甘辛喷雾剂的含量测定及其对豚鼠超敏鼻炎的治疗作用
【摘要】 目的 建立测定复方甘草和辛夷喷雾剂(甘辛喷雾剂)含量的方法并观察该制剂对豚鼠超敏性鼻炎的疗效。方法 以甘草提取的甘草甜素和辛夷花蒸馏提取液为主药制备成鼻用喷雾剂，用反相高效液相色谱法测定制剂中甘草酸含量，检测波长为250nm，Zorbax ODS C 18 分析柱，流动相为甲醇:0.2mol/L醋酸铵:冰醋酸(67:33:1)。以2，4-二异氰酸甲苯酯(TDI)介导，诱导豚鼠超敏性鼻炎反应模型，随机分为5组，每组19只，前4组为TDI诱导的超敏鼻炎模型动物组，后1组为健康动物组;给药途径为鼻腔两侧喷雾。甘辛喷雾剂给药组分为高、低两个剂量组，12h1次，每次每侧给予甘辛喷雾剂5μl(甘草酸含量为35.5μg/μl);大剂量组，每次每侧10μl;给予市售迪康滴鼻剂作为阳性对照组;两组给予橄榄油作为空白对照组，其中一组不用TDI，作为正常动物对照组，给橄榄油;各组连续给药8d后，处死豚鼠，取鼻粘膜组织做病理检查。结果 测定甘辛喷雾剂，主要成分甘草酸的保留时间约在4.5min左右，溶剂峰不干扰测定，按甘草酸色谱峰计，理论塔板数约为2000，线性试验结果表明，甘草酸在标准曲线为0.2～1.0μg/ml的浓度范围内呈良好线性关系(r=0.9999)，测得甘草酸平均回收率为(100.67±4.44)%，甘辛喷雾剂精密度RSD为1.63%。高、低两个剂量组均使鼻粘膜上皮下嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜中性粒细胞显著减少(P<0.01)，腺体增生和分泌亢进得到有效的抑制(P<0.05)，疗效类似于阳性对照组。结论 高效液相法简便、稳定，可用于甘辛喷雾剂的含量测定;甘辛喷雾剂可有效抑制超敏反应过程，保护鼻粘膜组织结构。其作用机制可能与调节机体免疫状态，抑制炎症反应及改善组织修复有关。
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关键词 HPLC-UV 甘辛喷雾剂 豚鼠 超敏性鼻炎模型 药效学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)01-0001-04
Determination of glycyrrhizin acid in compound nasal spray ofglycyrrhizin
and flower flos magnoliae using HPLC-UV and therapeutic
effect of the formulation on guinea pig’s hypersensitive rhinitis
Chen Wen，Liu Qinghua，Lv Wanliang
, 百拇医药
College of Pharmaceutical Sciences，Shihezi University，Shihezi832002.
【Abstract】 Objective To establish HPLC-UV method for determination of glycyrrhizin acid in compound nasal spray of glycyrrhizin and flower flos magnoliae，the chief active ingredient of formulation，glycyrrhizin acid，and to observethe therapeutic effect of this formulation on guinea pig’s hypersensitive rhinitis.Methods A compound nasal spray formulation was prepared using extracts of glycyrrhizin and measured by HPLC-UV method.Mobile phase conˉsisted of methanol，0.2mol/L ammonium acetate and glacial acetic acid(67:33:1，v/v)，analytical column was Zorbax ODS C 18 and wavelength250nm.Guinea pig’s hypersensitive rhinitis was induced using toluene-2，4-diisocyanate(TDI).Fifty guinea pigs were equally divided into5groups among which guinea pigs of4groups were of hypersensiˉtive rhinitis and of1group were healthy(normal animals).High and low doses of formulation(contained710and355μg of glycyrrhizin acid)were administered by nasal spraying to guinea pigs at every12h and given continuously for8days.Commercial nasal drop(DIKANG nasal drop)and olive oil were given as a positive and a blank control，respecˉtively.In addition，olive oil was given to healthy animals as a normal control.After8days，animals were sacrificed and nasal mucosa of each animal was removed for phathological examination.Results Peak of glycyrrhizin acid appeared at4.5min in HLPC-UV chromatogram.Other peaks did not disturb the measurement.A linear relationship range was from0.2to1.0μg/ml(r=0.9999).The mean recovery was(100.67±4.44)%and inter-day relative standard deviation1.63%.In comparison with blank control group，infiltration of eosinophilic granulocyte，neutrophilic granuloˉcyte and lymphocyte arising from rhinitis were significantly reduced(P<0.01)by administration of high and low dosˉes offormulation，and gland hyperplasia and secretion were obviously inhibited(P<0.05).The therapeuticeffect was similar to that of positive control group.Conclusion The HPLC-UV is simple and stable for determination glycyrrhizin acid in compound nasal spray of glycyrrhizin and flower flos magnoliae.This compound formulation significantly inhibits the course of the typeI allergic reaction and protects the structure of nasal mucosa.The possible mechanism may derive from regulation of the body’s situation of immunological function，improvement and rehabilitation of the cell’s structure.
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Key words HPLC-UV compound nasal spray glycyrrhizin and hypersensitive rhinitis model pharmacodynamics flower flosmagˉnoliae guinea pig
过敏性鼻炎(allergic rhinitis)是一种反复发作性喷嚏、水样清涕、鼻塞为主要特征的鼻粘膜炎症。过敏性鼻炎是鼻腔粘膜的变态反应性疾病，根据不同临床特点，分为突发型和慢发型两种。突发型，患者病情会突然发作，感觉鼻痒眼痒，连续不停地打喷嚏、鼻塞、流清鼻涕，常在早上或环境气候急剧变化时发生。症状持续时间短，鼻腔内粘膜肿胀，有大量水状分泌物，发作过后，患者一切如常。慢发型，鼻痒和连续喷嚏等症状不明显，主要症状是间歇性鼻塞，鼻分泌物增多并向鼻咽部排放;分泌物中有大量嗜酸性粒细胞，鼻腔中鼻甲肿胀、湿润、颜色苍白、表面光滑;病情严重的患者鼻甲水肿或息肉样病变，鼻腔底部有水状分泌物滞留。过敏性鼻炎属于中医鼻鼽的范畴，历代医家均认为本病与风寒入侵密切相关，而风寒入侵又与卫外阳气不足有关。甘草甜素，主要成分为甘草酸，与肝脏胆固醇代谢酶有较强的亲和力，从而阻碍皮质醇与醛固酮的灭活，使用后显示明显的皮质激素样效应，如抗炎作用、抗过敏及保护膜结构等作用;可诱生γ-干扰素，增强NK细胞活性;能减轻肝细胞变性坏死、降低谷丙转氨酶，防止脂肪变性，促进胆红素代谢。辛夷具有收敛作用而保护鼻粘膜，并能促进粘膜分泌物的吸收，减轻炎症，并有利于鼻腔通畅，辛夷浸剂或煎剂均有浸润麻醉作用，辛夷水或醇提取物有降压作用，水煎剂对横纹肌有乙酰胆碱样作用，并能兴奋子宫平滑肌、亢奋肠蠕动、对多种致病菌有抑制作用，辛夷花化学成份含挥发油，主要为桉油精(cineole)、α-蒎烯(α-pinene)、α-松油醇(α-terpineol)等 [1～4] 。目前，国内外对过敏性鼻炎尚无特异性治疗药物。甘草甜素的抗过敏作用已为现代医学体内外实验所证实，但目前国内外尚无此药用于过敏性鼻炎治疗的公开报道。在原有辛夷滴鼻液的基础上加入甘草甜素制成鼻用喷雾剂，本文的研究目的是建立测定复方甘草和辛夷喷雾剂(甘辛喷雾剂)的含量的方法，考查其对过敏性鼻炎的治疗效果。
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1 材料与方法
1.1 受试动物和药物 选用健康无鼻炎的豚鼠50只，雌雄各半，体重为300～350g，新疆维吾尔自治区流行病研究所提供。甘草甜素(由甘草中提取制得);迪康-迪通鼻炎水为市售，成都迪康制药有限公司生产，批号010301;甲苯-2，4-二异氰酸酯(TDI)，上海试剂一厂生产。
1.2 甘辛喷雾剂的制备与含量测定 称取辛夷花500g，置于蒸馏容器中加适量水浸渍，蒸馏并浓缩后得到辛夷液 [5] ，将适量制得的甘草甜素加入辛夷液中，加入防腐剂等制成浅黄色的澄明液体，装入定量喷瓶中即得。用反相高效液相色谱法测定制剂中甘草酸的含量 [6] ，检测波长250nm，Zorbax ODS C 18 分析柱，流动相为甲醇:0.2mol/L醋酸铵:冰醋酸(67:33:1)。以甘草酸单铵为标准品(根据药典换算方法，甘草酸单铵0.2mg相当于甘草酸0.1959mg)进行线性试验;甘草酸单铵为标准品配成高、中、低3种不同浓度，加入已知浓度的制剂样品，进行回收率试 验;同一批号样品分别取样5份测定含量，计算精密度。结果表明重现性良好，RSD为1.63%。分别精密吸取甘草酸单铵标准品溶液，制剂溶液滤液各20μL进样，测定复方喷雾剂中甘草酸的含量。
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1.3 豚鼠鼻超敏反应模型 参考文献 [7] 的方法，选用健康豚鼠，将10%TDI橄榄油溶液10μL，用加样器滴入豚鼠双侧前鼻孔(每侧5μl，每日1次)，诱导豚鼠鼻超敏反应模型。
1.4 实验分组及给药方法 将50只豚鼠随机分为5组，每组10只，前4组为TDI诱导的超敏鼻炎模型动物组，后1组为健康动物组。(1)甘辛喷雾剂低剂量组(G 1 )，鼻孔内每日2次，每次每侧给予甘辛喷雾剂5μl(甘草酸含量为35.5μg/μl);(2)甘辛喷雾剂高剂量组(G2 )，用法同上，每次每侧10μl;(3)阳性对照组，迪康组(D)，用法同上，每日2次，每次每侧给予滴鼻剂10μl;(4)空白对照组(M)，除隔日给TDI外，还每日2次，每次每侧鼻内给橄榄油5μl;(5)正常动物对照组(Z):不用致敏药，每日2次，每次每侧鼻内给橄榄油5μl。各组连续给药8d后，处死豚鼠，取鼻粘膜组织做病理检查 [8，9] 。
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1.5 观察内容与方法 用药8天后，依照不同组别分批给甘辛喷雾剂(G 1 、G 2 )、迪康(D)、橄榄油(M、Z)30min后，再分别给TDI(G 1 、G 2 、M、D)，每侧5μl，30min后，按400mg/kg戊巴比妥钠麻醉，剥去上腭骨部皮肤，沿右侧鼻中隔外侧前庭壁剪断，向上翻开暴露鼻中隔及双侧鼻腔。取上、中及鼻中隔前段粘膜，固定于10%中性福尔马林溶液中，1周后石蜡包埋，HE染色。光镜检查，任选10个高倍视野，计算方法如下:(1)各种炎性细胞的浸润程度:“-”未见所要观察的细胞;“+”少数散落的细胞;“++”可见较多的细胞;“+++”占上皮的2/3以上。(2)上皮的化生程度:“+”小灶状或全部粘膜上皮的1/3以下;“++”占全部上皮的1/3～2/3;“+++”占全部上皮的2/3以上。(3)粘膜固有层的腺体增生程度:“+”腺体占粘膜固有层的1/3以下;“++”占粘膜固有层的1/3～2/3;“+++”占粘膜固有层的2/3以上。运用χ 2 检验，确切概率法计算。
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2 结果
2.1 含量测定方法及制剂含量测定结果 空白溶剂、甘草酸单铵标准品(主峰为甘草酸)、制剂样品的色谱图分别见图1a、b、c，结果显示，甘草酸的保留时间约在4.5min左右，溶剂峰在3min以前出现，不干扰测定，按甘草酸色谱峰计，理论塔板数约为2000。线性试验结果表明，甘草酸在标准曲线0.2～1.0μg/ml的浓度范围内呈良好线性关系(r=0.9999)。高、中、低3种不同浓度样品，测得甘草酸平均回收率为100.67%，结果见表1。精密度实验结果显示，在同一实验条件下，同一批号样品分别取样5份测定含量，结果表明重现性良好，平均RSD为1.63%。三批制剂样品中相对含量甘草酸的含量分别为3.66%、3.44%、3.50%。
2.2 药效学结果 在光镜下观察鼻粘膜组织的变化，甘辛喷雾剂及不同用药组的鼻粘膜呈现了不同的组织形态、结构变化，本实验观察了粘膜上皮及固有层的嗜酸性粒细胞、 嗜中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、腺体、上皮鳞状化生程度。结果见表2。
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图1 测定甘辛喷雾剂中甘草酸含量的高效液相色谱图。a空白溶剂，b甘草酸单铵标准品(主峰为甘草酸)，c制剂样品的色谱图
表1 样品中甘草酸单铵的加样回收率实验测得甘草酸的回收率结果
表2 复方甘草与辛夷鼻腔喷雾剂(甘辛喷雾剂)对甲苯-2，4-二异氰酸酯诱导的超敏鼻炎模型豚鼠细胞及组织的影响
注:与M组比较，χ 2 检验，确切概率法， P<0.05， P<0.01。G 1 :超敏鼻炎模型动物甘辛喷雾剂低剂量给药组;G 2 :超敏鼻炎模型动物超敏鼻炎模型动物高剂量给药组;D:超敏鼻炎模型动物市售迪康滴鼻剂阳性对照组;M:超敏鼻炎模型动物橄榄油空白对照组;Z:健康动物橄榄油空白对照组 正常对照组豚鼠鼻粘膜上皮部分完整，无糜烂，上皮下可见少量嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及少许其他炎症细胞，但淋巴细胞较多，粘膜固有层腺体增生，小血管扩张。而M组膜上皮完整无脱落伴鳞状上皮化生，上皮下可见大量嗜酸及慢性炎症细胞浸润，腺体明显增生。甘辛喷雾剂小剂量组粘膜上皮完整无脱落伴适度鳞状上皮化生，上皮下少量嗜酸性细胞及慢性炎症细胞浸润，有腺体增生现象，但是与模型空白组相比显著减轻。甘辛喷雾剂大剂量组粘膜上皮较为完整，粘膜内可见少量嗜中性粒及嗜酸性粒细胞浸润，散在中性粒细胞，其程度与小剂量组无明显区别，腺体增生较轻。迪康组与模型空白组比较，粘膜上皮鳞状化生较重，偶尔见轻度糜烂，上皮下可见嗜酸性粒细胞多量、嗜中性粒细胞浸润，腺体轻度增生，与模型组比较，差异不明显。
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3 讨论
依据文献报道甘草酸的药物定量分析方法，本试验以甘草酸单铵为标准品对甘辛喷雾剂中的甘草酸进行了定量分析。流动相中甲醇与水的比例对样品的分离度、灵敏度和保留时间影响很大，与相关文献报道一致 [6，10，11] ，实验结果表明，甘草酸与其他干扰峰的分离效果良好，结果稳定，适用于甘辛喷雾剂和其他含甘草制剂中甘草酸的含量测定。甘草酸在水溶液中溶解度较大，本法在样品处理过程中，以含水33%的流动相稀释溶解样品，溶解度良好，未观察到沉淀反应等。精密度、加样回收率实验表明，本方法稳定、准确、可靠。
变态反应型鼻炎属于IgE介导的Ⅰ型变态反应，除特异的免疫机制外，还有神经、内分泌及炎症反应的参与，而用2，4-二异氰酸苯甲酯(TDI)为致敏物的动物鼻超敏反应模型反应具有抗原性和非特异性刺激的双重特点，基本符合变应性的特征。据此，本实验建立了豚鼠鼻超敏反应的动物实验模型对甘辛喷雾剂进行鼻粘膜组织学结构和反应的观察。表2实验结果显示出，TDI致敏的鼻粘膜上皮下嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞大量浸润，腺体明显增生，鼻粘膜组胺明显增加，表明了Ⅰ型变态反应的参与。TDI可致鼻粘膜炎症损伤和非特异性刺激，如果致敏剂量过大还可以引起呼吸道和肺的剧烈反应，使动物肺出血死亡(本实验中豚鼠共死亡18只)，并在实验中都得到了证明。
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依照中医理论，甘草具有抗炎解毒、益气补中等功效。辛夷则性温，有散风寒、通鼻窍等功能，且有收缩鼻粘膜血 管和抗菌作用 [8] 。从实验结果来看，甘辛喷雾剂不同组剂量均在一定程度上使鼻粘膜上皮下嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜中性粒细胞减少，腺体增生和分泌亢进得到有效的抑制，即抑制了Ⅰ型变态反应的过程。所以，甘辛喷雾剂对过敏性鼻炎有积极的治疗意义。由于样本数偏少，而空白对照组动物本身有一定的急慢性炎症表现，结果显示，与模型对照比较，包括迪康阳性对照组，显示出统计学的差异，但有必要日后扩大样本再次进行检验。就作用机制而言，推测甘辛喷雾剂扶正祛邪，温阳固表。治疗本病的可能途径有两个方面，一方面调整机体免疫状态，降低了机体对致敏原的易感性，收缩血管，控制炎症渗出和浸润，抑制肥大细胞脱颗粒;另一方面改善和修复细胞的结构和形态，恢复其生理功能，促进细胞新生，加强粘膜屏障，减少变态反应的发生。以上所说与临床资料的提示是一致的。
参考文献
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7 赵秀杰，董震，杨占泉，等.鼻超敏反应实验模型的建立.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，28(1):17.
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9 钱颜方，孙海英，李炳文，等.克鼻敏对豚鼠超敏鼻炎模型电镜光镜的病理观察.北京中医药大学学报，1999，23(6):36-38.
10 Ishiwata S，Nakashita K，Niizeki M，et al.Determination of serum conˉcentrations of glycyrrhizin in humans by semi-microhigh-perforˉmance liquid chromatography after administration of a therapeutic dose.Biol Pharm Bull，2000，23(8):904-905.
11 Okamura N，Maki T，Miyauchi H，Shimoe M，Yokono S，Yoshitomi H，Yagi A.Simultaneous determination of glycyrrhizin，glycyrrhetic acid and glycyrrhetic acid mono-glucuronide in Shakuyaku-kanzo-to inˉcubated with rat feces by semi-micro high-performance liquid chroˉmatography.Biol Pharm Bull，2001，24(10):1161-1164.
作者单位:832002新疆石河子大学药学院
100083北京大学药学院药剂系
通讯作者:Tel:010-82802683，luwl@bjmu.edu.cn
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关键词 HPLC-UV 甘辛喷雾剂 豚鼠 超敏性鼻炎模型 药效学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)01-0001-04
Determination of glycyrrhizin acid in compound nasal spray ofglycyrrhizin
and flower flos magnoliae using HPLC-UV and therapeutic
effect of the formulation on guinea pig’s hypersensitive rhinitis
Chen Wen，Liu Qinghua，Lv Wanliang
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【Abstract】 Objective To establish HPLC-UV method for determination of glycyrrhizin acid in compound nasal spray of glycyrrhizin and flower flos magnoliae，the chief active ingredient of formulation，glycyrrhizin acid，and to observethe therapeutic effect of this formulation on guinea pig’s hypersensitive rhinitis.Methods A compound nasal spray formulation was prepared using extracts of glycyrrhizin and measured by HPLC-UV method.Mobile phase conˉsisted of methanol，0.2mol/L ammonium acetate and glacial acetic acid(67:33:1，v/v)，analytical column was Zorbax ODS C 18 and wavelength250nm.Guinea pig’s hypersensitive rhinitis was induced using toluene-2，4-diisocyanate(TDI).Fifty guinea pigs were equally divided into5groups among which guinea pigs of4groups were of hypersensiˉtive rhinitis and of1group were healthy(normal animals).High and low doses of formulation(contained710and355μg of glycyrrhizin acid)were administered by nasal spraying to guinea pigs at every12h and given continuously for8days.Commercial nasal drop(DIKANG nasal drop)and olive oil were given as a positive and a blank control，respecˉtively.In addition，olive oil was given to healthy animals as a normal control.After8days，animals were sacrificed and nasal mucosa of each animal was removed for phathological examination.Results Peak of glycyrrhizin acid appeared at4.5min in HLPC-UV chromatogram.Other peaks did not disturb the measurement.A linear relationship range was from0.2to1.0μg/ml(r=0.9999).The mean recovery was(100.67±4.44)%and inter-day relative standard deviation1.63%.In comparison with blank control group，infiltration of eosinophilic granulocyte，neutrophilic granuloˉcyte and lymphocyte arising from rhinitis were significantly reduced(P<0.01)by administration of high and low dosˉes offormulation，and gland hyperplasia and secretion were obviously inhibited(P<0.05).The therapeuticeffect was similar to that of positive control group.Conclusion The HPLC-UV is simple and stable for determination glycyrrhizin acid in compound nasal spray of glycyrrhizin and flower flos magnoliae.This compound formulation significantly inhibits the course of the typeI allergic reaction and protects the structure of nasal mucosa.The possible mechanism may derive from regulation of the body’s situation of immunological function，improvement and rehabilitation of the cell’s structure.
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Key words HPLC-UV compound nasal spray glycyrrhizin and hypersensitive rhinitis model pharmacodynamics flower flosmagˉnoliae guinea pig
过敏性鼻炎(allergic rhinitis)是一种反复发作性喷嚏、水样清涕、鼻塞为主要特征的鼻粘膜炎症。过敏性鼻炎是鼻腔粘膜的变态反应性疾病，根据不同临床特点，分为突发型和慢发型两种。突发型，患者病情会突然发作，感觉鼻痒眼痒，连续不停地打喷嚏、鼻塞、流清鼻涕，常在早上或环境气候急剧变化时发生。症状持续时间短，鼻腔内粘膜肿胀，有大量水状分泌物，发作过后，患者一切如常。慢发型，鼻痒和连续喷嚏等症状不明显，主要症状是间歇性鼻塞，鼻分泌物增多并向鼻咽部排放;分泌物中有大量嗜酸性粒细胞，鼻腔中鼻甲肿胀、湿润、颜色苍白、表面光滑;病情严重的患者鼻甲水肿或息肉样病变，鼻腔底部有水状分泌物滞留。过敏性鼻炎属于中医鼻鼽的范畴，历代医家均认为本病与风寒入侵密切相关，而风寒入侵又与卫外阳气不足有关。甘草甜素，主要成分为甘草酸，与肝脏胆固醇代谢酶有较强的亲和力，从而阻碍皮质醇与醛固酮的灭活，使用后显示明显的皮质激素样效应，如抗炎作用、抗过敏及保护膜结构等作用;可诱生γ-干扰素，增强NK细胞活性;能减轻肝细胞变性坏死、降低谷丙转氨酶，防止脂肪变性，促进胆红素代谢。辛夷具有收敛作用而保护鼻粘膜，并能促进粘膜分泌物的吸收，减轻炎症，并有利于鼻腔通畅，辛夷浸剂或煎剂均有浸润麻醉作用，辛夷水或醇提取物有降压作用，水煎剂对横纹肌有乙酰胆碱样作用，并能兴奋子宫平滑肌、亢奋肠蠕动、对多种致病菌有抑制作用，辛夷花化学成份含挥发油，主要为桉油精(cineole)、α-蒎烯(α-pinene)、α-松油醇(α-terpineol)等 [1～4] 。目前，国内外对过敏性鼻炎尚无特异性治疗药物。甘草甜素的抗过敏作用已为现代医学体内外实验所证实，但目前国内外尚无此药用于过敏性鼻炎治疗的公开报道。在原有辛夷滴鼻液的基础上加入甘草甜素制成鼻用喷雾剂，本文的研究目的是建立测定复方甘草和辛夷喷雾剂(甘辛喷雾剂)的含量的方法，考查其对过敏性鼻炎的治疗效果。
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1 材料与方法
1.1 受试动物和药物 选用健康无鼻炎的豚鼠50只，雌雄各半，体重为300～350g，新疆维吾尔自治区流行病研究所提供。甘草甜素(由甘草中提取制得);迪康-迪通鼻炎水为市售，成都迪康制药有限公司生产，批号010301;甲苯-2，4-二异氰酸酯(TDI)，上海试剂一厂生产。
1.2 甘辛喷雾剂的制备与含量测定 称取辛夷花500g，置于蒸馏容器中加适量水浸渍，蒸馏并浓缩后得到辛夷液 [5] ，将适量制得的甘草甜素加入辛夷液中，加入防腐剂等制成浅黄色的澄明液体，装入定量喷瓶中即得。用反相高效液相色谱法测定制剂中甘草酸的含量 [6] ，检测波长250nm，Zorbax ODS C 18 分析柱，流动相为甲醇:0.2mol/L醋酸铵:冰醋酸(67:33:1)。以甘草酸单铵为标准品(根据药典换算方法，甘草酸单铵0.2mg相当于甘草酸0.1959mg)进行线性试验;甘草酸单铵为标准品配成高、中、低3种不同浓度，加入已知浓度的制剂样品，进行回收率试 验;同一批号样品分别取样5份测定含量，计算精密度。结果表明重现性良好，RSD为1.63%。分别精密吸取甘草酸单铵标准品溶液，制剂溶液滤液各20μL进样，测定复方喷雾剂中甘草酸的含量。
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1.3 豚鼠鼻超敏反应模型 参考文献 [7] 的方法，选用健康豚鼠，将10%TDI橄榄油溶液10μL，用加样器滴入豚鼠双侧前鼻孔(每侧5μl，每日1次)，诱导豚鼠鼻超敏反应模型。
1.4 实验分组及给药方法 将50只豚鼠随机分为5组，每组10只，前4组为TDI诱导的超敏鼻炎模型动物组，后1组为健康动物组。(1)甘辛喷雾剂低剂量组(G 1 )，鼻孔内每日2次，每次每侧给予甘辛喷雾剂5μl(甘草酸含量为35.5μg/μl);(2)甘辛喷雾剂高剂量组(G2 )，用法同上，每次每侧10μl;(3)阳性对照组，迪康组(D)，用法同上，每日2次，每次每侧给予滴鼻剂10μl;(4)空白对照组(M)，除隔日给TDI外，还每日2次，每次每侧鼻内给橄榄油5μl;(5)正常动物对照组(Z):不用致敏药，每日2次，每次每侧鼻内给橄榄油5μl。各组连续给药8d后，处死豚鼠，取鼻粘膜组织做病理检查 [8，9] 。
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1.5 观察内容与方法 用药8天后，依照不同组别分批给甘辛喷雾剂(G 1 、G 2 )、迪康(D)、橄榄油(M、Z)30min后，再分别给TDI(G 1 、G 2 、M、D)，每侧5μl，30min后，按400mg/kg戊巴比妥钠麻醉，剥去上腭骨部皮肤，沿右侧鼻中隔外侧前庭壁剪断，向上翻开暴露鼻中隔及双侧鼻腔。取上、中及鼻中隔前段粘膜，固定于10%中性福尔马林溶液中，1周后石蜡包埋，HE染色。光镜检查，任选10个高倍视野，计算方法如下:(1)各种炎性细胞的浸润程度:“-”未见所要观察的细胞;“+”少数散落的细胞;“++”可见较多的细胞;“+++”占上皮的2/3以上。(2)上皮的化生程度:“+”小灶状或全部粘膜上皮的1/3以下;“++”占全部上皮的1/3～2/3;“+++”占全部上皮的2/3以上。(3)粘膜固有层的腺体增生程度:“+”腺体占粘膜固有层的1/3以下;“++”占粘膜固有层的1/3～2/3;“+++”占粘膜固有层的2/3以上。运用χ 2 检验，确切概率法计算。
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2 结果
2.1 含量测定方法及制剂含量测定结果 空白溶剂、甘草酸单铵标准品(主峰为甘草酸)、制剂样品的色谱图分别见图1a、b、c，结果显示，甘草酸的保留时间约在4.5min左右，溶剂峰在3min以前出现，不干扰测定，按甘草酸色谱峰计，理论塔板数约为2000。线性试验结果表明，甘草酸在标准曲线0.2～1.0μg/ml的浓度范围内呈良好线性关系(r=0.9999)。高、中、低3种不同浓度样品，测得甘草酸平均回收率为100.67%，结果见表1。精密度实验结果显示，在同一实验条件下，同一批号样品分别取样5份测定含量，结果表明重现性良好，平均RSD为1.63%。三批制剂样品中相对含量甘草酸的含量分别为3.66%、3.44%、3.50%。
2.2 药效学结果 在光镜下观察鼻粘膜组织的变化，甘辛喷雾剂及不同用药组的鼻粘膜呈现了不同的组织形态、结构变化，本实验观察了粘膜上皮及固有层的嗜酸性粒细胞、 嗜中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、腺体、上皮鳞状化生程度。结果见表2。
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图1 测定甘辛喷雾剂中甘草酸含量的高效液相色谱图。a空白溶剂，b甘草酸单铵标准品(主峰为甘草酸)，c制剂样品的色谱图
表1 样品中甘草酸单铵的加样回收率实验测得甘草酸的回收率结果
表2 复方甘草与辛夷鼻腔喷雾剂(甘辛喷雾剂)对甲苯-2，4-二异氰酸酯诱导的超敏鼻炎模型豚鼠细胞及组织的影响
注:与M组比较，χ 2 检验，确切概率法， P<0.05， P<0.01。G 1 :超敏鼻炎模型动物甘辛喷雾剂低剂量给药组;G 2 :超敏鼻炎模型动物超敏鼻炎模型动物高剂量给药组;D:超敏鼻炎模型动物市售迪康滴鼻剂阳性对照组;M:超敏鼻炎模型动物橄榄油空白对照组;Z:健康动物橄榄油空白对照组 正常对照组豚鼠鼻粘膜上皮部分完整，无糜烂，上皮下可见少量嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及少许其他炎症细胞，但淋巴细胞较多，粘膜固有层腺体增生，小血管扩张。而M组膜上皮完整无脱落伴鳞状上皮化生，上皮下可见大量嗜酸及慢性炎症细胞浸润，腺体明显增生。甘辛喷雾剂小剂量组粘膜上皮完整无脱落伴适度鳞状上皮化生，上皮下少量嗜酸性细胞及慢性炎症细胞浸润，有腺体增生现象，但是与模型空白组相比显著减轻。甘辛喷雾剂大剂量组粘膜上皮较为完整，粘膜内可见少量嗜中性粒及嗜酸性粒细胞浸润，散在中性粒细胞，其程度与小剂量组无明显区别，腺体增生较轻。迪康组与模型空白组比较，粘膜上皮鳞状化生较重，偶尔见轻度糜烂，上皮下可见嗜酸性粒细胞多量、嗜中性粒细胞浸润，腺体轻度增生，与模型组比较，差异不明显。
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3 讨论
依据文献报道甘草酸的药物定量分析方法，本试验以甘草酸单铵为标准品对甘辛喷雾剂中的甘草酸进行了定量分析。流动相中甲醇与水的比例对样品的分离度、灵敏度和保留时间影响很大，与相关文献报道一致 [6，10，11] ，实验结果表明，甘草酸与其他干扰峰的分离效果良好，结果稳定，适用于甘辛喷雾剂和其他含甘草制剂中甘草酸的含量测定。甘草酸在水溶液中溶解度较大，本法在样品处理过程中，以含水33%的流动相稀释溶解样品，溶解度良好，未观察到沉淀反应等。精密度、加样回收率实验表明，本方法稳定、准确、可靠。
变态反应型鼻炎属于IgE介导的Ⅰ型变态反应，除特异的免疫机制外，还有神经、内分泌及炎症反应的参与，而用2，4-二异氰酸苯甲酯(TDI)为致敏物的动物鼻超敏反应模型反应具有抗原性和非特异性刺激的双重特点，基本符合变应性的特征。据此，本实验建立了豚鼠鼻超敏反应的动物实验模型对甘辛喷雾剂进行鼻粘膜组织学结构和反应的观察。表2实验结果显示出，TDI致敏的鼻粘膜上皮下嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞大量浸润，腺体明显增生，鼻粘膜组胺明显增加，表明了Ⅰ型变态反应的参与。TDI可致鼻粘膜炎症损伤和非特异性刺激，如果致敏剂量过大还可以引起呼吸道和肺的剧烈反应，使动物肺出血死亡(本实验中豚鼠共死亡18只)，并在实验中都得到了证明。
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依照中医理论，甘草具有抗炎解毒、益气补中等功效。辛夷则性温，有散风寒、通鼻窍等功能，且有收缩鼻粘膜血 管和抗菌作用 [8] 。从实验结果来看，甘辛喷雾剂不同组剂量均在一定程度上使鼻粘膜上皮下嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜中性粒细胞减少，腺体增生和分泌亢进得到有效的抑制，即抑制了Ⅰ型变态反应的过程。所以，甘辛喷雾剂对过敏性鼻炎有积极的治疗意义。由于样本数偏少，而空白对照组动物本身有一定的急慢性炎症表现，结果显示，与模型对照比较，包括迪康阳性对照组，显示出统计学的差异，但有必要日后扩大样本再次进行检验。就作用机制而言，推测甘辛喷雾剂扶正祛邪，温阳固表。治疗本病的可能途径有两个方面，一方面调整机体免疫状态，降低了机体对致敏原的易感性，收缩血管，控制炎症渗出和浸润，抑制肥大细胞脱颗粒;另一方面改善和修复细胞的结构和形态，恢复其生理功能，促进细胞新生，加强粘膜屏障，减少变态反应的发生。以上所说与临床资料的提示是一致的。
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作者单位:832002新疆石河子大学药学院
100083北京大学药学院药剂系
通讯作者:Tel:010-82802683，luwl@bjmu.edu.cn
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