2 结果
2.1 致伤组结果 (1)肠组织匀浆TNF-α、MCP-1水平的变化 CLP致伤后1～48h大鼠肠组织匀浆TNFˉα、MCP-1水平明显升高，于致伤后1h达高峰。与对照组比较有显著意义。见表1。
(2)肠组织NF-κB活性的变化CLP致伤后不同时间点 电泳滞后带经图像扫描仪进行密度扫描，采用photoshop软件测定其灰度值和滞后带面积，二者的乘积表示核提取物中NF-κB与标记探针结合的活性。抗体超迁移试验:加入5μl抗P 50 多克隆抗体后电泳滞后带变淡且更为滞后，CLP致伤后1～48h NF-κB活性显著升高(P<0.01)，其峰值出现于致伤后1h。见表2、图1、2。
, http://www.100md.com
表1 对照组与模型组的TNF-α与MCP-1的结果
表2 致伤组大鼠肠道组织核蛋白NF-κB活性变化
注:1为对照组:2、3、4、5、6、7分别为1、3、6、12、24、48h 图2 EMSA法特异性检测结果注:1为标记DNA探针结果; 2为加P 50 多克隆抗体结果2.2 (1)肠组织匀浆TNF-α水平的变化:CLP致伤后分别用川芎嗪、生理盐水治疗，并测12～72h大鼠肠组织匀浆 TNF-α水平，川芎嗪组与致伤组比较差异有显著性(P<0.05);生理盐水组与致伤组比较差异无显著性(P>0.05)，见表3。
(2)肠组织匀浆MCP-1水平的变化:CLP致伤后分别用川芎嗪、生理盐水治疗，并测12～72h大鼠肠组织匀浆MCP-1水平与模型组比较差异有显著性(P<0.05);与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)。见表4。
, http://www.100md.com
(3)肠组织NF-κB活性的变化CLP致伤后分别用川芎嗪、生理盐水治疗，并测12～72h大鼠肠组织细胞NF-κB活性与模型组比较差异有显著性(P<0.05);与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)。见表5、图3、4。
表3 治疗组TNF-α水平变化 (ng/L)
注:与致伤组比较 ˇ P<0.05;与生理盐水组比较 △ P<0.05;生理盐水组与致伤组比较 ▲ P>0.05。
表4 治疗组MCP-1水平变化
注:与致伤组比较 ˇ P<0.05;与生理盐水组比较 △ P<0.05;生理盐水组与致伤组比较 ▲ P>0.05。
表5 治疗组大鼠肠道组织核蛋白NF-κB活性变化
, 百拇医药 注:与致伤组比较 △ P<0.05;与生理盐水组比较 ▲ P<0.05;生理盐水组与致伤组比较 ˇˇ P>0.05。
图3 治疗组核蛋白结果 图4 生理盐水核蛋白结果
注:1、2、3、4分别为川芎嗪组12、24、48、72h 注:1、2、3、4分别为生理盐水组12、24、48、72h
3 讨论
目前对于各种情况的脓毒血症的定义统一按照美国胸科医生学院重症监护医学系1991年制定的标准 [10] 。这些定义强调脓毒血症的发展与系统性炎症反应的宿主对突发的刺激反应的程度有关。严重的脓毒血症定义为伴有明确的或多脏器的功能失常的脓毒血症。脓毒血症似乎是由于细胞因子过度释放入循环系统而引起系统过度的炎症反应的结果 [1] 。
, 百拇医药 盲肠结扎穿孔术后，由于组织坏死，导致肠道组织通透性增强，细菌移位，继而形成脓毒血症，严重者导致多器官能障碍综合征(MODS)的发生。本实验中，致伤组的大鼠 基本都出现了MODS，说明本实验的模型是成功的。本实验的致伤组结果显示，大鼠CLP后，肠组织匀浆TNF-α、MCP-1水平明显升高，而且在致伤后1h达高峰。TNF已经被认为是机体在慢性局限性或系统炎症的发病机制中的潜在的前炎症分子 [11] 。TNF-α主要来源于LPS刺激的单核、巨噬细胞等，TNF-α主要通过诱导其它细胞因子的产生和释放，如白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8等造成对机体损伤的同时，可通过再激活炎症效应细胞，释放更多的炎性因子，使炎症信号进一步放大和加强，产生“级联放大”作用 [12] 。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因含一个与通用κB系列高度同源的κB系列位点，故测定NF-κB的活性可大致反映NF-κB对TNF-α基因表达的调控 [13] 。
细胞因子并没有贮存在细胞间质中而是在炎症刺激的反应中立即合成和释放的。控制这个过程是在细胞因子的mRNA最新表达的基因水平。近几年在理解个别转运因子的活动方面和阐明这些因子在控制特异基因转运时的相互作用方面取得了很大的进展 [14] 。其中一个转运因子核因子-κB在控制细胞因子瀑布样释放中起到决定性作用。NF-κB受到刺激(包括:内毒素、细胞因子)会在许多细胞中活化。NF-κB的活化和进一步的粘和对许多细胞因子和相关分子的转运起关键性作用，包括TNF-α、IL-1β、MCP-1等。因为NF-κB可能是细胞因子瀑布样释放的决定性因子，因此，抑制NF-κB的活性可能会降低和控制系统性炎症反应的发展，这比阻止单个细胞因子的产生或抑制其活性的作用要大得多。
, 百拇医药
Altavilla D [15] 撰文认为:内毒素休克时，大鼠的血浆TNF-α水平和肝脏的NF-κB的活性明显升高。同时应用针对NF-κB的抑制因子IRFI042后，血浆的TNF-α和肝脏的NF-κB的活性均有显著下降。
本实验中模型组的核因子-κB的活性较正常对照组明显增强，而且相同时间的肿瘤坏死因子和单核细胞趋化蛋白-1也有显著的升高(P<0.01)，前后呈正相关的关系，与国外的研究相同。同时在治疗组中，川芎嗪与致伤组比较有明显差异，而且与生理盐水组有明显的差异，说明川芎嗪对脓毒血症有一定治疗作用;同时，与治疗时间也有一定关系，早期治疗对NF-κB抑制效应更加明显。进一步说明抑制NF-κB的活性能够降低炎症反应的发展。
最近研究表明，在脓毒血症患者肠道的完整性对临床痊愈起重要的决定性作用。在正常生理状态下，肠道提供了抵御有毒的肠内容物包括细菌和内毒素的关键屏障作用 [16] 。脓毒血症引起MODS的一个可能的机制是无法控制的系统性炎症反应(SIRS)，而SIRS是宿主的免疫系统不适当的激活从而导致一系列的器官损伤和功能不全 [17] 。而这种损害会造成免疫介导的细胞坏死或激活细胞凋亡的通道 [18，19] 。
, 百拇医药
川芎嗪是氧自由基清除剂，本实验中，除能保护肠粘膜屏障外，尚能抑制脓毒血症大鼠的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的基因表达，能清除氧自由基，减轻肠源性肺损伤。说明对氧自由基的清除也建立在对细胞因子基因表达的控制，对于SIRS的治疗也有一定疗效，为我们在临床上治疗危重病提供了新的方法和途径。
结论:(1)TNF-α、MCP-1是脓毒血症早期激活的细胞因子，它们的释放与NF-κB的活性密切相关;脓毒血症早期NF-κB的活性增强，促使对TNF-α、MCP-1的基因表达增强，引起TNF-α的大量释放，并引起进一步的细胞因子瀑布样效应释放，导致SIRS发展为MODS。(2)川芎嗪可以抑制NF-κB的活性，并因此使炎症细胞因子的释放减少，从而达到抑制炎症反应的作用，为临床上治疗危重病提供了新的方法和途径。
参考文献
1 Blackwell.T.S.Christman J.W.Sepsis and cytokines.British Journal ofAnaesthesia，1996，77:110-117.
, 百拇医药
2 Vassalli.P.The pathophysiology of tumor necrosis factors.Annu.Rev.Immunol，1992，10:411-452.
3 Deitch，E.A，R.D.Specian，R.D.Berg.Endotoxin-induced bacterial translocation and mucosal permeability:role of xanthine oxidase，compleˉment activation，and macrophage products.Crit.Care Med，1991，19:785-791.
4 Nieuwenhuijzen.G.A.，E.A.Deitch，R.J.Goris.The relationship beˉtween gut-derived bacteria and the development of the multiple organ dysfunction syndrome.J.Anatomy，1996，189:537-548.
, 百拇医药
5 Hiramatsu.M，R.S.Hotchkiss，I.E.Karl，et al.Cecal ligation and puncˉture(CLP)induces apoptesis in thymus，spleen，and gut by an endotoxin and TNF-independent pathway.Shock，1997，7:247-253.
6 Bohlinger.I，M.Leist，F.Gantner，et al.DNA fragmentation in mouse orˉgansduring endotoxic shock.Am.J.Pathol，1996，149:13871-13893.
7 Tulzo Y L，Shenkar R，Kancko D，et al.Hemorrhage increases cytokine suppression in lung mononuclear cells in mice.J Clin Invest，1997，99:1516-1624.
, http://www.100md.com
8 Derckere F，Gannon F.A one-hour minipreparation technique for exˉtractionof DNA-binding protein from animal tissue.Biotechniques，1994，16:405.
9 Shenkar R，SchwartzMD，Terada L S，et al.Hemorrhage activates NF-κB in murine lung mononuclear cells in vivo.Am J Physiol，1996，270:729-735.
10 American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Cosensus Conference.Definition for sepsis and organ failure and guideˉlines for the use of innorative therapies in sepsis.Chest，1992，20:864-974.
, http://www.100md.com
11 Vassalli.P.The pathophysiology of tumor necrosis factors.Annu.Rev.Immunol，1992，10:411-452.
12 Thibeault I，Laflamme N，Rivest S.Regulation of the gene encoding the monocyte chemoattractant protein1(MCP-1)in the mouse and rat brain in response tocirculating LPS and proinflammatory cytokines.J Comp Neurol，2001，434(4):461-477.
13 Rahman I，MacNee W.Role of transcription factor in inflammatory lung disease.Thorax，1998，53:601-602.
, http://www.100md.com
14 Siebenlist U，Franzoso G，Brown K.Structure，regulation，and function of NF-κB.Annual Review of Cell Biology，1994，11710:405-455.
15 Altavilla D，Squadrito G，Minutoli L，et al.Inhibition of nuclear factor kappaB activation by IRFI042，protects againgst endotoxin-induced shock.Cardiovasc Res，2002，54(3):684-693.
16 Deitch.E.A，R.D.Specian，R.D.Berg.Endotoxin-induced bacterial translocation and mucosal permeability:role of xanthine oxidase，comˉplement activation and macrophage products.Crit.Care Med，1991，19:785-791.
, 百拇医药
17 Nieuwenhuijzen.G.A，E.A.Deitch，R.J.Goris.The relationship beˉtween gut-derived bacteria and the development of the multiple organ dysfunction syndrome.J.Anatomy，1996，189:537-548.
18 Hiramatsu，M，R.S.Hotchkiss，I.E.Karl，et al.Buchman.Cecal ligaˉtion andpuncture(CLP)induces apoptosis in thymus，spleen，lung，and gut by an endotoxin and TNF-independent pathway.Shock，1997，7:247-253.
19 Bohlinger.I，M.Leist，F.Gantner，et al.DNA fragmentation in mouse organs during endotoxic shock.Am.J.Pathol，1996，149:13871-13893.
作者单位:116011大连医科大学附属第一医院急诊科
(收稿日期:2003-11-17)
(编辑梅 子), 百拇医药(蒋丽)
, 百拇医药
关键词 真核转录因子-κB 脓毒血症 川芎嗪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)03-0196-04
Inhibited effect of tetramethylpyrazine to nuclear factor-kappaB
activation by sepsis in rats
Jiang Li
The First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective Nuclear factor-kappaB is the central role of sepsis.To investigate activation of nucleˉar factor-kappaB，and effect of tetramethylpyrazine in intestines tissues in rat.Methods Sepsis was produced in rats by cecal ligation and puncture.Changes in NF-κB actitivty、TNF-αlevels in intestinestissues were determined by electrophoretic mobility gel-shift assay and enzyme-linked immunosorbent assay，respectively.Results NF-κB activity、TNF-αlevels in intestines tissues were significantly increase in rats with sepsis;After tetramethylpyrazine treatment，those index were restrained obviously，and there was asignificant difference between the treatment group and control group(P<0.05).Conclusion Tetramethylpyrazine can restrain nuclear factor-kappaB activation，and reˉstrain development of sepsis.
, http://www.100md.com
Key words nuclear factor-kappaB sepsis tetramethylpyrazine
脓毒血症是感染因素所导致的系统性炎症反应(SIRS)，感染来源于细菌、原虫或病毒。严重的脓毒血症伴随单一或多器官的功能失常。细胞因子被认为是对人体防御功能起重要作用的大量细胞所产生的一组小信号蛋白。虽然细胞因子对自身防御功能很重要，但是过度的产生和释放会造成广泛的组织损伤而导致多器官功能障碍综合征(MODS) [1] 。脓毒血症正是由于细胞因子过度释放入血而产生系统过强的炎症反应所致。真核细胞转录因子-κB(NF-κB)是一组近年来发现的核转录调节因子;NF-κB在调节重症疾病的免疫调节基因方面有特殊的作用，尤其在调节ARDS或MODS等疾病的细胞转录因子、粘附分子等方面起到核心作用。广泛的细胞外刺激(包括细菌、病毒等的产物)可以刺激激活NF-κB的活性。NF-κB活化而发生核易位，其目的靶基因的启动因子或增强子上特定的κB系列特异结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子表达而介导SIRS甚至MODS的产生。TNF-α是引起多种促炎细胞因子和炎症介质失控性释放，导致SIRS或MODS的关键细胞因子。TNF已经被认为是机体在慢性局限性或系统炎症的发病机制中的潜在的前炎症分子 [2] 。最近研究表明，在脓毒血症患者肠道的完整性对临床痊愈起重要的决定性作用。在正常生理状态下，肠道提供了抵御有毒的肠内容物包括细菌和内毒素的关键屏障作用 [3] 。脓毒血症引起的MODS一个可能的机制是无法控制的系统性炎症反应(SIRS)，而SIRS是宿主的免疫系统不适当的激活从而导致一系列的器官损伤和功能不全 [4] 。而这种损害会造成免疫介导的细胞坏死或激活细胞凋亡的通道 [5，6] 。本实验研究大鼠的脓毒血症时肠道组织匀浆TNF-α的含量与肠道组织细胞中NF-κB的活性的相关性，找出其间的联系。并且利用中药川芎嗪治疗脓毒血症，找到抑制NF-κB的药物和方法。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂 健康雄性SD大鼠，体重180～230g(由大连医科大学动物中心提供);二硫苏糖醇(DTT)、NP-40、苯*****(PSMF)、考马斯亮蓝(CBBG-250)、POLY(di-dc)HEPES、Leupeptin、胶原酶、Aprotinin、Pepstatin、α- 32 PdATP、兔抗人P 50 单克隆抗体(以上试剂均来自USA)、氯胺酮、双链寡核苷酸探针:5′-AGC TTC AGA GCG GGG GAC TTTCCG AGA GG-3′;3′-AGTCTC CCC TGA AAG GCT CTC CAG CT-5′(大连宝生物细胞研究所提供)、TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂;流式细胞仪、低温离心机、分光仪、垂直电泳槽、电泳仪、凝胶干燥仪等。
1.2 实验步骤 (1)大鼠分组SD大鼠48只，分成12组，每组4只，其中6组为致伤组，分别在伤后1、3、6、12、24、48h活杀;另外6组为对照组，同样时间活杀。(2)两组大鼠均采用腹腔麻醉，12h前禁食水。致伤组采用盲肠结扎穿孔术后编号(使用两种染料，一种个位，一种十位)，置入笼内自由活动，不限饮食，每隔3～4h观察1次;对照组，同样开腹，但是不结扎、不穿孔，同样时间活杀，编号。(3)组织匀浆液的提取:依照Tulzo [7] 的方法，收集匀浆上清-20℃保存，取匀浆上清测定TNF-α含量，ELISA法测定按照试剂盒说明进行。(4)组织核蛋白提取和κB序列双链寡核苷酸探针的标记依据Deryckere [8] 的方法，组织收集上清，用Bradford法测定其浓度，核蛋白-70℃保存备用。(5)含κB序列的双链寡核苷酸探针T4多核苷酸激酶催化下，用αˉ 32 PdATP标记探针5′端，纯化后测定探针的比放射性。(6)胃肠组织核蛋白提取物中NF-κB活性及特异性的检测:参照Shenkar [9] 的方法，用凝胶电泳迁移率改变法(EMSA)检测，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳毕将凝胶置干燥仪中烘烤，室温下放射自显影24～48h。(7)大鼠分组:SD大鼠8只，分2组，每组4只。均用盲肠穿孔法(CLP)致伤，然后分川芎嗪组、温生理盐水对照组二组，均治疗后观察12、24、48、72h相应点活杀大鼠采取同样步骤测定上述几项指标。药物治疗:川芎嗪与生理盐水(60mg/kg)均为腹腔内注射，每次10ml，每3h1次，共3次。
, http://www.100md.com
1.3 统计学方法 实验数据以(ˉx±s)表示，SPSS软件分析。数据分析使用t检验和方差分析。
2 结果
2.1 致伤组结果 (1)肠组织匀浆TNF-α、MCP-1水平的变化 CLP致伤后1～48h大鼠肠组织匀浆TNFˉα、MCP-1水平明显升高，于致伤后1h达高峰。与对照组比较有显著意义。见表1。
(2)肠组织NF-κB活性的变化CLP致伤后不同时间点 电泳滞后带经图像扫描仪进行密度扫描，采用photoshop软件测定其灰度值和滞后带面积，二者的乘积表示核提取物中NF-κB与标记探针结合的活性。抗体超迁移试验:加入5μl抗P 50 多克隆抗体后电泳滞后带变淡且更为滞后，CLP致伤后1～48h NF-κB活性显著升高(P<0.01)，其峰值出现于致伤后1h。见表2、图1、2。
, http://www.100md.com
表1 对照组与模型组的TNF-α与MCP-1的结果
表2 致伤组大鼠肠道组织核蛋白NF-κB活性变化
注:1为对照组:2、3、4、5、6、7分别为1、3、6、12、24、48h 图2 EMSA法特异性检测结果注:1为标记DNA探针结果; 2为加P 50 多克隆抗体结果2.2 (1)肠组织匀浆TNF-α水平的变化:CLP致伤后分别用川芎嗪、生理盐水治疗，并测12～72h大鼠肠组织匀浆 TNF-α水平，川芎嗪组与致伤组比较差异有显著性(P<0.05);生理盐水组与致伤组比较差异无显著性(P>0.05)，见表3。
(2)肠组织匀浆MCP-1水平的变化:CLP致伤后分别用川芎嗪、生理盐水治疗，并测12～72h大鼠肠组织匀浆MCP-1水平与模型组比较差异有显著性(P<0.05);与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)。见表4。
, http://www.100md.com
(3)肠组织NF-κB活性的变化CLP致伤后分别用川芎嗪、生理盐水治疗，并测12～72h大鼠肠组织细胞NF-κB活性与模型组比较差异有显著性(P<0.05);与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)。见表5、图3、4。
表3 治疗组TNF-α水平变化 (ng/L)
注:与致伤组比较 ˇ P<0.05;与生理盐水组比较 △ P<0.05;生理盐水组与致伤组比较 ▲ P>0.05。
表4 治疗组MCP-1水平变化
注:与致伤组比较 ˇ P<0.05;与生理盐水组比较 △ P<0.05;生理盐水组与致伤组比较 ▲ P>0.05。
表5 治疗组大鼠肠道组织核蛋白NF-κB活性变化
, 百拇医药 注:与致伤组比较 △ P<0.05;与生理盐水组比较 ▲ P<0.05;生理盐水组与致伤组比较 ˇˇ P>0.05。
图3 治疗组核蛋白结果 图4 生理盐水核蛋白结果
注:1、2、3、4分别为川芎嗪组12、24、48、72h 注:1、2、3、4分别为生理盐水组12、24、48、72h
3 讨论
目前对于各种情况的脓毒血症的定义统一按照美国胸科医生学院重症监护医学系1991年制定的标准 [10] 。这些定义强调脓毒血症的发展与系统性炎症反应的宿主对突发的刺激反应的程度有关。严重的脓毒血症定义为伴有明确的或多脏器的功能失常的脓毒血症。脓毒血症似乎是由于细胞因子过度释放入循环系统而引起系统过度的炎症反应的结果 [1] 。
, 百拇医药 盲肠结扎穿孔术后，由于组织坏死，导致肠道组织通透性增强，细菌移位，继而形成脓毒血症，严重者导致多器官能障碍综合征(MODS)的发生。本实验中，致伤组的大鼠 基本都出现了MODS，说明本实验的模型是成功的。本实验的致伤组结果显示，大鼠CLP后，肠组织匀浆TNF-α、MCP-1水平明显升高，而且在致伤后1h达高峰。TNF已经被认为是机体在慢性局限性或系统炎症的发病机制中的潜在的前炎症分子 [11] 。TNF-α主要来源于LPS刺激的单核、巨噬细胞等，TNF-α主要通过诱导其它细胞因子的产生和释放，如白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8等造成对机体损伤的同时，可通过再激活炎症效应细胞，释放更多的炎性因子，使炎症信号进一步放大和加强，产生“级联放大”作用 [12] 。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因含一个与通用κB系列高度同源的κB系列位点，故测定NF-κB的活性可大致反映NF-κB对TNF-α基因表达的调控 [13] 。
细胞因子并没有贮存在细胞间质中而是在炎症刺激的反应中立即合成和释放的。控制这个过程是在细胞因子的mRNA最新表达的基因水平。近几年在理解个别转运因子的活动方面和阐明这些因子在控制特异基因转运时的相互作用方面取得了很大的进展 [14] 。其中一个转运因子核因子-κB在控制细胞因子瀑布样释放中起到决定性作用。NF-κB受到刺激(包括:内毒素、细胞因子)会在许多细胞中活化。NF-κB的活化和进一步的粘和对许多细胞因子和相关分子的转运起关键性作用，包括TNF-α、IL-1β、MCP-1等。因为NF-κB可能是细胞因子瀑布样释放的决定性因子，因此，抑制NF-κB的活性可能会降低和控制系统性炎症反应的发展，这比阻止单个细胞因子的产生或抑制其活性的作用要大得多。
, 百拇医药
Altavilla D [15] 撰文认为:内毒素休克时，大鼠的血浆TNF-α水平和肝脏的NF-κB的活性明显升高。同时应用针对NF-κB的抑制因子IRFI042后，血浆的TNF-α和肝脏的NF-κB的活性均有显著下降。
本实验中模型组的核因子-κB的活性较正常对照组明显增强，而且相同时间的肿瘤坏死因子和单核细胞趋化蛋白-1也有显著的升高(P<0.01)，前后呈正相关的关系，与国外的研究相同。同时在治疗组中，川芎嗪与致伤组比较有明显差异，而且与生理盐水组有明显的差异，说明川芎嗪对脓毒血症有一定治疗作用;同时，与治疗时间也有一定关系，早期治疗对NF-κB抑制效应更加明显。进一步说明抑制NF-κB的活性能够降低炎症反应的发展。
最近研究表明，在脓毒血症患者肠道的完整性对临床痊愈起重要的决定性作用。在正常生理状态下，肠道提供了抵御有毒的肠内容物包括细菌和内毒素的关键屏障作用 [16] 。脓毒血症引起MODS的一个可能的机制是无法控制的系统性炎症反应(SIRS)，而SIRS是宿主的免疫系统不适当的激活从而导致一系列的器官损伤和功能不全 [17] 。而这种损害会造成免疫介导的细胞坏死或激活细胞凋亡的通道 [18，19] 。
, 百拇医药
川芎嗪是氧自由基清除剂，本实验中，除能保护肠粘膜屏障外，尚能抑制脓毒血症大鼠的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的基因表达，能清除氧自由基，减轻肠源性肺损伤。说明对氧自由基的清除也建立在对细胞因子基因表达的控制，对于SIRS的治疗也有一定疗效，为我们在临床上治疗危重病提供了新的方法和途径。
结论:(1)TNF-α、MCP-1是脓毒血症早期激活的细胞因子，它们的释放与NF-κB的活性密切相关;脓毒血症早期NF-κB的活性增强，促使对TNF-α、MCP-1的基因表达增强，引起TNF-α的大量释放，并引起进一步的细胞因子瀑布样效应释放，导致SIRS发展为MODS。(2)川芎嗪可以抑制NF-κB的活性，并因此使炎症细胞因子的释放减少，从而达到抑制炎症反应的作用，为临床上治疗危重病提供了新的方法和途径。
参考文献
1 Blackwell.T.S.Christman J.W.Sepsis and cytokines.British Journal ofAnaesthesia，1996，77:110-117.
, 百拇医药
2 Vassalli.P.The pathophysiology of tumor necrosis factors.Annu.Rev.Immunol，1992，10:411-452.
3 Deitch，E.A，R.D.Specian，R.D.Berg.Endotoxin-induced bacterial translocation and mucosal permeability:role of xanthine oxidase，compleˉment activation，and macrophage products.Crit.Care Med，1991，19:785-791.
4 Nieuwenhuijzen.G.A.，E.A.Deitch，R.J.Goris.The relationship beˉtween gut-derived bacteria and the development of the multiple organ dysfunction syndrome.J.Anatomy，1996，189:537-548.
, 百拇医药
5 Hiramatsu.M，R.S.Hotchkiss，I.E.Karl，et al.Cecal ligation and puncˉture(CLP)induces apoptesis in thymus，spleen，and gut by an endotoxin and TNF-independent pathway.Shock，1997，7:247-253.
6 Bohlinger.I，M.Leist，F.Gantner，et al.DNA fragmentation in mouse orˉgansduring endotoxic shock.Am.J.Pathol，1996，149:13871-13893.
7 Tulzo Y L，Shenkar R，Kancko D，et al.Hemorrhage increases cytokine suppression in lung mononuclear cells in mice.J Clin Invest，1997，99:1516-1624.
, http://www.100md.com
8 Derckere F，Gannon F.A one-hour minipreparation technique for exˉtractionof DNA-binding protein from animal tissue.Biotechniques，1994，16:405.
9 Shenkar R，SchwartzMD，Terada L S，et al.Hemorrhage activates NF-κB in murine lung mononuclear cells in vivo.Am J Physiol，1996，270:729-735.
10 American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Cosensus Conference.Definition for sepsis and organ failure and guideˉlines for the use of innorative therapies in sepsis.Chest，1992，20:864-974.
, http://www.100md.com
11 Vassalli.P.The pathophysiology of tumor necrosis factors.Annu.Rev.Immunol，1992，10:411-452.
12 Thibeault I，Laflamme N，Rivest S.Regulation of the gene encoding the monocyte chemoattractant protein1(MCP-1)in the mouse and rat brain in response tocirculating LPS and proinflammatory cytokines.J Comp Neurol，2001，434(4):461-477.
13 Rahman I，MacNee W.Role of transcription factor in inflammatory lung disease.Thorax，1998，53:601-602.
, http://www.100md.com
14 Siebenlist U，Franzoso G，Brown K.Structure，regulation，and function of NF-κB.Annual Review of Cell Biology，1994，11710:405-455.
15 Altavilla D，Squadrito G，Minutoli L，et al.Inhibition of nuclear factor kappaB activation by IRFI042，protects againgst endotoxin-induced shock.Cardiovasc Res，2002，54(3):684-693.
16 Deitch.E.A，R.D.Specian，R.D.Berg.Endotoxin-induced bacterial translocation and mucosal permeability:role of xanthine oxidase，comˉplement activation and macrophage products.Crit.Care Med，1991，19:785-791.
, 百拇医药
17 Nieuwenhuijzen.G.A，E.A.Deitch，R.J.Goris.The relationship beˉtween gut-derived bacteria and the development of the multiple organ dysfunction syndrome.J.Anatomy，1996，189:537-548.
18 Hiramatsu，M，R.S.Hotchkiss，I.E.Karl，et al.Buchman.Cecal ligaˉtion andpuncture(CLP)induces apoptosis in thymus，spleen，lung，and gut by an endotoxin and TNF-independent pathway.Shock，1997，7:247-253.
19 Bohlinger.I，M.Leist，F.Gantner，et al.DNA fragmentation in mouse organs during endotoxic shock.Am.J.Pathol，1996，149:13871-13893.
作者单位:116011大连医科大学附属第一医院急诊科
(收稿日期:2003-11-17)
(编辑梅 子), 百拇医药(蒋丽)