抑癌基因和耐药基因在胃癌中的表达及其意义
【摘要】 目的 检测人体胃癌组织中抑癌基因p53、Rb和耐药基因P-gp、TopoⅡ、GST-π的表达情况，并探讨其临床意义。方法 应用S-P免疫组织化学方法检测了120例胃癌组织中p53、Rb、P-gp、TopoⅡ和GST-π的表达情况，并分析其与相关临床资料的关系。结果 120例胃癌标本中，p53表达阳性率为76.7%，与肿瘤的TNM分期无关;Rb阴性率为20.8%，与远处淋巴结转移呈正相关(P<0.05);P-gp阳性率为21.7%，与病人年龄呈正相关(P<0.05);TopoⅡ阴性率和GST-π阳性率分别为55.6%和43.8%，胃癌的浸润深度分别与TopoⅡ阴性和GST-π阴性呈正相关性(P<0.05)。5种被检基因中仅有TopoⅡ与GST-π的表达具有相关性(P<0.05)。结论 (1)胃癌患者的化疗是有必要的;(2)有远处淋巴结转移的病例不宜选用抗代谢药;(3)老年胃癌病人选择抗癌药时要慎重，必要时可给予耐药修饰剂;(4)肿瘤浸润严重者，可选择顺铂而非阿霉素、VP-16等;(5)根据耐药基因的检测结果作出“个体化”治疗方案是提高胃癌化疗效果的新途径。
, 百拇医药
关键词 胃癌 p53 Rb P-gp TopoⅡ GST-π
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)06-0487-03
Expression of tumor suppressor genes and drug-resistance genes
and its clinical significance in human gastric cancer
Yu Zhen，Chen Bicheng，Chen Zongjing，et al.
Department of Surgery，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou325000.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To detect the expression of p53，Rb，P-gp，TopoⅡ，GST-πin human gastric cancer and explore their clinical significance.Method The immunohistochemical expression of p53，Rb，P-gp，TopoⅡ，GST-πwas examined in120patients with gastric cancer.The correlation between the expression and some clinical data were analyzed.Result The total positive rate of p53was76.7%(92/120)，There were no significant correlaˉtions between the expression and pathologicTMN stage.The negative expression rate of Rb protein was20.8%(25/120).There were significant correlations between the negative expression of Rb protein and lymphatic metastasis(P<0.05).And the positive rate of P-gp was21.7%(26/120)，which was significantly correlated with age(P<0.05).The total negative expression rate of TopoⅡand positive expression rate of GST-πwere55.6%(50/90)and43.8%(39/89)，respectively.There were significant correlations between the negative expression and the depth of invasion both TopoⅡand GST-π(P<0.05).There were only significant correlated between TopoⅡand GST-πamong these five genes(P<0.05).Conclussion (1)It is necessary for patients suffering from gastric cancer to receive chemotherapy.(2)It isn’t suitable for patients with lymph nodes metastasis to receive antimetabolite drug.(3)Resisˉtance modifer should be applied to the aged patients.(4)Cis-platinum but not adriamycinum or VP-16will be seˉlected for patients with invasion depthly.(5)The“individualization”therapy made by the detection of drug resistance genes will be a new therapy to rise the effect of chemotherapy for gastric cancer.
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Key words gastric cancer p53 RbP-gp TopoⅡ GST-π
胃癌的化疗效果至今并不理想，其最主要的原因是肿瘤细胞本身存在着多药耐药性(multidrug resistance，MDR)。如何通过检测胃癌细胞的MDR，以便合理选择敏感抗癌药，并制定胃癌的“个体化”治疗方案，是提高胃癌化疗效果的关键，但目前尚未见这方面的报道。我们试图通过检测胃癌组织中p53、视网膜母细胞瘤基因(Rb)、MDR产物P-糖蛋白(P-gp)、DNA拓扑异构酶(TopoⅡ)、谷胱甘肽S转移酶(GST-π)等耐药基因的表达情况，以探讨胃癌的敏感抗癌药。
1 材料和方法
1.1 标本 本组120例标本均为我院自1999～2002年手术切除的胃癌标本，男93例，女27例，年龄27～89岁，平均59.0岁。所有病例术前均未化疗。
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1.2 标本处理及免疫组织化学染色 标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4μm厚。常规HE染色，确定病理类型。采用S-P免疫组化染色方法。鼠抗人p53(DO-7)、Rb(1F8)、P-gp(JSB1)、TopoⅡ(SWT3D1)和GST-π(353-10)即用型单克隆抗体、检测试剂盒(KIT-9702)、阳性对照均购自福州迈新公司。染色步骤按产品说明书进行，加入一抗之前应用微波修复，DAB显色、PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果
判断 p53、Rb阳性为胞核染成棕黄色，阳性细胞数>5%的p53及阳性细胞数>10%的Rb即判为阳性:P-gp以胞质和胞膜染成黄色、棕色或深棕色为阳性细胞，阳性细胞≥1%即判为阳性;TopoⅡ和GST-π分别以胞核和胞浆染成黄色、棕黄色或棕色为阳性细胞，阳性细胞≥1%即判为阳性。五者均以无着色或与背景颜色一致者判为阴性。
1.4 统计学方法 数据用均数±标准差表示，根据各参数的分布状态和各因数相关性比较分析的需要分别采用t检验和相关分析，P<0.05表示差异有显著性。所有统计参 数均采用SPSS10.0软件包进行统计分析。
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2 结果
2.1 5种耐药基因在胃癌组织中的表达 见表1。
2.2 5种耐药基因表达结果与抗癌药的选择 见表2。
2.3 5种耐药基因与病人年龄、浸润深度、淋巴结转移关系
见表3。
2.4 5种耐药基因表达的相关性 仅有TopoⅡ与GST-π的表达有相关性，P=0.007。
表1 5种耐药基因在胃癌组织中的表达 例(略)
表2 5种耐药基因表达结果与抗癌药的选择(略)
表3 5种耐药基因与病人年龄、浸润深度、淋巴结转移相关性(略)
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3 讨论
许多证据表明，化疗失败最主要的原因是肿瘤细胞本身产生抗药性，MDR是指肿瘤细胞接触了一些化疗药物之后，不仅对该药产生抗药性，而且对其它结构及作用机制不同的药物也产生抗药性，其机理可能与下列因素有关:①癌细胞内存在P-gp，能把进入癌细胞中的抗癌药泵出细胞外;②抗癌药的靶蛋白-TopoⅡ的活性降低;③癌细胞解毒机制的增强，许多毒性很大的烷基化和重金属抗癌药如顺铂等很容易诱导GST-π活性的增加，从而达到耐药性。
临床上P-gp基因表达阳性者能将:①具有芳香杂环的抗癌药;②具有疏水性的抗癌药;③带有正电荷氮残基的抗癌药泵出细胞外，因此，在治疗方案中不宜选用，必要时需给予耐药修饰剂如异搏定、硝苯吡啶、环胞素A等;Topo Ⅱ阴性者对天然或半天然抗癌药如阿霉素、长春碱、VP-16等耐药;GST-π阳性者对烷化剂、蒽环类、铂类化合物等耐药 [1] 。另外，突变型p53基因阳性者对DNA损伤剂(阿霉素、烷化剂、丝裂霉素、长春碱等)抗药 [2] ;同时伴有Rb阴性者不仅对DNA损伤剂耐药，而且对抗代谢药(5-FU、氨甲蝶呤、阿糖胞苷等)耐药 [3] 。临床上通过对耐药基因的检测，有助于合理选择抗癌药，并减少药物的毒副作用，防止多重抗药性的诱生。
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从表1可以看出p53的阳性率较高(76.7%)，Rb阴性为20.8%，与Geradts等 [4] 报道的20.0%相一致，而P-gp阳性比较低(约21%)，TopoⅡ阳性、GST-π阳性均接近50%，因此，选择抗代谢药如5-FU等治疗胃癌应是有一定的依据的，但也有大约1/4病人是无效的。
表2说明没有耐所有抗癌药的胃癌病例，也极少有对所有抗癌药均敏感的胃癌细胞(5.3%)。约有6.9%的胃癌病人既抗代谢药，又抗DNA损伤剂;而14.9%的病人对二药均敏感;其余78.2%的病人对二者之一敏感，提示胃癌病人化疗的必要性。
表3表明p53与肿瘤的TNM分期无关，远处淋巴结转移与Rb阴性呈正相关，说明有远处淋巴结转移的病例不宜选用抗代谢药;病人年龄与P-gp阳性呈正相关，提示老年胃癌病人选择抗癌药时要慎重;肿瘤浸润深度与TopoⅡ和GST-π阴性呈正相关性，提示肿瘤浸润越深，越要避免天然或半天然抗癌药，而可选择重金属类抗癌药物。因此，上述结果不仅揭示了胃癌化疗的复杂性，而且可以解释既往一、二种胃癌化疗方案疗效不佳的原因。
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结论:(1)胃癌患者的化疗是有必要的;(2)有远处淋巴结转移的病例不宜选用抗代谢药;(3)老年胃癌病人选择抗癌药时要慎重，必要时可给予化疗增敏剂或逆转药物;(4)肿瘤浸润严重者，可选择顺铂而非阿霉素、VP-16等;(5) 根据耐药基因的检测结果作出“个体化”治疗方案是提高胃癌化疗效果的新途径。
参考文献
1 Pifferi A，Filppini C，Capolongo L，et al.Flow cytometric detection of glutathione S-transferase isoenzymes by quantitative immunofluoˉrescence under nonsaturating conditions.Cytometry，1995，20(2):134-145.
2 Wang J，Bucana CD，Roth JA，et al.Apoptosis induced in human osˉteosarcoma cells is one of the mechanisms for the cytocidal effect of Ad5CMV-p53.Cancer Gene Ther，1995，2(1):9-17.
, 百拇医药
3 Banerjee D，Ercikan-Abali E，Waltham M，et al.Molecular mechaˉnisms of resistance to antifolates，a review.Acta Biochim Pol，1995，42(4):457-464.
4 Geradts J，Kratzke RA，Niehans GA，et al.Immunohistochemical detecˉtion of the cyclin-dependent kinase inhibitor2/multiple tumor suppresˉsor gene1(CDKN2/MTSI)product p16INK4A in archival human solid tumors:correlation with retinoblastoma protein expression.Cancer Res，1995，55(24):6006-6011.
(收稿日期:2003-06-01) (编辑 一坤), http://www.100md.com(余震)
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关键词 胃癌 p53 Rb P-gp TopoⅡ GST-π
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)06-0487-03
Expression of tumor suppressor genes and drug-resistance genes
and its clinical significance in human gastric cancer
Yu Zhen，Chen Bicheng，Chen Zongjing，et al.
Department of Surgery，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou325000.
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【Abstract】 Objective To detect the expression of p53，Rb，P-gp，TopoⅡ，GST-πin human gastric cancer and explore their clinical significance.Method The immunohistochemical expression of p53，Rb，P-gp，TopoⅡ，GST-πwas examined in120patients with gastric cancer.The correlation between the expression and some clinical data were analyzed.Result The total positive rate of p53was76.7%(92/120)，There were no significant correlaˉtions between the expression and pathologicTMN stage.The negative expression rate of Rb protein was20.8%(25/120).There were significant correlations between the negative expression of Rb protein and lymphatic metastasis(P<0.05).And the positive rate of P-gp was21.7%(26/120)，which was significantly correlated with age(P<0.05).The total negative expression rate of TopoⅡand positive expression rate of GST-πwere55.6%(50/90)and43.8%(39/89)，respectively.There were significant correlations between the negative expression and the depth of invasion both TopoⅡand GST-π(P<0.05).There were only significant correlated between TopoⅡand GST-πamong these five genes(P<0.05).Conclussion (1)It is necessary for patients suffering from gastric cancer to receive chemotherapy.(2)It isn’t suitable for patients with lymph nodes metastasis to receive antimetabolite drug.(3)Resisˉtance modifer should be applied to the aged patients.(4)Cis-platinum but not adriamycinum or VP-16will be seˉlected for patients with invasion depthly.(5)The“individualization”therapy made by the detection of drug resistance genes will be a new therapy to rise the effect of chemotherapy for gastric cancer.
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Key words gastric cancer p53 RbP-gp TopoⅡ GST-π
胃癌的化疗效果至今并不理想，其最主要的原因是肿瘤细胞本身存在着多药耐药性(multidrug resistance，MDR)。如何通过检测胃癌细胞的MDR，以便合理选择敏感抗癌药，并制定胃癌的“个体化”治疗方案，是提高胃癌化疗效果的关键，但目前尚未见这方面的报道。我们试图通过检测胃癌组织中p53、视网膜母细胞瘤基因(Rb)、MDR产物P-糖蛋白(P-gp)、DNA拓扑异构酶(TopoⅡ)、谷胱甘肽S转移酶(GST-π)等耐药基因的表达情况，以探讨胃癌的敏感抗癌药。
1 材料和方法
1.1 标本 本组120例标本均为我院自1999～2002年手术切除的胃癌标本，男93例，女27例，年龄27～89岁，平均59.0岁。所有病例术前均未化疗。
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1.2 标本处理及免疫组织化学染色 标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4μm厚。常规HE染色，确定病理类型。采用S-P免疫组化染色方法。鼠抗人p53(DO-7)、Rb(1F8)、P-gp(JSB1)、TopoⅡ(SWT3D1)和GST-π(353-10)即用型单克隆抗体、检测试剂盒(KIT-9702)、阳性对照均购自福州迈新公司。染色步骤按产品说明书进行，加入一抗之前应用微波修复，DAB显色、PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果
判断 p53、Rb阳性为胞核染成棕黄色，阳性细胞数>5%的p53及阳性细胞数>10%的Rb即判为阳性:P-gp以胞质和胞膜染成黄色、棕色或深棕色为阳性细胞，阳性细胞≥1%即判为阳性;TopoⅡ和GST-π分别以胞核和胞浆染成黄色、棕黄色或棕色为阳性细胞，阳性细胞≥1%即判为阳性。五者均以无着色或与背景颜色一致者判为阴性。
1.4 统计学方法 数据用均数±标准差表示，根据各参数的分布状态和各因数相关性比较分析的需要分别采用t检验和相关分析，P<0.05表示差异有显著性。所有统计参 数均采用SPSS10.0软件包进行统计分析。
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2 结果
2.1 5种耐药基因在胃癌组织中的表达 见表1。
2.2 5种耐药基因表达结果与抗癌药的选择 见表2。
2.3 5种耐药基因与病人年龄、浸润深度、淋巴结转移关系
见表3。
2.4 5种耐药基因表达的相关性 仅有TopoⅡ与GST-π的表达有相关性，P=0.007。
表1 5种耐药基因在胃癌组织中的表达 例(略)
表2 5种耐药基因表达结果与抗癌药的选择(略)
表3 5种耐药基因与病人年龄、浸润深度、淋巴结转移相关性(略)
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3 讨论
许多证据表明，化疗失败最主要的原因是肿瘤细胞本身产生抗药性，MDR是指肿瘤细胞接触了一些化疗药物之后，不仅对该药产生抗药性，而且对其它结构及作用机制不同的药物也产生抗药性，其机理可能与下列因素有关:①癌细胞内存在P-gp，能把进入癌细胞中的抗癌药泵出细胞外;②抗癌药的靶蛋白-TopoⅡ的活性降低;③癌细胞解毒机制的增强，许多毒性很大的烷基化和重金属抗癌药如顺铂等很容易诱导GST-π活性的增加，从而达到耐药性。
临床上P-gp基因表达阳性者能将:①具有芳香杂环的抗癌药;②具有疏水性的抗癌药;③带有正电荷氮残基的抗癌药泵出细胞外，因此，在治疗方案中不宜选用，必要时需给予耐药修饰剂如异搏定、硝苯吡啶、环胞素A等;Topo Ⅱ阴性者对天然或半天然抗癌药如阿霉素、长春碱、VP-16等耐药;GST-π阳性者对烷化剂、蒽环类、铂类化合物等耐药 [1] 。另外，突变型p53基因阳性者对DNA损伤剂(阿霉素、烷化剂、丝裂霉素、长春碱等)抗药 [2] ;同时伴有Rb阴性者不仅对DNA损伤剂耐药，而且对抗代谢药(5-FU、氨甲蝶呤、阿糖胞苷等)耐药 [3] 。临床上通过对耐药基因的检测，有助于合理选择抗癌药，并减少药物的毒副作用，防止多重抗药性的诱生。
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从表1可以看出p53的阳性率较高(76.7%)，Rb阴性为20.8%，与Geradts等 [4] 报道的20.0%相一致，而P-gp阳性比较低(约21%)，TopoⅡ阳性、GST-π阳性均接近50%，因此，选择抗代谢药如5-FU等治疗胃癌应是有一定的依据的，但也有大约1/4病人是无效的。
表2说明没有耐所有抗癌药的胃癌病例，也极少有对所有抗癌药均敏感的胃癌细胞(5.3%)。约有6.9%的胃癌病人既抗代谢药，又抗DNA损伤剂;而14.9%的病人对二药均敏感;其余78.2%的病人对二者之一敏感，提示胃癌病人化疗的必要性。
表3表明p53与肿瘤的TNM分期无关，远处淋巴结转移与Rb阴性呈正相关，说明有远处淋巴结转移的病例不宜选用抗代谢药;病人年龄与P-gp阳性呈正相关，提示老年胃癌病人选择抗癌药时要慎重;肿瘤浸润深度与TopoⅡ和GST-π阴性呈正相关性，提示肿瘤浸润越深，越要避免天然或半天然抗癌药，而可选择重金属类抗癌药物。因此，上述结果不仅揭示了胃癌化疗的复杂性，而且可以解释既往一、二种胃癌化疗方案疗效不佳的原因。
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结论:(1)胃癌患者的化疗是有必要的;(2)有远处淋巴结转移的病例不宜选用抗代谢药;(3)老年胃癌病人选择抗癌药时要慎重，必要时可给予化疗增敏剂或逆转药物;(4)肿瘤浸润严重者，可选择顺铂而非阿霉素、VP-16等;(5) 根据耐药基因的检测结果作出“个体化”治疗方案是提高胃癌化疗效果的新途径。
参考文献
1 Pifferi A，Filppini C，Capolongo L，et al.Flow cytometric detection of glutathione S-transferase isoenzymes by quantitative immunofluoˉrescence under nonsaturating conditions.Cytometry，1995，20(2):134-145.
2 Wang J，Bucana CD，Roth JA，et al.Apoptosis induced in human osˉteosarcoma cells is one of the mechanisms for the cytocidal effect of Ad5CMV-p53.Cancer Gene Ther，1995，2(1):9-17.
, 百拇医药
3 Banerjee D，Ercikan-Abali E，Waltham M，et al.Molecular mechaˉnisms of resistance to antifolates，a review.Acta Biochim Pol，1995，42(4):457-464.
4 Geradts J，Kratzke RA，Niehans GA，et al.Immunohistochemical detecˉtion of the cyclin-dependent kinase inhibitor2/multiple tumor suppresˉsor gene1(CDKN2/MTSI)product p16INK4A in archival human solid tumors:correlation with retinoblastoma protein expression.Cancer Res，1995，55(24):6006-6011.
(收稿日期:2003-06-01) (编辑 一坤), http://www.100md.com(余震)