天力体保对阿霉素所致大鼠心肌线粒体毒性的保护作用
【摘要】 目的 确定天力体保是否对阿霉素所致心肌线粒体毒性具有保护作用;探讨天力体保是否影响阿霉素的抗肿瘤作用。方法 应用电镜细胞化学方法，从心肌细胞超微结构和细胞色素C氧化酶的改变方面，观察了天力体保的这种保护作用。结果 阿霉素所造成的大鼠心肌细胞肌原纤维排列紊乱、线粒体肿胀，嵴断裂及细胞色素C氧化酶活性降低，可明显地被抗氧化剂天力体保所防止。结论 天力体保对阿霉素所致的心肌细胞毒性具有完美的保护作用，而不干扰其抗肿瘤作用，其作用可能与心肌抗氧化状态的维持有关。
关键词 阿霉素 线粒体 细胞色素C氧化酶 天力体保
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)08-0680-02
Protective effect of teapol on rat myocardial mitochondria
, 百拇医药 against adriamycin cytotoxicity
Wang Xu，Shao Yibing，Wang Zhengzhong，et al.
Department of Cardiology，Eastern Hospital of Qingdao Municipal Hospital，Qingdao266071.
【Abstract】 Objective The study had two aims:to determine whether the protective effect on heart mitochonˉdria against adriamycin cytotoxicity can be proved by treatment with teapol，and to determine whether teapol effects the antitumor properties of adriamycin(ADR).The protective effect of teapol was investigated by electron microscopic cytoˉchemical method.Methods The disorder of myofibrils，swelling of mitochondria with broken cristae and decrease of cytochrome C oxidase activity caused by ADR were prevented by the administration of teapol.Results The results suggested that teapol can provide complete protection against ADR cytotoxicity without interfering with antitumor propˉerties.Conclusion This protective effect of teapol may be related to the maintenance of the antioxdiant status of the heart.Key words adriamycin mitochondria cytochrome C oxidase teapol
, 百拇医药
肿瘤是目前严重威胁我国人民健康的主要疾病之一，近年来，其发病率有明显的增高趋势。阿霉素是临床上常用的抗肿瘤药物，但由于它的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起过氧化氢(H 2 O 2 )和羟自由基(·OH)的形成增多 [1，2] ，特别是其对心肌的毒性作用，大大限制了这一高效抗肿瘤药物的临床应用。因而寻找一种安全而有效的抗氧化剂是当务之急。天力体保是一种高效的自由基清除剂，可以保护免疫功能细胞免受损害 [3]。但对阿霉素所致心肌细胞毒性作用的保护研究甚少，本研究采用超微病理学结合细胞化学方法，观察天力体保对阿霉素所致心肌线粒体损伤的保护作用，为临床提供一种有效的抗阿霉素毒副作用的药物。
1 材料与方法
1.1 材料 雄性SD大鼠30只(由本院实验动物中心提供)，体重150～180g，随机分为3组，每组10只。第一组为对照组，给大鼠腹腔注射与阿霉素等量的生理盐水;第二组为阿霉素组，给大鼠腹腔一次性注射阿霉素(Sigma)1.5mg/100g;第三组为天力体保+阿霉素组，大鼠先隔日灌服天力体保6次，每次500mg/kg，再腹腔一次性注射阿霉素1.5mg/100g，然后再隔日灌服天力体保3次，天力体保总剂量为4.5g/kg体重。三组动物均采用基础饲料，同条件喂养。在最后一次灌服天力体保24h后，三组动物经戊巴比钠腹腔注射麻醉，2%多聚甲醛灌流固定，取下心脏，将左心室切成小条，再在同一固定液中固定1h，30mol/L PIPES缓冲液冲洗。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 用于细胞化学观察的心肌细胞 振荡切片机切片，厚度分别为15μm和40μm，细胞色素C氧化酶按Seligman [4] 法显示，切片入孵育液中(DAB:10mg;30mol/L PIPES缓冲液:5ml;过氧化氢酶:1mg;细胞色素C:5mg;蔗糖0.5mg;蒸馏水5ml。所需药品均购自Sigma公司)，37℃，30min，经PIPES缓冲液冲洗后，用于光镜观察的切片(15μm)，行甘油明胶封片。用于电镜观察的切片(40μm)，在1%锇酸后固定1h后，梯度酒精脱水，Spurr树脂包埋，JEOL1200EX电镜观察。
1.2.2 用于超微结构观察的心肌组织 切成1mm 3 的小块，行常规透射电镜标本制作。
2 结果
2.1 细胞化学观察 对照组光镜观察心肌细胞胞质内可见染色深，呈点状密集分布的黑色颗粒，为细胞色素C氧化酶反应产物，此乃线粒体所在部位(图1);而阿霉素组心肌细胞内细胞色素C氧化酶活性明显减弱，胞质内颗粒染色明显变浅(图2);天力体保加阿霉素组，细胞色素C氧化酶活性较强，胞质内颗粒密集，染色加深，与对照组基本相似(图3)。电镜下，对照组心肌细胞细胞色素C氧化酶反应产物主要分布于线粒体内膜和线粒体嵴，呈均匀一致的高电子密度(图4)，而阿霉素组大多数心肌细胞线粒体细胞细胞色素C氧化酶活性明显减弱，电子密度降低，有的线粒体酶活性几乎消失(图5);但天力体保+阿霉素组，细胞色素C氧化酶活性则保存良好，线粒体内膜及嵴均可见较强的酶活性，与对照组相似(图6)。
, 百拇医药
2.2 超微结构观察 对照组心肌细胞两Z线之间肌原纤维排列规则，线粒体丰富，其嵴平行排列，横小管位于Z线水平，肌浆网近横小管处略膨大，与横小管紧贴形成二联体(图7);阿霉素组可见肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂，横小管肿胀、扩张、空泡化(图8);天力体保加阿霉素组，肌原纤维、线粒体、横小管的结构与对照组无明显差异(图9)。
3 讨论
阿霉素是一种十分有效的抗肿瘤药物，但由于它对心肌的毒性作用，如引起心肌病和充血性心力衰竭等 [5，6] ，使其临床应用受到了很大限制。已有研究认为，阿霉素主要损伤心肌细胞的线粒体 [1，7] ，因线粒体内富有阴电荷的磷脂—心脂，与阿霉素有较高的亲和力，相互作用的结果使依赖心脂的酶—细胞色素C氧化酶活性降低，由于细胞色素C氧化酶参与氧化磷酸化过程中的电子传递，结果阿霉素导致心肌细胞能量代谢发生障碍。本实验也发现阿霉素可使心肌细胞肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂，细胞色素C氧化酶反应减弱、消失。虽然阿霉素致心肌线粒体损伤是多方面的 [8，9] ，因阿霉素的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起H202 和·OH的形成增多 [1，2] ，造成膜脂质过氧化，导致正常细胞损伤，而阿霉素的杀肿瘤细胞作用，主要是其嵌入DNA分子中，干扰DNA的转录 [10] 。近几年来许多学者在不断寻找能预防阿霉素心肌线粒体损害而不干扰其抗肿瘤作用的药物，自由基清除剂的应用为其开辟了新的预防途径。天力体保是一种新药，其重要成分为中药茶多酚，是一种高效自由基清除剂，自由基的清除率为80%～95%，提高了细胞抗氧化能力，从而保护了正常细胞的功能。本研究也发现大鼠灌服天力体保后，对阿霉素造 成的心肌损害有明显的保护作用，说明天力体保对阿霉素所产生的自由基有清除作用，从而防止阿霉素所致的心肌细胞线粒体损害。总之，我们认为天力体保可有效地预防阿霉素产生的自由基对正常心肌细胞的损伤，而不干扰其抗肿瘤作用，是目前比较有希望的预防自由基损害的药物。(本文图片略 )
, http://www.100md.com
参考文献
1 Grffin Green EA，Zaleska MM，Erecinska M.Adriamycin-induced lipid peroxidation in mitochondria and microsomes.Biochem pharmacol，1988，37(16):3071.
2 Dorshow JH.Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formaˉtion in rat heart.Cancer Res，1983，43:460.
3 阎玉森，王球达，邹玉珍，等.绿茶提取物对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响及其抑瘤作用.中华预防医学杂志，1992，26(1):5.
4 Seligman AM，Karnovsky MJ，Wasserkrug HL，et al.Non-droplet ultraˉstructural demonstration of cytochrome oxidase activitywith a polymerizˉing osmiophilic reagent，diaminobenzidine(DAB).J cell Biol，1968，38:1.
, 百拇医药
5 Lefrak EA，Pitha J，Rosenheim S，et al.A clinicopathologic analysis of adriamycin cardiotoxicity.Cancer，1973，32:302.
6 Goorin AM，Chauvenet AR，Peroz-Atayde AR，et al.Initial congestive heart failure，six to ten years after doxorubicin chemotherapy for childˉhood cancer.JPediatr，1990，116:144.
7 Singnal PK，Deally CMR，Weinbery LE.Subcellular effects of adriˉamycin inthe heart:A concise review.J Mol Cell Cardiol，1987，19:817.
, 百拇医药
8 Tong J，Ganguly PK，Singal PK.Myocardial adrenergic changes at two stages of heart failure due to adriamycin treatment in rats.Am J Physiol，1991，260:909.
9 Singal PK，Pierce GN.Adriamycin stimulates low-affinity Ca 2+ binding andlipid peroxidation but depresses myocardial function.Am J Physiol，1986，250:419.
10 Myers CE，McGuirs Wp，Liss RH，et al.Adriamycin;the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response.Science，1977，19:165.
(收稿日期:2003-05-10) (编辑 何蓓), 百拇医药(王旭)
关键词 阿霉素 线粒体 细胞色素C氧化酶 天力体保
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)08-0680-02
Protective effect of teapol on rat myocardial mitochondria
, 百拇医药 against adriamycin cytotoxicity
Wang Xu，Shao Yibing，Wang Zhengzhong，et al.
Department of Cardiology，Eastern Hospital of Qingdao Municipal Hospital，Qingdao266071.
【Abstract】 Objective The study had two aims:to determine whether the protective effect on heart mitochonˉdria against adriamycin cytotoxicity can be proved by treatment with teapol，and to determine whether teapol effects the antitumor properties of adriamycin(ADR).The protective effect of teapol was investigated by electron microscopic cytoˉchemical method.Methods The disorder of myofibrils，swelling of mitochondria with broken cristae and decrease of cytochrome C oxidase activity caused by ADR were prevented by the administration of teapol.Results The results suggested that teapol can provide complete protection against ADR cytotoxicity without interfering with antitumor propˉerties.Conclusion This protective effect of teapol may be related to the maintenance of the antioxdiant status of the heart.Key words adriamycin mitochondria cytochrome C oxidase teapol
, 百拇医药
肿瘤是目前严重威胁我国人民健康的主要疾病之一，近年来，其发病率有明显的增高趋势。阿霉素是临床上常用的抗肿瘤药物，但由于它的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起过氧化氢(H 2 O 2 )和羟自由基(·OH)的形成增多 [1，2] ，特别是其对心肌的毒性作用，大大限制了这一高效抗肿瘤药物的临床应用。因而寻找一种安全而有效的抗氧化剂是当务之急。天力体保是一种高效的自由基清除剂，可以保护免疫功能细胞免受损害 [3]。但对阿霉素所致心肌细胞毒性作用的保护研究甚少，本研究采用超微病理学结合细胞化学方法，观察天力体保对阿霉素所致心肌线粒体损伤的保护作用，为临床提供一种有效的抗阿霉素毒副作用的药物。
1 材料与方法
1.1 材料 雄性SD大鼠30只(由本院实验动物中心提供)，体重150～180g，随机分为3组，每组10只。第一组为对照组，给大鼠腹腔注射与阿霉素等量的生理盐水;第二组为阿霉素组，给大鼠腹腔一次性注射阿霉素(Sigma)1.5mg/100g;第三组为天力体保+阿霉素组，大鼠先隔日灌服天力体保6次，每次500mg/kg，再腹腔一次性注射阿霉素1.5mg/100g，然后再隔日灌服天力体保3次，天力体保总剂量为4.5g/kg体重。三组动物均采用基础饲料，同条件喂养。在最后一次灌服天力体保24h后，三组动物经戊巴比钠腹腔注射麻醉，2%多聚甲醛灌流固定，取下心脏，将左心室切成小条，再在同一固定液中固定1h，30mol/L PIPES缓冲液冲洗。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 用于细胞化学观察的心肌细胞 振荡切片机切片，厚度分别为15μm和40μm，细胞色素C氧化酶按Seligman [4] 法显示，切片入孵育液中(DAB:10mg;30mol/L PIPES缓冲液:5ml;过氧化氢酶:1mg;细胞色素C:5mg;蔗糖0.5mg;蒸馏水5ml。所需药品均购自Sigma公司)，37℃，30min，经PIPES缓冲液冲洗后，用于光镜观察的切片(15μm)，行甘油明胶封片。用于电镜观察的切片(40μm)，在1%锇酸后固定1h后，梯度酒精脱水，Spurr树脂包埋，JEOL1200EX电镜观察。
1.2.2 用于超微结构观察的心肌组织 切成1mm 3 的小块，行常规透射电镜标本制作。
2 结果
2.1 细胞化学观察 对照组光镜观察心肌细胞胞质内可见染色深，呈点状密集分布的黑色颗粒，为细胞色素C氧化酶反应产物，此乃线粒体所在部位(图1);而阿霉素组心肌细胞内细胞色素C氧化酶活性明显减弱，胞质内颗粒染色明显变浅(图2);天力体保加阿霉素组，细胞色素C氧化酶活性较强，胞质内颗粒密集，染色加深，与对照组基本相似(图3)。电镜下，对照组心肌细胞细胞色素C氧化酶反应产物主要分布于线粒体内膜和线粒体嵴，呈均匀一致的高电子密度(图4)，而阿霉素组大多数心肌细胞线粒体细胞细胞色素C氧化酶活性明显减弱，电子密度降低，有的线粒体酶活性几乎消失(图5);但天力体保+阿霉素组，细胞色素C氧化酶活性则保存良好，线粒体内膜及嵴均可见较强的酶活性，与对照组相似(图6)。
, 百拇医药
2.2 超微结构观察 对照组心肌细胞两Z线之间肌原纤维排列规则，线粒体丰富，其嵴平行排列，横小管位于Z线水平，肌浆网近横小管处略膨大，与横小管紧贴形成二联体(图7);阿霉素组可见肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂，横小管肿胀、扩张、空泡化(图8);天力体保加阿霉素组，肌原纤维、线粒体、横小管的结构与对照组无明显差异(图9)。
3 讨论
阿霉素是一种十分有效的抗肿瘤药物，但由于它对心肌的毒性作用，如引起心肌病和充血性心力衰竭等 [5，6] ，使其临床应用受到了很大限制。已有研究认为，阿霉素主要损伤心肌细胞的线粒体 [1，7] ，因线粒体内富有阴电荷的磷脂—心脂，与阿霉素有较高的亲和力，相互作用的结果使依赖心脂的酶—细胞色素C氧化酶活性降低，由于细胞色素C氧化酶参与氧化磷酸化过程中的电子传递，结果阿霉素导致心肌细胞能量代谢发生障碍。本实验也发现阿霉素可使心肌细胞肌原纤维排列紊乱，线粒体肿胀、嵴断裂，细胞色素C氧化酶反应减弱、消失。虽然阿霉素致心肌线粒体损伤是多方面的 [8，9] ，因阿霉素的分子结构中的半醌基发生氧化还原反应引起H202 和·OH的形成增多 [1，2] ，造成膜脂质过氧化，导致正常细胞损伤，而阿霉素的杀肿瘤细胞作用，主要是其嵌入DNA分子中，干扰DNA的转录 [10] 。近几年来许多学者在不断寻找能预防阿霉素心肌线粒体损害而不干扰其抗肿瘤作用的药物，自由基清除剂的应用为其开辟了新的预防途径。天力体保是一种新药，其重要成分为中药茶多酚，是一种高效自由基清除剂，自由基的清除率为80%～95%，提高了细胞抗氧化能力，从而保护了正常细胞的功能。本研究也发现大鼠灌服天力体保后，对阿霉素造 成的心肌损害有明显的保护作用，说明天力体保对阿霉素所产生的自由基有清除作用，从而防止阿霉素所致的心肌细胞线粒体损害。总之，我们认为天力体保可有效地预防阿霉素产生的自由基对正常心肌细胞的损伤，而不干扰其抗肿瘤作用，是目前比较有希望的预防自由基损害的药物。(本文图片略 )
, http://www.100md.com
参考文献
1 Grffin Green EA，Zaleska MM，Erecinska M.Adriamycin-induced lipid peroxidation in mitochondria and microsomes.Biochem pharmacol，1988，37(16):3071.
2 Dorshow JH.Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formaˉtion in rat heart.Cancer Res，1983，43:460.
3 阎玉森，王球达，邹玉珍，等.绿茶提取物对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响及其抑瘤作用.中华预防医学杂志，1992，26(1):5.
4 Seligman AM，Karnovsky MJ，Wasserkrug HL，et al.Non-droplet ultraˉstructural demonstration of cytochrome oxidase activitywith a polymerizˉing osmiophilic reagent，diaminobenzidine(DAB).J cell Biol，1968，38:1.
, 百拇医药
5 Lefrak EA，Pitha J，Rosenheim S，et al.A clinicopathologic analysis of adriamycin cardiotoxicity.Cancer，1973，32:302.
6 Goorin AM，Chauvenet AR，Peroz-Atayde AR，et al.Initial congestive heart failure，six to ten years after doxorubicin chemotherapy for childˉhood cancer.JPediatr，1990，116:144.
7 Singnal PK，Deally CMR，Weinbery LE.Subcellular effects of adriˉamycin inthe heart:A concise review.J Mol Cell Cardiol，1987，19:817.
, 百拇医药
8 Tong J，Ganguly PK，Singal PK.Myocardial adrenergic changes at two stages of heart failure due to adriamycin treatment in rats.Am J Physiol，1991，260:909.
9 Singal PK，Pierce GN.Adriamycin stimulates low-affinity Ca 2+ binding andlipid peroxidation but depresses myocardial function.Am J Physiol，1986，250:419.
10 Myers CE，McGuirs Wp，Liss RH，et al.Adriamycin;the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response.Science，1977，19:165.
(收稿日期:2003-05-10) (编辑 何蓓), 百拇医药(王旭)