前列通淤提取液对体外培养前列腺基质平滑肌细胞增殖与凋亡的影响
http://www.100md.com
中华现代中西医杂志 2003年 第1卷 第4期
【摘要】 目的 研究前列通淤提取液对体外培养前列腺基质平滑肌细胞增殖与凋亡的影响。方法 分别以10 -5 、2×10 -5 、10×10 -5 、50×10 -5 、100×10 -5 g/L5种不同浓度前列通淤提取液作用体外培养前列腺基质平滑肌细胞，采用MTT和TUNEL的方法分别测定抗增殖指数和凋亡指数。结果 5种不同浓度前列通淤提取液作用48h后抗增殖指数分别为53.52%、56.92%、72.94%、65.53%和50.61%，抗增殖效果随着浓度增大而增大，10×10 -5 g/L时达到最大，但浓度继续增高时抗增殖效果逐渐减少。10×10 -5 g/L前列通淤提取液作用24、48和72h后凋亡指数分别为1.1%、1.8%和1.6%，与对照组比较差异有显著性。结论10 -5 ～100×10 -5 g/L前列通淤提取液体外作用前列腺基质平滑肌细胞具有显著的抗增殖作用，而无诱导凋亡作用。
, 百拇医药
关键词 前列腺 平滑肌细胞 前列通淤 细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)04-0297-02
Influence of extracted liquid from qianlietongyu on the
proliferation or apoptosis of cultured prostatic stromal smooth muscle cells
Qiu Shaopeng，Chen Huirong，Liu Jianzhong，et al.
Department of Urology，the First Affiliated Hospital，Zhongshan University，Guangdong510080.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the influences of extracted liquid from qianlietongyu on the proliferation and apoptosis of prostatic stromal smooth muscle cells.Methods After extracted liquid from qianlietongyu(10 -5 ，2×10 -5 ，10×10 -5 ，50×10 -5 ，100×10 -5 g/L)treated the cultured prostatic stromal cells，the antiproliferation index and apoptosis index were assessed byMTT assay and terminal deoxynucleotidy transferase mediated dUTP nick end laˉbeling(TUNEL)respectively.Results The antiproliferation index were53.52%，56.92%，72.94%，65.53%and50.61%from lower concentration to higher one.With higher concentration，there were higher antiproliferative effects，but there was a decreased trend of antiproliferative effects over the concentration of10×10 -5 g/L.The apoptosis index were1.1%，1.8%，and1.6%after the cells were treated for24，48and72hours res
, 百拇医药
pectively，which were not differˉent from the control group.Conclusion 10 -5 ～100×10 -5 g/L extracted liquid from qianlietongyu may show signifiˉcant antiproliferative effects on cultured prostatic stromal smooth muscle cells，without the induction of apoptosis.
Key words prostate smooth muscle cells qianlietongyu apoptosis
中药前列通淤胶囊治疗前列腺疾病有一定疗效，可显著改善排尿和前列腺压痛等症状，但其作用机制尚不清楚 [1] 。前列腺组织包括上皮和基质(平滑肌和结缔组织)细胞成分，其中基质平滑肌细胞约占40% [2] 。本实验研究前列通淤提取液对体外培养前列腺基质平滑肌细胞增殖与凋亡的影响，旨在探讨前列通淤胶囊治疗前列腺疾病的细胞水平作用机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 组织来源和实验材料 前列腺组织取自2001年我院经耻骨上前列腺摘除术新鲜标本，病理排除前列腺癌。主要试剂:PRMI-1640培养基(含L-谷酰胺)，10%胎牛血清，1%胎牛血清，胶原酶Ⅰ型0.5mg/ml，青链霉素200U/ml，两性霉素1μg/ml，睾酮0.05μg/ml，氢化可的松0.05μg/ml，MTT1mg/ml，二甲亚砜(DMSO0.5%)，兔抗人角蛋白单抗，兔抗人Actin单抗，TUNEL试剂盒等。中药前列通淤胶囊由珠海星光制药厂提供，胶囊内粉末用无菌生理盐水溶解后离心取上清液备用，预实
验确定前列通淤提取液有效浓度为10 -5 ～100×10 -5 g/L。
1.2 前列腺基质细胞的分离培养及鉴定 新鲜前列腺手术标本剪成2mm×2mm×2mm碎块，经消化离心后，沉淀不能溶解的组织和大块上皮细胞，再离心上清液，取沉淀细胞种入50ml培养瓶在5%CO 2 、37℃条件下培养，每周更换培养基3次，取第5代对数生长期细胞实验用。显微镜下观察细胞形态变化，取第1、5代细胞行抗α-Actin、Cytokeratin18免疫细胞化学染色，分别计算阳性细胞占总细胞数的百分比。
, 百拇医药
1.3 MTT测定细胞增殖指数 实验分7组，每组8个复孔，按细胞密度5×10 3 /cm 2 接种于96孔培养板。加入含血清培养基0.2ml，24h细胞贴壁后PBS洗2次，加入无血清培养基0.2ml，48h后细胞静止。除去上清后加入含血清培养基0.1ml，再加入10 -5 、2×10 -5 、10×10 -5 、50×10 -5 、100×10 -5 g/L5种浓度的前列通淤提取液0.1ml。作用48h后，吸除培养液，加入0.2ml MTT，37℃孵育4h，加入0.5%400μl二甲亚砜DMSO溶解形成兰色结晶色团，振动10min。在ELX800型自动酶标仪570nm波长测定每孔内DMSO溶液的吸光度(A)值。抗细胞增殖指数(%)=(对照组A值-实验组A值/对照组A值-空白组A值)×100%。
1.4 TUNEL测定凋亡指数 实验分50×10 -5 g/L前列通淤提取液和对照2组，按细胞密度5×10 3 /cm 2 接种在24孔培养板上，每组4个复孔。加入含血清培养基C1ml，24h细胞贴壁。PBS洗2次，加入无血清培养基1ml，48h细胞静止。除去上清后加入10×10 -5 g/L前列通淤提取液1ml，作用24、48和72h。按TUNEL试剂盒说明操作标记凋亡细胞，10×20倍光镜下计算5个随机视野凋亡细胞数，凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。
, 百拇医药
1.5 统计学分析 所有数据经SPSS8.0软件处理，两组以上比较采用方差分析和两两比较的q检验。
2 结果
2.1 培养BPH基质细胞特征 显微镜下观察细胞在24h有部分贴壁生长，12日细胞几乎长满需要传代，呈典型的梭形，细胞数目增多形成细胞小结，呈现“峰与谷”的特征。免疫细胞化学染色显示第1、5代Cytokeratin18 + 上皮细胞分别占9.3%和1.7%，α-Actin + 平滑肌细胞分别占35.7%和82.3%，表明经过5～6代后已形成了以平滑肌细胞为主的前列腺基质细胞。
2.2 MTT实验 10 -5 、2×10 -5 、10×10 -5 、50×10 -5 、100×10 -5 (g/L)5种不同浓度前列通淤提取液，抗细胞增殖指数分别为53.52%、56.92%、72.94%、65.53%和50.61%，方差分析显示5种不同浓度前列通淤提取液均具有不同程度的抗增殖作用(44.21%～82.62%)，10 -5 、2×10 -5 、100×10 -5 三种浓度之间抗增殖指数差异无显著性，10×10 -5 、50×10 -5 两种浓度之间抗增殖指数差异无显著性，其余各组浓度之间差异均有显著性(见表1)。随着浓度增高抗增殖指数升高，10×10 -5 (g/L)时作用最强，但浓度进一步加大时，抗增殖指数逐渐下降。
, 百拇医药
表1 前列通淤提取液对前列腺基质平滑肌细胞抗增殖指数 (略)
2.3 TUNEL实验 浓度为10×10 -5g/L的前列通淤提取液，作用前列腺基质平滑肌细胞24、48和72h后凋亡指数分别为1.2%、1.7%和1.8%，对照组分别为1.3%、1.5%和1.8%，采用方差分析显示各治疗组间差异无显著性。
3 讨论
我国传统中成药治疗前列腺疾病多有良方，但有关细 胞水平作用机制方面的研究报道较少。国外采用植物药治疗前列腺疾病在欧洲最活跃，有的国家多达90%的前列腺增生病人采用植物药治疗。植物药治疗前列腺疾病作用机制主要有以下几个方面的研究报告:直接抑制前列腺的生长;抗雄激素或抗雌激素作用;降低性激素结合球蛋白的含量;改变胆固醇的代谢;干扰前列腺素E的代谢起抗炎作用等 [3] 。但有关植物药对前列腺细胞动力学变化的研究则较少见。
, 百拇医药
MTT法已被广泛应用于检测多种细胞活性、探测药物敏感性的指标，亦是中药复方药效学研究的有效方法 [4] 。本研究发现浓度为10 -5 ～100×10 -5 g/L的中药前列通淤提取液体外作用培养前列腺基质平滑肌细胞，不同浓度均有显著的抗细胞增殖作用。选择最大的抗增殖浓度10×10 -5 g/L未发现有明显的诱导凋亡作用。提示前列通淤提取液中存在抑制前列腺基质平滑肌细胞生长的有效成分。前列通淤胶囊中药方剂中的某些活性成分抑制前列腺基质平滑肌的生长可能是临床治疗前列腺疾病的细胞水平机制。大量研究表明，前列腺基质细胞的生长受多种细胞因子的调节，中药前列通淤提取液调节前列腺基质平滑肌细胞的生长可能是通过调节某种或多种生长因子起作用，亦可能是其活性成分本身即包含多种生长因子，这些都值得深入研究[5]。
本实验采用前列通淤提取液浓度是通过预实验选择的，抗增殖作用最强的浓度10×10 -5 (g/L)正好在本实验所选取的浓度范围内。低于此浓度抗增殖效果逐渐减弱，而高于此浓度抗增殖效果也逐渐减弱，如果浓度继续增高是否会促进细胞的增殖有待进一步研究。出现这种情况可能是中药所特有的“双相调节”作用，如果加大中药的剂量会出现相反的功能[6] 。临床使用前列通淤胶囊对不同的个体必须选取最适宜的剂量才能达到最佳疗效，剂量太小效果不显著，而剂量太大不但效果不佳，还可能加重症状，因此本实验结果对前列通淤胶囊的临床应用也具有重要的指导意义。
, 百拇医药
参考文献
1 彭淑莲，贾玉森，陈和亮，等.前列通淤胶囊治疗慢性前列腺炎临床观察.中国实验方剂杂志，2000，6(4):57-59.
2 George A，Schuster，Timothy G.The relative amount of epithelial，musˉcle，connective tissue and lumen in prostatic hyperplasia as a function of the mass tissue resected.J Urol，1999，161(4):1168.
3 Franlin CL，James CK.Phytotherapy in treatment of benign prostatic hyˉperplasia:critical review.Urology，1996，48(1):12-20.
, http://www.100md.com
4 McConnell JD.Epidemiology，etiology，pathophysiology and diagnosis of benign prostatic hyperplasia.In:Walsh PC，et al.Campbell’s Urology，Volume2，7th ed，W.B.Sanders Company，Philadelphia，1998，1433.
5 刘彦珠，罗国安，龙致贤，等.首乌及其复方对平滑肌细胞增殖抑制作用的研究.清华大学学报(自然科学版)，1998，38(12):32-35.
6 曾秀池.略论中药的双向调节作用机制.实用医药杂志，2001，17(4):43.
作者单位:510080广州中山大学附属第一医院泌尿外科
(收稿日期:2003-07-09) (编辑 何蓓), 百拇医药(丘少鹏)
, 百拇医药
关键词 前列腺 平滑肌细胞 前列通淤 细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)04-0297-02
Influence of extracted liquid from qianlietongyu on the
proliferation or apoptosis of cultured prostatic stromal smooth muscle cells
Qiu Shaopeng，Chen Huirong，Liu Jianzhong，et al.
Department of Urology，the First Affiliated Hospital，Zhongshan University，Guangdong510080.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the influences of extracted liquid from qianlietongyu on the proliferation and apoptosis of prostatic stromal smooth muscle cells.Methods After extracted liquid from qianlietongyu(10 -5 ，2×10 -5 ，10×10 -5 ，50×10 -5 ，100×10 -5 g/L)treated the cultured prostatic stromal cells，the antiproliferation index and apoptosis index were assessed byMTT assay and terminal deoxynucleotidy transferase mediated dUTP nick end laˉbeling(TUNEL)respectively.Results The antiproliferation index were53.52%，56.92%，72.94%，65.53%and50.61%from lower concentration to higher one.With higher concentration，there were higher antiproliferative effects，but there was a decreased trend of antiproliferative effects over the concentration of10×10 -5 g/L.The apoptosis index were1.1%，1.8%，and1.6%after the cells were treated for24，48and72hours res
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pectively，which were not differˉent from the control group.Conclusion 10 -5 ～100×10 -5 g/L extracted liquid from qianlietongyu may show signifiˉcant antiproliferative effects on cultured prostatic stromal smooth muscle cells，without the induction of apoptosis.
Key words prostate smooth muscle cells qianlietongyu apoptosis
中药前列通淤胶囊治疗前列腺疾病有一定疗效，可显著改善排尿和前列腺压痛等症状，但其作用机制尚不清楚 [1] 。前列腺组织包括上皮和基质(平滑肌和结缔组织)细胞成分，其中基质平滑肌细胞约占40% [2] 。本实验研究前列通淤提取液对体外培养前列腺基质平滑肌细胞增殖与凋亡的影响，旨在探讨前列通淤胶囊治疗前列腺疾病的细胞水平作用机制。
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1 材料和方法
1.1 组织来源和实验材料 前列腺组织取自2001年我院经耻骨上前列腺摘除术新鲜标本，病理排除前列腺癌。主要试剂:PRMI-1640培养基(含L-谷酰胺)，10%胎牛血清，1%胎牛血清，胶原酶Ⅰ型0.5mg/ml，青链霉素200U/ml，两性霉素1μg/ml，睾酮0.05μg/ml，氢化可的松0.05μg/ml，MTT1mg/ml，二甲亚砜(DMSO0.5%)，兔抗人角蛋白单抗，兔抗人Actin单抗，TUNEL试剂盒等。中药前列通淤胶囊由珠海星光制药厂提供，胶囊内粉末用无菌生理盐水溶解后离心取上清液备用，预实
验确定前列通淤提取液有效浓度为10 -5 ～100×10 -5 g/L。
1.2 前列腺基质细胞的分离培养及鉴定 新鲜前列腺手术标本剪成2mm×2mm×2mm碎块，经消化离心后，沉淀不能溶解的组织和大块上皮细胞，再离心上清液，取沉淀细胞种入50ml培养瓶在5%CO 2 、37℃条件下培养，每周更换培养基3次，取第5代对数生长期细胞实验用。显微镜下观察细胞形态变化，取第1、5代细胞行抗α-Actin、Cytokeratin18免疫细胞化学染色，分别计算阳性细胞占总细胞数的百分比。
, 百拇医药
1.3 MTT测定细胞增殖指数 实验分7组，每组8个复孔，按细胞密度5×10 3 /cm 2 接种于96孔培养板。加入含血清培养基0.2ml，24h细胞贴壁后PBS洗2次，加入无血清培养基0.2ml，48h后细胞静止。除去上清后加入含血清培养基0.1ml，再加入10 -5 、2×10 -5 、10×10 -5 、50×10 -5 、100×10 -5 g/L5种浓度的前列通淤提取液0.1ml。作用48h后，吸除培养液，加入0.2ml MTT，37℃孵育4h，加入0.5%400μl二甲亚砜DMSO溶解形成兰色结晶色团，振动10min。在ELX800型自动酶标仪570nm波长测定每孔内DMSO溶液的吸光度(A)值。抗细胞增殖指数(%)=(对照组A值-实验组A值/对照组A值-空白组A值)×100%。
1.4 TUNEL测定凋亡指数 实验分50×10 -5 g/L前列通淤提取液和对照2组，按细胞密度5×10 3 /cm 2 接种在24孔培养板上，每组4个复孔。加入含血清培养基C1ml，24h细胞贴壁。PBS洗2次，加入无血清培养基1ml，48h细胞静止。除去上清后加入10×10 -5 g/L前列通淤提取液1ml，作用24、48和72h。按TUNEL试剂盒说明操作标记凋亡细胞，10×20倍光镜下计算5个随机视野凋亡细胞数，凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。
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1.5 统计学分析 所有数据经SPSS8.0软件处理，两组以上比较采用方差分析和两两比较的q检验。
2 结果
2.1 培养BPH基质细胞特征 显微镜下观察细胞在24h有部分贴壁生长，12日细胞几乎长满需要传代，呈典型的梭形，细胞数目增多形成细胞小结，呈现“峰与谷”的特征。免疫细胞化学染色显示第1、5代Cytokeratin18 + 上皮细胞分别占9.3%和1.7%，α-Actin + 平滑肌细胞分别占35.7%和82.3%，表明经过5～6代后已形成了以平滑肌细胞为主的前列腺基质细胞。
2.2 MTT实验 10 -5 、2×10 -5 、10×10 -5 、50×10 -5 、100×10 -5 (g/L)5种不同浓度前列通淤提取液，抗细胞增殖指数分别为53.52%、56.92%、72.94%、65.53%和50.61%，方差分析显示5种不同浓度前列通淤提取液均具有不同程度的抗增殖作用(44.21%～82.62%)，10 -5 、2×10 -5 、100×10 -5 三种浓度之间抗增殖指数差异无显著性，10×10 -5 、50×10 -5 两种浓度之间抗增殖指数差异无显著性，其余各组浓度之间差异均有显著性(见表1)。随着浓度增高抗增殖指数升高，10×10 -5 (g/L)时作用最强，但浓度进一步加大时，抗增殖指数逐渐下降。
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表1 前列通淤提取液对前列腺基质平滑肌细胞抗增殖指数 (略)
2.3 TUNEL实验 浓度为10×10 -5g/L的前列通淤提取液，作用前列腺基质平滑肌细胞24、48和72h后凋亡指数分别为1.2%、1.7%和1.8%，对照组分别为1.3%、1.5%和1.8%，采用方差分析显示各治疗组间差异无显著性。
3 讨论
我国传统中成药治疗前列腺疾病多有良方，但有关细 胞水平作用机制方面的研究报道较少。国外采用植物药治疗前列腺疾病在欧洲最活跃，有的国家多达90%的前列腺增生病人采用植物药治疗。植物药治疗前列腺疾病作用机制主要有以下几个方面的研究报告:直接抑制前列腺的生长;抗雄激素或抗雌激素作用;降低性激素结合球蛋白的含量;改变胆固醇的代谢;干扰前列腺素E的代谢起抗炎作用等 [3] 。但有关植物药对前列腺细胞动力学变化的研究则较少见。
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MTT法已被广泛应用于检测多种细胞活性、探测药物敏感性的指标，亦是中药复方药效学研究的有效方法 [4] 。本研究发现浓度为10 -5 ～100×10 -5 g/L的中药前列通淤提取液体外作用培养前列腺基质平滑肌细胞，不同浓度均有显著的抗细胞增殖作用。选择最大的抗增殖浓度10×10 -5 g/L未发现有明显的诱导凋亡作用。提示前列通淤提取液中存在抑制前列腺基质平滑肌细胞生长的有效成分。前列通淤胶囊中药方剂中的某些活性成分抑制前列腺基质平滑肌的生长可能是临床治疗前列腺疾病的细胞水平机制。大量研究表明，前列腺基质细胞的生长受多种细胞因子的调节，中药前列通淤提取液调节前列腺基质平滑肌细胞的生长可能是通过调节某种或多种生长因子起作用，亦可能是其活性成分本身即包含多种生长因子，这些都值得深入研究[5]。
本实验采用前列通淤提取液浓度是通过预实验选择的，抗增殖作用最强的浓度10×10 -5 (g/L)正好在本实验所选取的浓度范围内。低于此浓度抗增殖效果逐渐减弱，而高于此浓度抗增殖效果也逐渐减弱，如果浓度继续增高是否会促进细胞的增殖有待进一步研究。出现这种情况可能是中药所特有的“双相调节”作用，如果加大中药的剂量会出现相反的功能[6] 。临床使用前列通淤胶囊对不同的个体必须选取最适宜的剂量才能达到最佳疗效，剂量太小效果不显著，而剂量太大不但效果不佳，还可能加重症状，因此本实验结果对前列通淤胶囊的临床应用也具有重要的指导意义。
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参考文献
1 彭淑莲，贾玉森，陈和亮，等.前列通淤胶囊治疗慢性前列腺炎临床观察.中国实验方剂杂志，2000，6(4):57-59.
2 George A，Schuster，Timothy G.The relative amount of epithelial，musˉcle，connective tissue and lumen in prostatic hyperplasia as a function of the mass tissue resected.J Urol，1999，161(4):1168.
3 Franlin CL，James CK.Phytotherapy in treatment of benign prostatic hyˉperplasia:critical review.Urology，1996，48(1):12-20.
, http://www.100md.com
4 McConnell JD.Epidemiology，etiology，pathophysiology and diagnosis of benign prostatic hyperplasia.In:Walsh PC，et al.Campbell’s Urology，Volume2，7th ed，W.B.Sanders Company，Philadelphia，1998，1433.
5 刘彦珠，罗国安，龙致贤，等.首乌及其复方对平滑肌细胞增殖抑制作用的研究.清华大学学报(自然科学版)，1998，38(12):32-35.
6 曾秀池.略论中药的双向调节作用机制.实用医药杂志，2001，17(4):43.
作者单位:510080广州中山大学附属第一医院泌尿外科
(收稿日期:2003-07-09) (编辑 何蓓), 百拇医药(丘少鹏)