中药抗先天性华南绿头鸭乙肝病毒的实验研究
摘要】 目的 通过应用先天感染的绿头鸭乙型肝炎动物模型，从而筛选有效的抗病毒中草药。方法 应用先天性感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)模型，随机分组，给予阳性药物和几种中药提取物进行治疗，采用斑点杂交方法检测血清DHBV-DNA的水平。结果 用叶下珠醇提取物后5d，10d鸭血清DHBV-DNA OD值均明显低于给药前，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)。停药后3d后没有明显反跳现象。结论 在华南绿头鸭乙型肝炎模型中，中药叶下珠醇提物对鸭乙肝病毒有一定的抑制作用。
关键词 中药 鸭乙型肝炎病毒 动物模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)08-0696-02
Experimental study of traditional Chinese medicine on duck
hepatitis B virus in congenital south China green-headed ducklings
, 百拇医药
Mo Xiaoyu，Li Xiangyang，Pan Zongqi，et al.
The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of TCM，Guangzhou510405.
【Abstract】 Objective To use the green-headed ducklings infected with DHBV congeitally as the hepatitis B animal model，and to screen the antiviral effect of traditional Chinese mdicine.Methods Used the green-headed ducklings infected with DHBV congenitally as the hepatitis B animal model，and then positived medicine and several kinds extractives of traditional Chinese medicine were given for treatment，and DHBV-DNA was detected by dot-blot hybridization test.Results Aftermedicated with the extractives of Phyllanthus urinaria5days and10days，optic density value(OD value)of DHBV-DNA in ducklings’sera were obviously lower than that before treatment，there was significant diference and rebound phenomenon didn’t appeared3days after stopping medication(P<0.05，P<0.01).Conclusion The extractive of Phyllanthus urinaria could inhibit the replication of DHBV-DNA in South China green-headed ducklings as the hepatitis B animal model.
, http://www.100md.com
Key words traditional Chinese medicine duck hepatitis B virus duck hepatitismodel
鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝病毒，两者的病毒大分子结构和复制过程有很多相似之处，因而近年来用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究。在以往的研究中，已有很多文献报道各地区鸭种的自然感染率，其结果随着地区和鸭种的不同而有很大变化。广州中医药大学热带医学研究所曾用斑点杂交(Dot Blot)法对华南不同鸭种的1d龄雏鸭乙肝病毒垂直感染情况调查中，发现华南绿头鸭的DHBV自然携带率较高且持续带毒时间更长。同时实验得出先天性感染绿头鸭较后天性感染的自然携带率高且持续带毒时间长。这表明，先天性感染绿头鸭在筛选有效的治疗抗乙肝药物时显示出其优越性、可靠性。
1 材料与方法
1.1 动物 1日龄雄性绿头鸭，购于南海大沥江夏村孵化场。
, http://www.100md.com
1.2 仪器与试剂 NC膜，购自Amersham公司。96孔杂交点样器:美国Bio-rad公司产品。盖氏计数器:美国S.E.International公司产品。南京华东电子管厂生产DG3022A型酶联免疫析测仪(使用490nm波长滤片)。DHBV质粒:由广州中医药大学热带医学研究所技术人员自行提取。试剂:缺口翻译盒，购自promega公司。α- 32 P-dCTP，购自北京亚辉生物有限公司。Sephadex G-50，购自Pharmacia公司。20×SSC，甲酰胺，100×Denhardt，10%SDS，10%焦磷酸钠ppi，变性鲑精SSDNA均购自华美生物工程公司。
1.3 受试药物 叶下珠、赤芍、半边莲等中草药均购于广州中医药大学第一附属医院，制剂由广州中医药大学热带医学研究所制剂室提取，以蒸馏水配成所需浓度。阿昔洛韦(ACV)购自湖北医药工业研究所。
1.4 方法
1.4.1 接种途径及筛选 上海鸭DHBV阳性传代血清。广州绿头鸭购回后，当天于胫静脉注射阳性病毒血清0.2ml/只，于第2天，第10天分别于胫静脉采血(0.5ml/只)，分离血清用斑点杂交方法检测，于第15天出结果，保留先天感染DHBV阳性鸭子。
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1.4.2 药物治疗实验 将筛选出的先天感染DHBV阳性雏鸭40只，随机分成5组，每组8只。叶下珠醇提取物10g·kg -1 ·d -1 给药;阳性对照组ACV按100mg·kg -1 ·d -1 的剂量给药;病毒对照组给予等量生理盐水，给药组均灌胃给药，共10d。于给药前(T 0 )，给药第5d(T 5 )、第10d(T 10 )和停药后第3d(P 3 )，自鸭胫静脉取血，-70℃保存待测。
1.4.3 检测方法 取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA含量定量分析，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用 32 P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交(Dot Blot)试验。放射自显影后进行结果判断:X线胶片上有斑点阴影者阳性，DHBV-DNA含量定量分析用酶联免疫析测仪对放射自显影X线胶片上斑点进行光谱吸光度(A)检测。
1.4.4 统计学方法 用药后前后值比较，采用方差分析法 进行。
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2 结果
几种药物对DHBV的抑制作用，见表1。在先天性感染DHBV的广州绿头鸭对DHBV-DNA的抑制作用:OD 490 值(ˉx±s)。
表1 几种药物对DHBV-DNA的抑制作用 (略)
上表显示:(1)叶下珠醇提取物用药后，OD 490 值降低，用药后5d(T 5 )OD 490 值降低(P<0.05)，用药后10d(T 10 )OD 490 值降低(P<0.01)可以抑制DHBV。且在停药3d后没有出现反跳。(2)ACV组与用药前(T 0 )OD 490 值比较，用药后5d(T 5 )OD 490 值降低(P<0.05)，用药后10d(T 10 )OD 490 值降低(P<0.01)，但在停药后3d出现了反跳。
3 讨论
目前，国内外多采用鸭乙肝模型进行抗乙肝药物的实验研究，鸭种各国根据具体情况而不同，国外多采用先天感染的北京鸭雏鸭或康贝鸭作为乙型肝炎的动物模型;而国内目前选用后天感染DHBV的北京鸭为肝炎的动物模型，这在筛选有效的治疗药物时存在着很大的局限性。而广州华立健医研究所曾用斑点杂交(Dot Blot)法对华南不同鸭种的1d龄雏鸭乙肝病毒垂直感染情况调查中，发现华南绿头鸭的DHBV自然携带率较高且持续带毒时间更长。这表明，先天性感染绿头鸭在筛选有效的治疗乙肝药物时显示出其优越性及可靠性。
, http://www.100md.com
近年来研究发现在体内或体外嗜肝DNA病毒复制有抑制作用的药物大致分为脱氧鸟嘌呤核苷类似物:如阿昔洛韦(acyclovir ACV)、更昔洛韦(ganciclovir GCV) [1] 、泛昔洛 韦(famciclovir FCV) [2] 等;脱氧胞嘧啶核苷类似物:如拉米夫定。我们应用先天性感染的广州绿头鸭进行ACV及几种中药的抗病毒实验研究，结果表明ACV用药后能使血清中DHBV-DNA含量总体水平显著降低，但停药3d后出现不同程度的“反跳”。而中草药叶下珠醇提取物可以阻断病毒感染，同时也可以抑制停药后的“反跳”。
由此可见:先天性感染绿头鸭在筛选有效的治疗乙肝药物时显示出了优越性和可靠性，而中草药叶下珠等在抗乙肝病毒方面也显示其独特的优势，同时显示出了在中医药领域进行抗乙肝药物研究有着很大的潜力和前景，这有待于我们去更加深入地研究和开发。
参考文献
, 百拇医药
1 Luscombe C，Pedersen J，Uren，E，et al.Long-term ganciclovir chemotherapyfor congenital duck hepatitis B virus infection in vivo efˉfect on intrahepatic-viral DNA.RNA.And protein expression.Hepaˉtology，1996，24:776-773.
2 Tsiquaye KN，Sutton D，MaungM，et al.Antiviral activities and pharmaˉcokinetics of penciclovir and famciclovir in penkin ducks chronically inˉfected with duck hepatitis B virus.Antiviral Chemistry Chemother，1996，7:153-159.
(收稿日期:2003-05-07) (编辑元 红), 百拇医药(莫小余)
关键词 中药 鸭乙型肝炎病毒 动物模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)08-0696-02
Experimental study of traditional Chinese medicine on duck
hepatitis B virus in congenital south China green-headed ducklings
, 百拇医药
Mo Xiaoyu，Li Xiangyang，Pan Zongqi，et al.
The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of TCM，Guangzhou510405.
【Abstract】 Objective To use the green-headed ducklings infected with DHBV congeitally as the hepatitis B animal model，and to screen the antiviral effect of traditional Chinese mdicine.Methods Used the green-headed ducklings infected with DHBV congenitally as the hepatitis B animal model，and then positived medicine and several kinds extractives of traditional Chinese medicine were given for treatment，and DHBV-DNA was detected by dot-blot hybridization test.Results Aftermedicated with the extractives of Phyllanthus urinaria5days and10days，optic density value(OD value)of DHBV-DNA in ducklings’sera were obviously lower than that before treatment，there was significant diference and rebound phenomenon didn’t appeared3days after stopping medication(P<0.05，P<0.01).Conclusion The extractive of Phyllanthus urinaria could inhibit the replication of DHBV-DNA in South China green-headed ducklings as the hepatitis B animal model.
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Key words traditional Chinese medicine duck hepatitis B virus duck hepatitismodel
鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝病毒，两者的病毒大分子结构和复制过程有很多相似之处，因而近年来用DHBV感染鸭作为乙型肝炎动物模型来研究。在以往的研究中，已有很多文献报道各地区鸭种的自然感染率，其结果随着地区和鸭种的不同而有很大变化。广州中医药大学热带医学研究所曾用斑点杂交(Dot Blot)法对华南不同鸭种的1d龄雏鸭乙肝病毒垂直感染情况调查中，发现华南绿头鸭的DHBV自然携带率较高且持续带毒时间更长。同时实验得出先天性感染绿头鸭较后天性感染的自然携带率高且持续带毒时间长。这表明，先天性感染绿头鸭在筛选有效的治疗抗乙肝药物时显示出其优越性、可靠性。
1 材料与方法
1.1 动物 1日龄雄性绿头鸭，购于南海大沥江夏村孵化场。
, http://www.100md.com
1.2 仪器与试剂 NC膜，购自Amersham公司。96孔杂交点样器:美国Bio-rad公司产品。盖氏计数器:美国S.E.International公司产品。南京华东电子管厂生产DG3022A型酶联免疫析测仪(使用490nm波长滤片)。DHBV质粒:由广州中医药大学热带医学研究所技术人员自行提取。试剂:缺口翻译盒，购自promega公司。α- 32 P-dCTP，购自北京亚辉生物有限公司。Sephadex G-50，购自Pharmacia公司。20×SSC，甲酰胺，100×Denhardt，10%SDS，10%焦磷酸钠ppi，变性鲑精SSDNA均购自华美生物工程公司。
1.3 受试药物 叶下珠、赤芍、半边莲等中草药均购于广州中医药大学第一附属医院，制剂由广州中医药大学热带医学研究所制剂室提取，以蒸馏水配成所需浓度。阿昔洛韦(ACV)购自湖北医药工业研究所。
1.4 方法
1.4.1 接种途径及筛选 上海鸭DHBV阳性传代血清。广州绿头鸭购回后，当天于胫静脉注射阳性病毒血清0.2ml/只，于第2天，第10天分别于胫静脉采血(0.5ml/只)，分离血清用斑点杂交方法检测，于第15天出结果，保留先天感染DHBV阳性鸭子。
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1.4.2 药物治疗实验 将筛选出的先天感染DHBV阳性雏鸭40只，随机分成5组，每组8只。叶下珠醇提取物10g·kg -1 ·d -1 给药;阳性对照组ACV按100mg·kg -1 ·d -1 的剂量给药;病毒对照组给予等量生理盐水，给药组均灌胃给药，共10d。于给药前(T 0 )，给药第5d(T 5 )、第10d(T 10 )和停药后第3d(P 3 )，自鸭胫静脉取血，-70℃保存待测。
1.4.3 检测方法 取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA含量定量分析，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用 32 P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交(Dot Blot)试验。放射自显影后进行结果判断:X线胶片上有斑点阴影者阳性，DHBV-DNA含量定量分析用酶联免疫析测仪对放射自显影X线胶片上斑点进行光谱吸光度(A)检测。
1.4.4 统计学方法 用药后前后值比较，采用方差分析法 进行。
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2 结果
几种药物对DHBV的抑制作用，见表1。在先天性感染DHBV的广州绿头鸭对DHBV-DNA的抑制作用:OD 490 值(ˉx±s)。
表1 几种药物对DHBV-DNA的抑制作用 (略)
上表显示:(1)叶下珠醇提取物用药后，OD 490 值降低，用药后5d(T 5 )OD 490 值降低(P<0.05)，用药后10d(T 10 )OD 490 值降低(P<0.01)可以抑制DHBV。且在停药3d后没有出现反跳。(2)ACV组与用药前(T 0 )OD 490 值比较，用药后5d(T 5 )OD 490 值降低(P<0.05)，用药后10d(T 10 )OD 490 值降低(P<0.01)，但在停药后3d出现了反跳。
3 讨论
目前，国内外多采用鸭乙肝模型进行抗乙肝药物的实验研究，鸭种各国根据具体情况而不同，国外多采用先天感染的北京鸭雏鸭或康贝鸭作为乙型肝炎的动物模型;而国内目前选用后天感染DHBV的北京鸭为肝炎的动物模型，这在筛选有效的治疗药物时存在着很大的局限性。而广州华立健医研究所曾用斑点杂交(Dot Blot)法对华南不同鸭种的1d龄雏鸭乙肝病毒垂直感染情况调查中，发现华南绿头鸭的DHBV自然携带率较高且持续带毒时间更长。这表明，先天性感染绿头鸭在筛选有效的治疗乙肝药物时显示出其优越性及可靠性。
, http://www.100md.com
近年来研究发现在体内或体外嗜肝DNA病毒复制有抑制作用的药物大致分为脱氧鸟嘌呤核苷类似物:如阿昔洛韦(acyclovir ACV)、更昔洛韦(ganciclovir GCV) [1] 、泛昔洛 韦(famciclovir FCV) [2] 等;脱氧胞嘧啶核苷类似物:如拉米夫定。我们应用先天性感染的广州绿头鸭进行ACV及几种中药的抗病毒实验研究，结果表明ACV用药后能使血清中DHBV-DNA含量总体水平显著降低，但停药3d后出现不同程度的“反跳”。而中草药叶下珠醇提取物可以阻断病毒感染，同时也可以抑制停药后的“反跳”。
由此可见:先天性感染绿头鸭在筛选有效的治疗乙肝药物时显示出了优越性和可靠性，而中草药叶下珠等在抗乙肝病毒方面也显示其独特的优势，同时显示出了在中医药领域进行抗乙肝药物研究有着很大的潜力和前景，这有待于我们去更加深入地研究和开发。
参考文献
, 百拇医药
1 Luscombe C，Pedersen J，Uren，E，et al.Long-term ganciclovir chemotherapyfor congenital duck hepatitis B virus infection in vivo efˉfect on intrahepatic-viral DNA.RNA.And protein expression.Hepaˉtology，1996，24:776-773.
2 Tsiquaye KN，Sutton D，MaungM，et al.Antiviral activities and pharmaˉcokinetics of penciclovir and famciclovir in penkin ducks chronically inˉfected with duck hepatitis B virus.Antiviral Chemistry Chemother，1996，7:153-159.
(收稿日期:2003-05-07) (编辑元 红), 百拇医药(莫小余)