胃癌组织中幽门螺杆菌的检测及其定位分布
【摘要】 目的 为了明确Hp在湖南地区胃癌中的感染情况及其在胃癌组织中的定位分布，探讨Hp感染在胃癌病因发病学中的可能作用。方法 采用PCR技术和Warthin-Starry(WS)染色方法检测我省胃癌中Hp的感染率，确定Hp在胃癌组织中的定位分布。并利用SPSS10.0软件分析Hp感染与胃癌临床病理特征的关系。结果 (1)PCR扩增幽门螺杆菌DNA ureA基因411bp片段，在109例胃癌中检测到42例Hp DNA阳性(阳性率38.53%)，而WS有58例检出Hp菌体(阳性率53.21%)，比PCR的检出率高(P<0.05)。(2)WS染色观察Hp存在于癌旁胃腔粘液、粘膜腺体内以及癌性腺体、粘液湖中，癌旁组织Hp阳性率高于癌灶部位(P<0.05)。(3)两种方法检测胃癌组织Hp阳性率与病人年龄、性别、肿瘤部位和淋巴结转移的差异无显著性(P>0.05)，但与胃癌病理分期的差异有显著性(P<0.05)，早期胃癌的Hp阳性率高于进展期胃癌。结论 Hp感染在胃粘膜癌变过程的较早期阶段可能有一定作用。
关键词 胃癌 幽门螺杆菌 聚合酶链反应 Warthin-Starry(WS)
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0824-04
Detection and location of Helicobacter pylori in human gastric carcinoma
Tang Yunlian，Gan Runliang，Xu Jinhua，et al.
Pathology Teaching Reseach Department，Nahua University，Hunan421001.
【Abstract】 Objective To define the infection of Hp and their localization in gastric carcinoma tissues，and to investigate their possible roles in the etiology of gastric carcinoma in Hunan province.Methods The incidence of Hp gastric carcinoma were estimated by polymerase chain reaction(PCR)，Simultaneously，both tissues morphologic feaˉtures and the localization of Hp in gastric carcinomas were demonstrated by Warthin-Starry staining(WS).In addiˉtion，the relationship between Hp infection and the clinico-pathologic factors of gastric carcinomas were analyzed with software SPSS10.0.Results (1)Hp was detected in39.03%
, 百拇医药
(42/109)and53.21%(58/109)of cases with gastric carcinomas by PCR and WS，respectively.Hp infection rate detected in gastric carcinomas by WS was higher than that by PCR(P<0.05).(2)The result of WS indicated that Hp lied in the gastric antrum mucus，mucosal gland of normal tissues adjacent to cancer，and the gland，mucous pool of cancer tissues.The Hp positive rate of normal tissues adjacent to cancer was higher than that of cancer tissues(P<0.05).(3)No significant difference in age，sex，site，type of tisˉsue samples and lymph node metastases was found between Hp-positive gastric carcinomas and Hp-negative cases by both methods(P>0.05)，but Hp positive rate and clinical stage(early or advanced)of gastric carcinomas were sigˉnificantly correlated(P<0.05).Conclusion These results suggest that Hp infection may play a certain role in the early stage of carcinogenesis of gastric mucosa epithelia.
, 百拇医药
Key words gastric carcinoma Helicobacter pylori polymerase chain reaction Warthin-Starry staining
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的病因发病机制至今尚未阐明，多数学者认为胃癌是一个多因素、多阶段、多步骤的发展过程。幽门螺杆菌(Hp)感染也是目前研究胃癌发病的因素之一 [1，2] 。但Hp在胃癌中的定位分布及其如何参与癌的发生机制还不清楚，对Hp与胃癌病因发病学关系还需深入研究。为此，本课题利用PCR技术扩增109例胃癌组织中的Hp-ureA基因411bp片段，并采用(WS)银染观察Hp在胃癌中的检出率与定位分布情况;以了解Hp在我省本地区胃癌中的感染与定位分布情况，探讨Hp感染与胃癌临床病理特征的关系，为研究Hp与胃癌的关系提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 标本的收集 来自本校附属第一医院32例胃癌手术标本(2000年10月～2002年3月)，取肿瘤组织与癌旁正常粘膜，-70℃冻存;77例近3年胃癌组织石蜡包埋块。所有病例未接受放疗及化疗，均由附属第一医院病理科和本室作出诊断。
, 百拇医药
1.2 主要试剂与配制 引物由上海生工生物工程公司合成，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，蛋白酶K，RNAse，DNAMarkˉer，Taq DNA聚合酶，dNTP购于上海生工生物工程公司。1×SSC(150mmol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠，pH7.0);石蜡消化液(150mmol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠，1%SDS)。
1.3 PCR检测
1.3.1 DNA的提取 参考文献 [3] 用常规酚-氯仿法提取对照细胞、组织及石蜡切片标本的DNA。取-70℃冻存的组织0.3～0.5g，生理盐水洗3遍，充分剪碎，加TNE400μl，20mg/ml的蛋白酶K30μl，55℃水浴中振摇过夜(12～24h)。
石蜡包埋组织块切6μm×20张，经二甲苯4次充分脱蜡，梯度酒精(100%，95%，75%，50%各30min)依次水化，1×SSC洗涤，干燥，加消化液400μl，20mg/ml的蛋白酶K20μl(使终浓度为1mg/ml)，置55℃水浴摇床消化120h，消化至第四天时，加蛋白酶K10μl，间或振摇。
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上述组织消化后，6000r/min离心2min，取上清液，加等量的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，pH8.0)抽提，沉淀用70%乙醇洗2遍，干燥，用含RNA酶(20μg/μl)的TE50～200μl，溶解DNA沉淀。紫外分光光度仪测OD值，OD260/OD280均在1.7～2.0，-20℃保存。
1.3.2 Hp-PCR扩增 参考文献 [4] 设计引物序列，由上海生工生物工程公司合成。引物序列为P 1 5′-GCC AAT GGT AAA TTA GTT-3′，P 2 5′-CTC CTT AAT TGT TTT TAC-3′。所设计的引物序列位于ureA基因组，扩增片段长度为411bp，PCR扩增体系为25μl，各反应成分浓度为模板DNA0.25μg，dNTP各200μmol/L，引物各为0.2μmol/L，MgCl 2 1.5mmol/L，PCR缓冲液2.5μl，Taq酶1.25U。以Hp NCTC11637幽门螺杆菌的标准菌株DNA为阳性对照，以TE作为阴性对照。按下列条件扩增:94℃预变性5min，94℃1min，47℃1min，72℃1min共35个循环，72℃延伸10min。从PCR产物中取10μl经1.5%的琼脂糖凝胶、120V电泳30min后于紫外透射仪上观察，若在411bp处出现与阳性对照一致的橙黄色条带，则为Hp-DNA阳性。
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1.3.3 WS染色 (1)试剂配制:①0.2mol/L的醋酸缓冲液(pH3.6):A液925ml(醋酸12ml，蒸馏水加至1000ml);B液75ml(无水醋酸钠1.64g，加蒸馏水至100ml)。②1%硝酸银液:硝酸银1g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH3.6)100ml。③2%硝酸银液:硝酸银0.2g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH3.6)10ml。④5%明胶液:明胶5g，0.2mol/L醋酸缓冲液96ml。此液需要加温35℃～40℃，不断摇动使之溶解，冷却后使用。⑤3%对苯二酚液:对苯二酚0.3g，0.2mol/L醋酸缓冲液10ml。⑥显影液:明胶:2%硝酸银液:3%对苯二酚按15∶3∶1混匀。(2)染色步骤:①胃癌组织的石蜡包埋块，连续切片4μm厚，粘贴于载玻片上，切片标本经常规脱蜡至水化。②0.2mol/L的醋酸缓冲液洗两遍。③置1%硝酸银中避光，56℃孵育1h。④直接把切片取出，立即浸入显影液内染色3～8min。⑤切片浸入56℃蒸馏水中洗1～2min。⑥蒸馏水洗1次。⑦无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封固。结果判断:胃幽门螺杆菌呈棕黄色或黑色，背景呈淡黄色。
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1.3.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 PCR扩增ureA基因411bp片段 共有42例出现EBV-DNA阳性条带，阳性率为38.5%。阳性对照及阳性标本在411bp处出现阳性单一的橙黄色条带，阴性对照及阴性标本无扩增条带，PCR扩增产物均经1.5%琼脂糖电泳鉴定(如图1所示)。32例胃癌冰冻组织中有17例阳性(阳性率53.13%)，77例胃癌石蜡切片25例阳性(阳性率32.47%)，0.01
2.2 WS染色结果 WS染色结果表明，在109例胃癌中检测到58例(阳性率53.21%)有Hp菌体，比PCR检出率高。同时观察到Hp的形态和分布(图2～5)，不同大小的Hp呈弯曲、S形、弧形或杆状的不同形态，细菌在非肿瘤组织部位多集中，呈鱼贯状排列;在肿瘤组织部位，呈弥散状。在这58例胃癌中，我们观察到Hp存在于癌旁组织的粘液、腺体及腺上皮细胞胞浆内有25例(癌旁组织为癌灶周围的非肿瘤组织部位，与癌灶部位为同一石蜡切片)，存在癌灶部位的(包括癌细胞胞浆、癌性腺体及粘液湖)有3例，Hp同时存在于肿瘤部位和非肿瘤部位有30例(表1)，经χ 2 检验(χ 2 =15.750，P<0.005)，非肿瘤部位Hp阳性率高于肿瘤部位。
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图1 Hp-PCR411bp产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳结果(略)
表1 Hp的阳性率与不同组织部位的比较(略)
图2 Hp存在癌灶、癌细胞胞浆内(略)
图3 Hp存在胃粘液腺癌的粘液湖中(略)
图4 Hp存在胃腔粘液中(略)
图5 Hp存在胃粘液腺腔、上皮细胞胞浆(略)
2.3 WS与PCR结果的比较 见表2。
表2 WS银染与PCR结果的比较(略)
在109例胃癌中，对WS银染与PCR结果进行统计分 析，得χ 2 =9.735，P<0.005，说明利用WS银染与PCR技术检测Hp阳性率的差异有显著性意义。
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2.4 Hp感染与胃癌临床病理特征的关系
2.4.1 Hp感染与胃癌病人年龄、性别、病灶部位和淋巴结转移的比较 见表3。
表3 Hp阳性率与胃癌患者年龄、性别、部位和淋巴结转移的比较 (略)
根据表3的数据，利用SPSS10.0的Pearson Chin-Square统计分析得，经PCR和WS染色两种方法检测幽门螺杆菌与胃癌病人年龄、性别、发生部位及淋巴结转移的差异均无显著性(P>0.05)。
2.4.2 Hp感染与不同胃癌组织学类型的比较 见表4。
表4 Hp感染与胃癌组织学类型的比较(略)
根据表4的数据，利用SPSS10.0的Pearson Chin-Square统计分析得，经PCR和WS染色两种方法检测幽门螺杆菌与胃癌组织学类型的差异无显著性(P>0.05)。
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2.4.3 不同胃癌病理分期Hp阳性率的比较 见表5。
表5 Hp感染与胃癌病理分期的关系 (略)
在109例胃癌中，早期胃癌有16例，进展期胃癌有93例，利用PCR检测幽门螺杆菌，Hp-DNA的阳性率分别为62.5%，34.4%;经WS检测幽门螺杆菌，Hp的阳性率分别为75.0%，49.5%。利用SPSS10.0的Pearson Chin-Square统计分析得，幽门螺杆菌感染与胃癌病理分期的差异有显著性(0.01
3 讨论
幽门螺杆菌普遍存在尿素酶基因，由ureA基因扩增产生的411bp核苷酸片段常用来检测幽门螺杆菌的存在，有人用50株Hp煮沸后的上清液经过26个循环扩增均有上述片段的存在，而包括鼬鼠螺杆菌在内的60株其它产尿素酶细菌用同样的方法扩增均无上述片段的存在，用以扩增的引物有100%的特异性与敏感性。但其敏感性决定于所选用的引物，DNA的来源及组织中存在的细菌数量。我们采用该引物的PCR扩增ureA基因产生的411bp核苷酸片段，其阳性率低于WS染色。其可能的解释:①PCR所能检测的细菌数量级至少在100个以上，而WS染色检测，只要有Hp存在就能检测出来，但要有经验者在光学显微镜下仔细观察。②用PCR法检测Hp的存在时，其敏感性与PCR扩增产物的片段大小有关。PCR产物片段较大，DNA在标本的处理过程中发生降解或断裂以致扩增效率较低。本研究所选用的胃癌标本大部分(77/109)为石蜡包埋组织，在标本的固定和切片制作过程中DNA有可能发生降解或断裂以至扩增效率较低，DNA来源于新鲜组织的Hp阳性率为53.12%，而石蜡切片的Hp阳性率为32.47%。这个问题可以改用扩增小片段的引物来避免，Fabre [5] 等使用新鲜的组织和扩增210bp核苷酸片段的引物来检测胃组织标本中的Hp，其阳性率和Giemsa相同。
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使用WS染色技术，我们在光学显微镜下观察到Hp存在于癌旁组织的粘液、腺腔、腺上皮细胞浆内及存在癌性腺体、粘液湖及癌细胞胞浆内，但非肿瘤部位Hp阳性率高于肿瘤部位。细菌在非肿瘤组织部位多集中，呈鱼贯状排列;在肿瘤组织部位，呈弥散状。原因考虑为胃内的酸性环境适合于Hp的繁殖，由于胃癌形成后，造成胃粘膜组织结构和微环境的改变，不适宜Hp的生存，导致Hp的“丢失”所致 [6] 。
本实验结果表明早期胃癌Hp的阳性率高于进展期胃癌，推测Hp可能参与了部分胃癌早期阶段的发生与发展过程。Hp移动及蓄积感染可能对发展胃癌起重要作用，离体实验表明较低的Hp接种浓度，刺激细胞增殖，但较高的接种浓度(细菌与细胞之比大于100)出现时间和浓度依赖性的细胞数量减少、凋亡增多及细胞G 1相增加 [7] 。
Hp感染能导致胃腺分泌胃酸和抗坏血酸能力下降，通过对胃粘膜长期的急慢性损伤，引起胃上皮增生，诱导长期耐受的炎性反应，从而增加了致癌物的致癌作用。在胃癌的癌变模式中，Correa认为Hp可能起着先导作用，他指出结肠型肠化生是一个已知的胃癌高危因子，Hp阳性伴有肠 化生应列为胃癌高危因素。Cahill将151例病人分成正常组(Hp阴性)、B型胃炎组(Hp阳性)、慢性萎缩性胃炎组、肠化生组和胃癌组，并分析5组细胞增生指数的变化，结果表明从B型胃炎到胃癌组织，细胞均呈增生状态。但其中只有B型胃炎细胞的增生与Hp的感染有关，其他几组细胞的增生均与Hp的感染无关。因此Cahill认为，Hp对胃癌的影响，主要作用于肿瘤发生的早期，在胃癌后期变化及癌变过程中的作用似乎并不明显 [8] 。Watanabe [9] 等首次报道单独应用Hp感染5周龄的MG(蒙古沙土鼠)诱发出胃癌，MG经口感染Hp并能长期定植，感染26周时出现严重活动性胃炎、溃疡、肠化生，62周时37%(10/27)幽门腺的MG发生了胃腺癌，并发现腺癌与肠化生密切相关。此后，Honda [10] 等用Hp ATCC43504菌株感染5周龄的MG，也发现粘膜经历了萎缩、肠化生等病变，18个月后有40%(2/5)MG3处发生了高分化胃腺癌。由于使用的MG为5周龄，故推测早期Hp是增加胃癌发生危险性的条件之一，同时两组的结果表明“Hp→萎缩→肠化生→异型增生→肠型胃癌”途径。
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参考文献
1 Handa Y，Saitoh T，Kawaguchi M，et al.Production of secretory compoˉnent and pathogenesis of gastric cancer in Helicobacter pylori-infected stomach.J Gastroenterol，1999，34suppl11:37-42.
2 Valle J，Gisbert JP.Helicobacter pylori infection and precancerous leˉsions of the stomach.Hepatogastroenterology，2001，48(42):1548-1551.
3 Satoh Y，Takasaka N，Hoshikawa Y，et al.Pretreatment with restriction enzyme of bovine serum albumin for effective PCR amplification of Epˉstein-Barr virus DNA in DNA extracted from paraffin-embedded gasˉtric carcinoma tissue.J Clin Microbiol，1998，36(11):3423-3425.
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4 徐世平，王孟薇，尤纬缔.幽门螺杆菌感染与人胃癌相关性研究.中华消化杂志，1997，17(4):210.
5 Fabre R，Sobhani I，Laurent-Puig P，et al.Polymerase chain reaction assay for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy speciˉmens:comparison with culture，rapide urease test and histopathological tests.Gut，1994，35(7):905-908.
6 McGuigan JE.Helicobacter pylori:the versatile pathogen.Dig Dis，1996，14(5):289-303.
7 Zhang ZW，Farthing MJG.Molecular mechanisms of H.pylori associated gastric carcinogenesis.World J Gastroenterol，1999，5(5):369-374.
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8 Cahill RJ，Kilgallen C，Beattie S，et al.Gastric epithelial cell kinetics in the progression from normal mucosa to gastric carcinoma.Gut，1996，38(2):177-181.
9 Watanabe T，Tada M，Nagai H，et al.Helicobacter pylori infection in inˉduces gastric cancer in Monogoliam gerbils.Gastroenterology，1998，115(3):642-648.
10 Onda S，Fujioka T，Tokieda M，et al.Development of Helicobacter pyˉlori-induced gastric carcinoma in Mongolian gerbils.Cancer Res，1998，58(19):4255-4259.
作者单位:1 421001南华大学病理学教研室
2 421200湖南省衡阳县人民医院外科
(编辑 何蓓), 百拇医药(唐运莲)
关键词 胃癌 幽门螺杆菌 聚合酶链反应 Warthin-Starry(WS)
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0824-04
Detection and location of Helicobacter pylori in human gastric carcinoma
Tang Yunlian，Gan Runliang，Xu Jinhua，et al.
Pathology Teaching Reseach Department，Nahua University，Hunan421001.
【Abstract】 Objective To define the infection of Hp and their localization in gastric carcinoma tissues，and to investigate their possible roles in the etiology of gastric carcinoma in Hunan province.Methods The incidence of Hp gastric carcinoma were estimated by polymerase chain reaction(PCR)，Simultaneously，both tissues morphologic feaˉtures and the localization of Hp in gastric carcinomas were demonstrated by Warthin-Starry staining(WS).In addiˉtion，the relationship between Hp infection and the clinico-pathologic factors of gastric carcinomas were analyzed with software SPSS10.0.Results (1)Hp was detected in39.03%
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(42/109)and53.21%(58/109)of cases with gastric carcinomas by PCR and WS，respectively.Hp infection rate detected in gastric carcinomas by WS was higher than that by PCR(P<0.05).(2)The result of WS indicated that Hp lied in the gastric antrum mucus，mucosal gland of normal tissues adjacent to cancer，and the gland，mucous pool of cancer tissues.The Hp positive rate of normal tissues adjacent to cancer was higher than that of cancer tissues(P<0.05).(3)No significant difference in age，sex，site，type of tisˉsue samples and lymph node metastases was found between Hp-positive gastric carcinomas and Hp-negative cases by both methods(P>0.05)，but Hp positive rate and clinical stage(early or advanced)of gastric carcinomas were sigˉnificantly correlated(P<0.05).Conclusion These results suggest that Hp infection may play a certain role in the early stage of carcinogenesis of gastric mucosa epithelia.
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Key words gastric carcinoma Helicobacter pylori polymerase chain reaction Warthin-Starry staining
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的病因发病机制至今尚未阐明，多数学者认为胃癌是一个多因素、多阶段、多步骤的发展过程。幽门螺杆菌(Hp)感染也是目前研究胃癌发病的因素之一 [1，2] 。但Hp在胃癌中的定位分布及其如何参与癌的发生机制还不清楚，对Hp与胃癌病因发病学关系还需深入研究。为此，本课题利用PCR技术扩增109例胃癌组织中的Hp-ureA基因411bp片段，并采用(WS)银染观察Hp在胃癌中的检出率与定位分布情况;以了解Hp在我省本地区胃癌中的感染与定位分布情况，探讨Hp感染与胃癌临床病理特征的关系，为研究Hp与胃癌的关系提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 标本的收集 来自本校附属第一医院32例胃癌手术标本(2000年10月～2002年3月)，取肿瘤组织与癌旁正常粘膜，-70℃冻存;77例近3年胃癌组织石蜡包埋块。所有病例未接受放疗及化疗，均由附属第一医院病理科和本室作出诊断。
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1.2 主要试剂与配制 引物由上海生工生物工程公司合成，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，蛋白酶K，RNAse，DNAMarkˉer，Taq DNA聚合酶，dNTP购于上海生工生物工程公司。1×SSC(150mmol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠，pH7.0);石蜡消化液(150mmol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠，1%SDS)。
1.3 PCR检测
1.3.1 DNA的提取 参考文献 [3] 用常规酚-氯仿法提取对照细胞、组织及石蜡切片标本的DNA。取-70℃冻存的组织0.3～0.5g，生理盐水洗3遍，充分剪碎，加TNE400μl，20mg/ml的蛋白酶K30μl，55℃水浴中振摇过夜(12～24h)。
石蜡包埋组织块切6μm×20张，经二甲苯4次充分脱蜡，梯度酒精(100%，95%，75%，50%各30min)依次水化，1×SSC洗涤，干燥，加消化液400μl，20mg/ml的蛋白酶K20μl(使终浓度为1mg/ml)，置55℃水浴摇床消化120h，消化至第四天时，加蛋白酶K10μl，间或振摇。
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上述组织消化后，6000r/min离心2min，取上清液，加等量的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，pH8.0)抽提，沉淀用70%乙醇洗2遍，干燥，用含RNA酶(20μg/μl)的TE50～200μl，溶解DNA沉淀。紫外分光光度仪测OD值，OD260/OD280均在1.7～2.0，-20℃保存。
1.3.2 Hp-PCR扩增 参考文献 [4] 设计引物序列，由上海生工生物工程公司合成。引物序列为P 1 5′-GCC AAT GGT AAA TTA GTT-3′，P 2 5′-CTC CTT AAT TGT TTT TAC-3′。所设计的引物序列位于ureA基因组，扩增片段长度为411bp，PCR扩增体系为25μl，各反应成分浓度为模板DNA0.25μg，dNTP各200μmol/L，引物各为0.2μmol/L，MgCl 2 1.5mmol/L，PCR缓冲液2.5μl，Taq酶1.25U。以Hp NCTC11637幽门螺杆菌的标准菌株DNA为阳性对照，以TE作为阴性对照。按下列条件扩增:94℃预变性5min，94℃1min，47℃1min，72℃1min共35个循环，72℃延伸10min。从PCR产物中取10μl经1.5%的琼脂糖凝胶、120V电泳30min后于紫外透射仪上观察，若在411bp处出现与阳性对照一致的橙黄色条带，则为Hp-DNA阳性。
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1.3.3 WS染色 (1)试剂配制:①0.2mol/L的醋酸缓冲液(pH3.6):A液925ml(醋酸12ml，蒸馏水加至1000ml);B液75ml(无水醋酸钠1.64g，加蒸馏水至100ml)。②1%硝酸银液:硝酸银1g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH3.6)100ml。③2%硝酸银液:硝酸银0.2g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH3.6)10ml。④5%明胶液:明胶5g，0.2mol/L醋酸缓冲液96ml。此液需要加温35℃～40℃，不断摇动使之溶解，冷却后使用。⑤3%对苯二酚液:对苯二酚0.3g，0.2mol/L醋酸缓冲液10ml。⑥显影液:明胶:2%硝酸银液:3%对苯二酚按15∶3∶1混匀。(2)染色步骤:①胃癌组织的石蜡包埋块，连续切片4μm厚，粘贴于载玻片上，切片标本经常规脱蜡至水化。②0.2mol/L的醋酸缓冲液洗两遍。③置1%硝酸银中避光，56℃孵育1h。④直接把切片取出，立即浸入显影液内染色3～8min。⑤切片浸入56℃蒸馏水中洗1～2min。⑥蒸馏水洗1次。⑦无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封固。结果判断:胃幽门螺杆菌呈棕黄色或黑色，背景呈淡黄色。
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1.3.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 PCR扩增ureA基因411bp片段 共有42例出现EBV-DNA阳性条带，阳性率为38.5%。阳性对照及阳性标本在411bp处出现阳性单一的橙黄色条带，阴性对照及阴性标本无扩增条带，PCR扩增产物均经1.5%琼脂糖电泳鉴定(如图1所示)。32例胃癌冰冻组织中有17例阳性(阳性率53.13%)，77例胃癌石蜡切片25例阳性(阳性率32.47%)，0.01
2.2 WS染色结果 WS染色结果表明，在109例胃癌中检测到58例(阳性率53.21%)有Hp菌体，比PCR检出率高。同时观察到Hp的形态和分布(图2～5)，不同大小的Hp呈弯曲、S形、弧形或杆状的不同形态，细菌在非肿瘤组织部位多集中，呈鱼贯状排列;在肿瘤组织部位，呈弥散状。在这58例胃癌中，我们观察到Hp存在于癌旁组织的粘液、腺体及腺上皮细胞胞浆内有25例(癌旁组织为癌灶周围的非肿瘤组织部位，与癌灶部位为同一石蜡切片)，存在癌灶部位的(包括癌细胞胞浆、癌性腺体及粘液湖)有3例，Hp同时存在于肿瘤部位和非肿瘤部位有30例(表1)，经χ 2 检验(χ 2 =15.750，P<0.005)，非肿瘤部位Hp阳性率高于肿瘤部位。
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图1 Hp-PCR411bp产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳结果(略)
表1 Hp的阳性率与不同组织部位的比较(略)
图2 Hp存在癌灶、癌细胞胞浆内(略)
图3 Hp存在胃粘液腺癌的粘液湖中(略)
图4 Hp存在胃腔粘液中(略)
图5 Hp存在胃粘液腺腔、上皮细胞胞浆(略)
2.3 WS与PCR结果的比较 见表2。
表2 WS银染与PCR结果的比较(略)
在109例胃癌中，对WS银染与PCR结果进行统计分 析，得χ 2 =9.735，P<0.005，说明利用WS银染与PCR技术检测Hp阳性率的差异有显著性意义。
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2.4 Hp感染与胃癌临床病理特征的关系
2.4.1 Hp感染与胃癌病人年龄、性别、病灶部位和淋巴结转移的比较 见表3。
表3 Hp阳性率与胃癌患者年龄、性别、部位和淋巴结转移的比较 (略)
根据表3的数据，利用SPSS10.0的Pearson Chin-Square统计分析得，经PCR和WS染色两种方法检测幽门螺杆菌与胃癌病人年龄、性别、发生部位及淋巴结转移的差异均无显著性(P>0.05)。
2.4.2 Hp感染与不同胃癌组织学类型的比较 见表4。
表4 Hp感染与胃癌组织学类型的比较(略)
根据表4的数据，利用SPSS10.0的Pearson Chin-Square统计分析得，经PCR和WS染色两种方法检测幽门螺杆菌与胃癌组织学类型的差异无显著性(P>0.05)。
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2.4.3 不同胃癌病理分期Hp阳性率的比较 见表5。
表5 Hp感染与胃癌病理分期的关系 (略)
在109例胃癌中，早期胃癌有16例，进展期胃癌有93例，利用PCR检测幽门螺杆菌，Hp-DNA的阳性率分别为62.5%，34.4%;经WS检测幽门螺杆菌，Hp的阳性率分别为75.0%，49.5%。利用SPSS10.0的Pearson Chin-Square统计分析得，幽门螺杆菌感染与胃癌病理分期的差异有显著性(0.01
3 讨论
幽门螺杆菌普遍存在尿素酶基因，由ureA基因扩增产生的411bp核苷酸片段常用来检测幽门螺杆菌的存在，有人用50株Hp煮沸后的上清液经过26个循环扩增均有上述片段的存在，而包括鼬鼠螺杆菌在内的60株其它产尿素酶细菌用同样的方法扩增均无上述片段的存在，用以扩增的引物有100%的特异性与敏感性。但其敏感性决定于所选用的引物，DNA的来源及组织中存在的细菌数量。我们采用该引物的PCR扩增ureA基因产生的411bp核苷酸片段，其阳性率低于WS染色。其可能的解释:①PCR所能检测的细菌数量级至少在100个以上，而WS染色检测，只要有Hp存在就能检测出来，但要有经验者在光学显微镜下仔细观察。②用PCR法检测Hp的存在时，其敏感性与PCR扩增产物的片段大小有关。PCR产物片段较大，DNA在标本的处理过程中发生降解或断裂以致扩增效率较低。本研究所选用的胃癌标本大部分(77/109)为石蜡包埋组织，在标本的固定和切片制作过程中DNA有可能发生降解或断裂以至扩增效率较低，DNA来源于新鲜组织的Hp阳性率为53.12%，而石蜡切片的Hp阳性率为32.47%。这个问题可以改用扩增小片段的引物来避免，Fabre [5] 等使用新鲜的组织和扩增210bp核苷酸片段的引物来检测胃组织标本中的Hp，其阳性率和Giemsa相同。
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使用WS染色技术，我们在光学显微镜下观察到Hp存在于癌旁组织的粘液、腺腔、腺上皮细胞浆内及存在癌性腺体、粘液湖及癌细胞胞浆内，但非肿瘤部位Hp阳性率高于肿瘤部位。细菌在非肿瘤组织部位多集中，呈鱼贯状排列;在肿瘤组织部位，呈弥散状。原因考虑为胃内的酸性环境适合于Hp的繁殖，由于胃癌形成后，造成胃粘膜组织结构和微环境的改变，不适宜Hp的生存，导致Hp的“丢失”所致 [6] 。
本实验结果表明早期胃癌Hp的阳性率高于进展期胃癌，推测Hp可能参与了部分胃癌早期阶段的发生与发展过程。Hp移动及蓄积感染可能对发展胃癌起重要作用，离体实验表明较低的Hp接种浓度，刺激细胞增殖，但较高的接种浓度(细菌与细胞之比大于100)出现时间和浓度依赖性的细胞数量减少、凋亡增多及细胞G 1相增加 [7] 。
Hp感染能导致胃腺分泌胃酸和抗坏血酸能力下降，通过对胃粘膜长期的急慢性损伤，引起胃上皮增生，诱导长期耐受的炎性反应，从而增加了致癌物的致癌作用。在胃癌的癌变模式中，Correa认为Hp可能起着先导作用，他指出结肠型肠化生是一个已知的胃癌高危因子，Hp阳性伴有肠 化生应列为胃癌高危因素。Cahill将151例病人分成正常组(Hp阴性)、B型胃炎组(Hp阳性)、慢性萎缩性胃炎组、肠化生组和胃癌组，并分析5组细胞增生指数的变化，结果表明从B型胃炎到胃癌组织，细胞均呈增生状态。但其中只有B型胃炎细胞的增生与Hp的感染有关，其他几组细胞的增生均与Hp的感染无关。因此Cahill认为，Hp对胃癌的影响，主要作用于肿瘤发生的早期，在胃癌后期变化及癌变过程中的作用似乎并不明显 [8] 。Watanabe [9] 等首次报道单独应用Hp感染5周龄的MG(蒙古沙土鼠)诱发出胃癌，MG经口感染Hp并能长期定植，感染26周时出现严重活动性胃炎、溃疡、肠化生，62周时37%(10/27)幽门腺的MG发生了胃腺癌，并发现腺癌与肠化生密切相关。此后，Honda [10] 等用Hp ATCC43504菌株感染5周龄的MG，也发现粘膜经历了萎缩、肠化生等病变，18个月后有40%(2/5)MG3处发生了高分化胃腺癌。由于使用的MG为5周龄，故推测早期Hp是增加胃癌发生危险性的条件之一，同时两组的结果表明“Hp→萎缩→肠化生→异型增生→肠型胃癌”途径。
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作者单位:1 421001南华大学病理学教研室
2 421200湖南省衡阳县人民医院外科
(编辑 何蓓), 百拇医药(唐运莲)