脑出血大鼠脑水肿与血管内皮生长因子表达
【摘要】 目的 探讨实验性脑出血大鼠脑组织含水量变化和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。方法 干-湿重法测定脑组织含水量变化;免疫组织化学方法检测VEGF在血肿周围区脑组织的表达。结果 脑出血后12h时，出血侧脑组织含水量明显高于正常和手术对照组，1d后达高峰，7d时接近于正常水平。脑出血后12h～7d血肿周围区表达VEGF阳性细胞数量逐渐增多，第7d达高峰。结论 大鼠脑出血后迅速发生脑水肿，VEGF表达逐渐增高。
关键词 脑出血 血管内皮生长因子 脑含水量
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0806-02
Acute brain edema and vascular endothelial growth factor
expression in intracerebral hemorrhage in rats
, 百拇医药
Chuai Lanxiang，Zhang Weiwei
254th Hospital of PLA，Tianjin300142.
【Abstract】 Objective To investigate the changes of the cerebral water content in rats with intracerebral hemˉorrhage(ICH)and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in brain tissue in the border zone of the hematoma.Methods The cerebral water content was measured by dry-wet weight method.The level of VEGF was performed by immunohistochemical technology.Results The cerebral water content in the ICH groups at12h，1d，3d was significantly higher than those in the normal and operated control group(P<0.05or P<0.01).The amount of VEGF positive cells was markedly increased，and reached to the highest at7d inthe border zone after ICH(P<0.01).Conclusion Brain edema formation had been rapidly observed after ICH in rat model and the expression of VEGF was gradually upregulated in the border zone.
, 百拇医药
Key words intracerebral hemorrhage vascular endothelial growth factor cerebral water content
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有促进内皮细胞增殖、增强血管通透性的功能 [1] 。脑出血发病急，死亡率和致残率高，主要死因为出血后的脑水肿和颅内高压。为探讨脑出血后VEGF表达及其与脑水肿的关系，采用大鼠脑出血模型，观察脑组织含水量变化和血肿周围区VEGF表达，以期为临床治疗脑出血提供一定的实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 健康成年SD大鼠72只，体重250～280g(解放军总医院实验动物中心提供)，随机分为正常对照组、手术对照组和脑出血12h、1d，3d，7d组。每组12只动物，其中每组用于免疫组化观察6只，脑含水量测定6只。VEGF抗体购自中山生物技术公司。
, 百拇医药
1.2 动物模型制备 采用脑内定向注射胶原酶诱发大鼠脑出血模型 [2] 。确定右侧尾状核位置为前囟后0.2mm、矢状缝向右2.9mm、深度6mm。出血组向右侧尾状核内缓慢注射Ⅶ型胶原酶0.5μl(以生理盐水配制成1U/μl，美国Sigˉma公司产品);手术对照组注入等量生理盐水。术后见肢体明显瘫痪并经病理证实有局限性血肿形成者为模型制备成功。
1.3 脑组织含水量测定 采用干-湿重法测定脑组织含水量 [2] 。在相应时间点迅速断头取脑，沿矢状线纵切开大脑两半球，于注射点前后2mm按冠状面切取脑组织。手术对照组于术后12h按相应方法取材。称取每块脑组织湿重后，在110℃电热干燥箱内烘干至恒重，称取干重。脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.4 组织切片准备 在设定时间点以4%多聚甲醛灌注固定后取脑。常规石蜡包埋脑组织，5μm连续切片备用。
, http://www.100md.com
1.5 VEGF免疫组织化学染色 应用SP法，按试剂盒说明进行染色步骤。
1.6 资料分析与统计学方法 取各大鼠断面水平相似的连续组织切片，每只大鼠随机选取3个视野，每个时间点18个视野。40倍物镜下对表达VEGF的阳性细胞进行观察并计数。计算出各时间点每高倍视野下血肿周围区表达VEGF的平均阳性细胞数。SPSS10.0统计分析软件进行AVONA分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 脑含水量变化 脑出血组于12h后，出血侧脑含水量即明显高于对照组，1d达高峰，3d时仍明显高于对照组，第7d时差异不显著。正常和手术对照组脑含水量无明显差异，见表1。
2.2 脑出血大鼠不同时间点VEGF表达 脑出血12h起可见血肿周围区散在表达VEGF的阳性细胞，胞质呈棕黄色，以神经元为主，也可见中性粒细胞和内皮细胞;1d后阳性细胞逐渐增多;7d时主要是小胶质细胞、血管内皮细胞增多明显。同时还发现随着出血时间的延长，表达VEGF的内皮细胞数量逐渐增多，早期多为单个内皮细胞，7d时细胞肥大，呈现血管样结构。正常和手术对照组表达VEGF 的阳性细胞极少，胞质呈淡黄色(见表1)。
, 百拇医药
表1 各组动物脑组织含水量(%)变化及VEGF阳性细胞计数 (略 )
3 讨论
实验性脑出血研究表明，血肿的占位效应引起的周围组织机械性损伤、溢出血管的血液成分本身引起的化学毒性反应、缺血-再灌注损伤、血-脑屏障的破坏等都是水肿的成因 [3～6] 。脑出血后4h，脑组织含水量开始增高，12h显著增高，24h达高峰 [7] 。随着时间的延长，以及各种细胞因子等变化，颅内压逐渐下降，脑水肿程度减轻，组织含水量逐渐减少，这与本实验结果相一致。
缺血缺氧强烈诱导VEGF表达来参与缺血组织的修复过程 [8] 。本实验结果显示在出血灶周围，多种细胞共同表达VEGF，提示血肿周围区因缺血、缺氧刺激了VEGF表达;而且随着时间的延长，VEGF阳性内皮细胞数量增多明显，并出现血管样结构，表明VEGF表达可以促进血肿周围区内皮细胞增殖和新生血管形成。
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VEGF可促进肿瘤周围组织水肿的形成，其作用机制可能是肿瘤细胞产生VEGF，导致新生血管形成增多，血管通透性增强，而血管通透性增强是水肿的主要根源。但也在实验结果证实，将VEGF基因应用于持续性大脑中动脉阻塞模型大鼠的缺血脑表面可减轻脑水肿 [9] ，其机制可能是通过保护内皮细胞、减小梗死体积，从而减少脑含水量，但并不加重血管源性水肿。目前，关于VEGF在脑卒中后脑水肿形成中的作用，结论尚不一致。
有研究显示，脑出血后脑水肿和继发性脑缺血与局部脑血流量迅速下降有密切关系 [10] 。本实验发现，大鼠尾状核出血后，脑含水量在12h明显升高，24h达到高峰，第7d恢复近正常;但脑出血后12h，仅有少量细胞表达VEGF，至第7d时表达数量达最高，提示急性期脑水肿可能是局部脑血流量下降所致的一种缺血性改变，并非血管通透性增加所致，VEGF可能与急性脑水肿无关。
总之，脑出血后机体发生了一系列变化。血肿直接压迫周围脑组织和小血管，引起局部血流量降低，脑细胞缺血缺氧，组织水肿。缺血缺氧可能作为一种信号激活VEGF，促使血肿周围组织细胞合成、分泌VEGF，从而促进内皮细 胞增生和新生血管形成，有利于恢复血液供应，减轻脑损伤 [11] 。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bates DO，Lodwick D，Williams B.Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability.Microcirculation，1999，6:83-96.
2 Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesleg M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.Stroke，1990，21:801-807.
3 Mayer SA，Lignelli A，FenkME，et al.Perilesional blood flow and edema formation in acute intracerebral hemorrhage.A SPECT study.Stroke，1998，29:1791-1798.
, http://www.100md.com
4 Xue M，Del Bigio MR.Intracortical hemorrhage injury in rats relationˉshipbetween blood fractions and brain cell death.Stroke，2000，31:1721-1727.
5 Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Complement activation in the brain after experimental intracerebral hemorrhage.J Neurosurg，2000，92:1016-1022.
6 Yang GY，Betz AL，ChenevertTL，et al.Experimental intracerebral hemˉorrhage:relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats.J Neurosurg，1994，81:93-102.
, 百拇医药
7 Brown MS.Comparison of magnetic reasonance imaging and histology in collagenase-induced hemorrhage in the rat.J Neuroimaging，1995，5:23-33.
8 Marti HH，Risau W.Systemic hypoxia changes the organ-specific disˉtribution of vascular endothelial factor(VEGF)and its receptors.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:15809-15814.
9 刘艳秋，周爱儒，牛大地，等.血管内皮生长因子基因治疗大鼠脑缺血的实验研究.中国生物化学与分子生物学报，1999，15:681-686.
10 汤继宏，包仕尧，刘春风，等.脑出血大鼠局部脑血流和脑水含量变化的研究.中国危重急救医学，1998，10:201-203.
11 Marti HJ，Bernaudin M，Bellail A，et al.Hypoxia-induced vascular endothelial factor(VEGF)expression precedes neovascularization after cerebral ischemia.Am J Pathol，2000，156:965-976.
(编辑 元红), http://www.100md.com(揣兰香)
关键词 脑出血 血管内皮生长因子 脑含水量
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)06-0806-02
Acute brain edema and vascular endothelial growth factor
expression in intracerebral hemorrhage in rats
, 百拇医药
Chuai Lanxiang，Zhang Weiwei
254th Hospital of PLA，Tianjin300142.
【Abstract】 Objective To investigate the changes of the cerebral water content in rats with intracerebral hemˉorrhage(ICH)and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in brain tissue in the border zone of the hematoma.Methods The cerebral water content was measured by dry-wet weight method.The level of VEGF was performed by immunohistochemical technology.Results The cerebral water content in the ICH groups at12h，1d，3d was significantly higher than those in the normal and operated control group(P<0.05or P<0.01).The amount of VEGF positive cells was markedly increased，and reached to the highest at7d inthe border zone after ICH(P<0.01).Conclusion Brain edema formation had been rapidly observed after ICH in rat model and the expression of VEGF was gradually upregulated in the border zone.
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Key words intracerebral hemorrhage vascular endothelial growth factor cerebral water content
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有促进内皮细胞增殖、增强血管通透性的功能 [1] 。脑出血发病急，死亡率和致残率高，主要死因为出血后的脑水肿和颅内高压。为探讨脑出血后VEGF表达及其与脑水肿的关系，采用大鼠脑出血模型，观察脑组织含水量变化和血肿周围区VEGF表达，以期为临床治疗脑出血提供一定的实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 健康成年SD大鼠72只，体重250～280g(解放军总医院实验动物中心提供)，随机分为正常对照组、手术对照组和脑出血12h、1d，3d，7d组。每组12只动物，其中每组用于免疫组化观察6只，脑含水量测定6只。VEGF抗体购自中山生物技术公司。
, 百拇医药
1.2 动物模型制备 采用脑内定向注射胶原酶诱发大鼠脑出血模型 [2] 。确定右侧尾状核位置为前囟后0.2mm、矢状缝向右2.9mm、深度6mm。出血组向右侧尾状核内缓慢注射Ⅶ型胶原酶0.5μl(以生理盐水配制成1U/μl，美国Sigˉma公司产品);手术对照组注入等量生理盐水。术后见肢体明显瘫痪并经病理证实有局限性血肿形成者为模型制备成功。
1.3 脑组织含水量测定 采用干-湿重法测定脑组织含水量 [2] 。在相应时间点迅速断头取脑，沿矢状线纵切开大脑两半球，于注射点前后2mm按冠状面切取脑组织。手术对照组于术后12h按相应方法取材。称取每块脑组织湿重后，在110℃电热干燥箱内烘干至恒重，称取干重。脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.4 组织切片准备 在设定时间点以4%多聚甲醛灌注固定后取脑。常规石蜡包埋脑组织，5μm连续切片备用。
, http://www.100md.com
1.5 VEGF免疫组织化学染色 应用SP法，按试剂盒说明进行染色步骤。
1.6 资料分析与统计学方法 取各大鼠断面水平相似的连续组织切片，每只大鼠随机选取3个视野，每个时间点18个视野。40倍物镜下对表达VEGF的阳性细胞进行观察并计数。计算出各时间点每高倍视野下血肿周围区表达VEGF的平均阳性细胞数。SPSS10.0统计分析软件进行AVONA分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 脑含水量变化 脑出血组于12h后，出血侧脑含水量即明显高于对照组，1d达高峰，3d时仍明显高于对照组，第7d时差异不显著。正常和手术对照组脑含水量无明显差异，见表1。
2.2 脑出血大鼠不同时间点VEGF表达 脑出血12h起可见血肿周围区散在表达VEGF的阳性细胞，胞质呈棕黄色，以神经元为主，也可见中性粒细胞和内皮细胞;1d后阳性细胞逐渐增多;7d时主要是小胶质细胞、血管内皮细胞增多明显。同时还发现随着出血时间的延长，表达VEGF的内皮细胞数量逐渐增多，早期多为单个内皮细胞，7d时细胞肥大，呈现血管样结构。正常和手术对照组表达VEGF 的阳性细胞极少，胞质呈淡黄色(见表1)。
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表1 各组动物脑组织含水量(%)变化及VEGF阳性细胞计数 (略 )
3 讨论
实验性脑出血研究表明，血肿的占位效应引起的周围组织机械性损伤、溢出血管的血液成分本身引起的化学毒性反应、缺血-再灌注损伤、血-脑屏障的破坏等都是水肿的成因 [3～6] 。脑出血后4h，脑组织含水量开始增高，12h显著增高，24h达高峰 [7] 。随着时间的延长，以及各种细胞因子等变化，颅内压逐渐下降，脑水肿程度减轻，组织含水量逐渐减少，这与本实验结果相一致。
缺血缺氧强烈诱导VEGF表达来参与缺血组织的修复过程 [8] 。本实验结果显示在出血灶周围，多种细胞共同表达VEGF，提示血肿周围区因缺血、缺氧刺激了VEGF表达;而且随着时间的延长，VEGF阳性内皮细胞数量增多明显，并出现血管样结构，表明VEGF表达可以促进血肿周围区内皮细胞增殖和新生血管形成。
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VEGF可促进肿瘤周围组织水肿的形成，其作用机制可能是肿瘤细胞产生VEGF，导致新生血管形成增多，血管通透性增强，而血管通透性增强是水肿的主要根源。但也在实验结果证实，将VEGF基因应用于持续性大脑中动脉阻塞模型大鼠的缺血脑表面可减轻脑水肿 [9] ，其机制可能是通过保护内皮细胞、减小梗死体积，从而减少脑含水量，但并不加重血管源性水肿。目前，关于VEGF在脑卒中后脑水肿形成中的作用，结论尚不一致。
有研究显示，脑出血后脑水肿和继发性脑缺血与局部脑血流量迅速下降有密切关系 [10] 。本实验发现，大鼠尾状核出血后，脑含水量在12h明显升高，24h达到高峰，第7d恢复近正常;但脑出血后12h，仅有少量细胞表达VEGF，至第7d时表达数量达最高，提示急性期脑水肿可能是局部脑血流量下降所致的一种缺血性改变，并非血管通透性增加所致，VEGF可能与急性脑水肿无关。
总之，脑出血后机体发生了一系列变化。血肿直接压迫周围脑组织和小血管，引起局部血流量降低，脑细胞缺血缺氧，组织水肿。缺血缺氧可能作为一种信号激活VEGF，促使血肿周围组织细胞合成、分泌VEGF，从而促进内皮细 胞增生和新生血管形成，有利于恢复血液供应，减轻脑损伤 [11] 。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bates DO，Lodwick D，Williams B.Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability.Microcirculation，1999，6:83-96.
2 Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesleg M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.Stroke，1990，21:801-807.
3 Mayer SA，Lignelli A，FenkME，et al.Perilesional blood flow and edema formation in acute intracerebral hemorrhage.A SPECT study.Stroke，1998，29:1791-1798.
, http://www.100md.com
4 Xue M，Del Bigio MR.Intracortical hemorrhage injury in rats relationˉshipbetween blood fractions and brain cell death.Stroke，2000，31:1721-1727.
5 Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Complement activation in the brain after experimental intracerebral hemorrhage.J Neurosurg，2000，92:1016-1022.
6 Yang GY，Betz AL，ChenevertTL，et al.Experimental intracerebral hemˉorrhage:relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats.J Neurosurg，1994，81:93-102.
, 百拇医药
7 Brown MS.Comparison of magnetic reasonance imaging and histology in collagenase-induced hemorrhage in the rat.J Neuroimaging，1995，5:23-33.
8 Marti HH，Risau W.Systemic hypoxia changes the organ-specific disˉtribution of vascular endothelial factor(VEGF)and its receptors.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:15809-15814.
9 刘艳秋，周爱儒，牛大地，等.血管内皮生长因子基因治疗大鼠脑缺血的实验研究.中国生物化学与分子生物学报，1999，15:681-686.
10 汤继宏，包仕尧，刘春风，等.脑出血大鼠局部脑血流和脑水含量变化的研究.中国危重急救医学，1998，10:201-203.
11 Marti HJ，Bernaudin M，Bellail A，et al.Hypoxia-induced vascular endothelial factor(VEGF)expression precedes neovascularization after cerebral ischemia.Am J Pathol，2000，156:965-976.
(编辑 元红), http://www.100md.com(揣兰香)