胃癌中TGF-β 1 、VEGF表达及其与肿瘤血管形成关系的研究
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中华医学研究杂志
【摘要】 目的 研究转化生长因子β 1 (TGF-β 1 )、血管内皮生长因子(VEGF)在胃癌中的表达，探讨其在肿瘤血管形成中的关系。方法 用SP免疫组化法，检测45例胃癌手术切除标本中胃癌组织及癌周组织TGF-β 1 和VEGF蛋白的表达，用抗CD34单克隆抗体显示血管内皮细胞。结果 TGF-β 1 和VEGF阳性表达产物主要见于细胞的胞浆内，两者阳性表达率显著高于癌周组织(P<0.05)。在胃癌组织和癌周组织内可见血管内皮细胞胞浆呈棕黄色。TGF-β 1 和VEGF表达之间存在显著正相关(P<0.05，r=0.874)，TGF-β1和VEGF均表达阳性者MVD值显著高于表达阴性者的MVD值(P<0.05)。结论 TGF-β1和VEGF在胃癌组织中存在高水平表达，TGF-β 1 对VEGF呈现正向调控，两者可能共同参与胃癌的血管形成。
关键词 TGF-β 1 VEGF MVD 胃癌 肿瘤血管形成 SP免疫组化
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)09-0784-03
Study on the expression of TGFˉβ 1 and VEGF in gastric carcinoma
and therelationship with tumor angiogenesis
Li Rong，Wang Fenrong，Song Zhengjun
The Fifth Hospital of Xi′an City，Shaanxi710082.
【Abstract】 Objective The current study was designed to investigate the expression of transforming growth factor-beta1(TGF-β 1 )and vascular endothelial growth factor(VEGF)in gastric carcinoma，to study their important role in angiogenesis of gastric carcinoma.Methods The expression of TGF-β 1 and VEGF protein and CD34in surgiˉcal samples of45patients with gastric carcinoma were determined by SP immunohistochemical staining method.Intratuˉmoral TGF-β 1 ，VEGF and microvessel density(MVD)were stained with anti-TGF-β 1 、anti-VEGF andanti-CD34monoclonal antibody respectively.Results The positive expression of TGF-β 1 and VEGF were stained mainly in the cytoplasm of cells.TGF-β 1 and VEGF-positive expression percentage in gastric carcinoma tissue were significantly higher than that in peri-cancerous tissue(P<0.05).Vascular endothelial cell was stained brown in gastric carcinoˉma，peri-cancerous tissue.There was significant correlation between the expression of TGF-β 1 and the expression of VEGF(P<0.05，r=0.874).The positive expression and negative expression of TGF-β 1 and VEGF was correlation with the mean MVD(P<0.05).Conclusion There are high expres
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sion of TGF-β 1 and VEGF in gastric carcinoma，TGF-β 1 regulate VEGF expression，which may promote the angiogenesis of gastric carcinoma.
Key words TGF-β 1 VEGF MVD gastric carcinoma tumor angiogenesis immunohistochemistry
Folkman研究表明 [1] ，肿瘤的血管生成是由于血管生成因子和血管抑制因子平衡改变的结果，因此肿瘤血管的生成受控于一系列正负调节因子。目前已发现20多种与血管生成相关的因子，其中TGF-β 1 和VEGF共同对肿瘤血管形成方面的研究不多，对胃癌的研究更少。因此，我们采用免疫组化SP法研究TGF-β 1 和VEGF在胃癌中的表达，以及与微血管密度(MVD)关系，不仅有助于胃癌发病机制中肿瘤组织的血管生成理解，也为我们在肿瘤治疗和防治中提供一个新的思路。
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1 资料与方法
1.1 临床资料 选自我院外科1999年1月～2000年10月间手术治疗的胃癌病人45例，其中男35例，女10例，年龄33～78岁。术前所有的患者均进行过胃肠钡餐、内窥镜检查和活检，所有病例均经病理证实，患者术前均未进行过任何放疗或化疗。本组病例中根治性胃癌切除术35例，非 根治性手术者10例。
1.2 主要试剂 第一抗体试剂:免疫人多克隆TGFˉβ 1 抗体;购于武汉博士德生物技术公司。即用型兔抗人多克隆VEGF抗体;鼠抗人单克隆CD34抗体;购于福州迈新生物技术开发公司。第二抗体试剂:链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒，购于福州迈新生物技术开发公司。染色剂:二氨基联苯胺四盐酸盐(Diamino benziˉdine，DAB)。
1.3 实验方法和主要步骤 45例手术切除胃癌标本，采用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4张，切片厚4μm。取材部位:癌组织2块，距癌肿边缘5cm处取材2块，用于免疫组化染色。SP免疫组化法主要步骤如下:石蜡切片脱蜡水化;组织抗原微波修复(枸橼酸缓冲液0.01mol/L，pH=6.0，5min×3);滴加一抗，置湿盒中37℃温箱孵育20min;上述步骤之间均以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)洗片3次，DAB显色，苏木素复染;脱水、中性树脂封片。取已知含有待检抗原的切片经上述步骤染色，作为阳性对照。用磷酸盐缓冲液代替第一抗体经上述步骤染色，作为阴性对照。
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1.4 统计学方法
1.4.1 计数资料 TGF-β 1 和VEGF的表达分级关系采用χ 2 检验。
1.4.2 计量资料 MVD值用(ˉx±s)表示，两组间均数比较采用成组t检验。采用SPSS软件10.0进行相关性分析，α=0.05。
2 结果
2.1 结果判定
2.1.1 TGF-β 1 和VEGF的阳性判定 TGF-β 1 和VEGF均为细胞浆着色，两者染色阳性以细胞浆呈棕色颗粒状染色为标准，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为阳性细胞染色。每张切片根据阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数的多少进行分级:染色强度(未着色、弱、中、强)及阳性细胞百分数(0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%)分别积分为0、1、2、3。并根据这两项指标的积分数之和分为4级，即两项分数之和为0分者，计为TGF-β 1 、VEGF表达阴性(-)，1～2分者为弱阳性(+)，3～4分者为阳性(++)，5～6分者为强阳性(+++)。
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2.1.2 CD34阳性判定 参照Weidner等的方法 [2] ，CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准;微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数。只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。低倍(×40)下观察切片，选择微血管分布最高密度区;然后在高倍(×200，每个视野面积为0.785mm 2 )下计数3个视野的微血管数，取其平均值为该例的MVD值。
2.2 TGF-β 1 和VEGE在胃癌中的表达 TGF-β 1 和VEGF的阳性表达产物主要分布在细胞的胞浆内，呈棕黄色颗粒染色，细胞核无阳性表达。见表1。
表1 TGFβ 1 在胃癌和癌周组织中的表达(略)
表2 VEGF在胃癌和癌周组织中的表达(略)
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2.3 TGF-β 1 和VEGF共同与胃癌血管生成的关系
2.3.1 TGF-β 1 与VEGF的关系 见表3。
表3 45例胃癌患者中TGF-β 1 与VEGF的关系(略)
由表3经卡方检验可得，P<0.05，提示VEGF与TGF-β 1 表达之间存在统计学意义;经SPSS软件计数资料相关性分析，TGF-β 1 与VEGF表达之间存在正相关关系(r=0.874)。这个结果提示，TGF-β 1 可能通过上调VEGF，促进胃癌血管的生成。
2.3.2 TGF-β 1 和VEGF与胃癌组织中肿瘤血管微密度的关系 见表4，在胃癌组织内可见血管内皮细胞胞浆呈棕黄色染色。
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表4 45例胃癌病例中TGFˉβ 1 和VEGF与MVD 表达之间的关系(略)
由表4可知，在45例胃癌病例中，TGFˉβ 1 和VEGF表达均阳性者，其MVD值明显高于两者表达均阴性的MVD值，两者相比较差异有显著性(P<0.05)，此结果表明TGFˉβ 1 与VEGF的表达与肿瘤血管微密度有关，提示两者有共同促进胃癌血管生成
作用。
3 讨论
最近Benjamin等 [3] 指出血管与血管壁细胞之间联系的形成标志着生长因子依赖性的结束，肿瘤血管则陷入一种高水平的生长因子引起和维持的、缺乏壁细胞包围的未成熟血管系统的循环，所以有人将其称之为“不可修复的创伤”，去除生长因子不仅停止了新血管的生长，同时也使未成熟的肿瘤血管解聚。除需要壁细胞包围新形成的管腔样结构和基底膜产生外，局部TGFˉβ 1 的活化是稳定新生血管结构的重要因素，TGFˉβ 1 可抑制内皮细胞的增生、迁移，同时刺激周细胞、血管平滑细胞的增生和分化，这样才能使血管样结构成为稳定的、成熟的血管床 [4] 。目前研究表明，TGFˉβ 1 对肿瘤血管生成的
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调控主要表现在影响内皮细胞血管生成，同时，它也是强烈的趋化因子，可吸引巨噬细胞和成纤维细胞的局部聚集，并释放bFGF、PDGF、TNFα等多种血管活性因子;此外，TGFˉβ 1 还可诱导成纤维细胞、上皮细胞、角化细胞等多种细胞生成和分泌VEGF这一强烈的促血管生成因子。有研究表明，TGFˉβ 1 与bFGF、VEGF等血管生成促进因子具有协同效应，并且不同条件下刺激内皮细胞表面的TβRⅠ、TβRⅡ的数量和功能有所改变，推测不同条件下内皮细胞表面的TGFˉβ受体的改变更有利于发挥TGFˉβ 1 对内皮细胞血管生成的调节作用。国外学者在研究中发现 [5，6] ，高浓度和低浓度TGF-β 1 可分别促进和抑制血管内皮的长入和毛细血管腔的形成，这个结果表明:在促进血管生成中TGF-β 1 表现出的双向效应，可能与不同量的TGF-β 1 对bFGF和VEGF不同的调控作用有关。此外，Perˉtovaara [7]等在研究中发现，由TGF-β 1 诱导下仅有VEGF的表达而无相应的TGF-β 1 受体的出现，因而推断TGF-β 1 对血管内皮细胞的促血管生成作用至少部分是通过对周围其它细胞内的VEGF的旁诱导生成来间接实现。
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我们的研究结果显示:TGFˉβ 1 和VEGF在胃癌中存在高表达，两者之间存在显著相关性(P<0.05，r=0.874)，这个结果提示，TGFˉβ 1 可能通过上调VEGF，促进肿瘤血管的生成。在45例胃癌病例中，TGFˉβ 1 和VEGF表达均为阳性者MVD值(62.43±17.07)明显高于两者表达均为阴性者MVD值(40.00±19.34)，提示TGFˉβ 1 与VEGF有共同促进肿瘤血管生成的作用。
参考文献
1 Folkman J，Wastin K，Ingber D，et al.Induction of angiogenesis during thetransiton formhyperplasia to neoplasia.Nature，1989，339(12):58-61.
2 Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new signifiˉcant independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl CancerInst，1992，84(9):1875-1887.
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3 Benjamin LE，Golijanin D，Itin A，et al.Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelialgrowth factor withdrawal.J Clin Invest，1999，10(3):159-165.
4 Roberts A，Sporn M.Transforming growth factorβin molecular and celˉlular biology of wound repair.PAF Clark，Med.New York:Plenum Press，1996，43(15):275-308.
5 Pepper MS，Vassalli JD，Orci L，et al.Biphasic effect of transforming growth factor-beta1on in vitro angiogenesis.Exp Cell Res，1993，20(4):356-363.
, 百拇医药
6 Vailhe B，Tranqui L.The role of the transforming growth factor betal(TGF-beta1)and of vascular endothelial growth factor(VEGF)the vitro angiogenesis process.C R Acad SciⅢ，1996，3199(11):1003-1010.
7 Pertovaara L，Kaipainen A，Mustonen T，et al.Vascular endothelial growth factor is induced in response to transforming growth factor beta1in fibroblastic and epithelial cells.J Biol Chen，1994，269(9):6271-6274.
作者单位:1 710082陕西省西安市第五医院内科
2 710061西安交通大学第一医院消化内科
(收稿日期:2003-05-09) (编辑 于少伟), 百拇医药
关键词 TGF-β 1 VEGF MVD 胃癌 肿瘤血管形成 SP免疫组化
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)09-0784-03
Study on the expression of TGFˉβ 1 and VEGF in gastric carcinoma
and therelationship with tumor angiogenesis
Li Rong，Wang Fenrong，Song Zhengjun
The Fifth Hospital of Xi′an City，Shaanxi710082.
【Abstract】 Objective The current study was designed to investigate the expression of transforming growth factor-beta1(TGF-β 1 )and vascular endothelial growth factor(VEGF)in gastric carcinoma，to study their important role in angiogenesis of gastric carcinoma.Methods The expression of TGF-β 1 and VEGF protein and CD34in surgiˉcal samples of45patients with gastric carcinoma were determined by SP immunohistochemical staining method.Intratuˉmoral TGF-β 1 ，VEGF and microvessel density(MVD)were stained with anti-TGF-β 1 、anti-VEGF andanti-CD34monoclonal antibody respectively.Results The positive expression of TGF-β 1 and VEGF were stained mainly in the cytoplasm of cells.TGF-β 1 and VEGF-positive expression percentage in gastric carcinoma tissue were significantly higher than that in peri-cancerous tissue(P<0.05).Vascular endothelial cell was stained brown in gastric carcinoˉma，peri-cancerous tissue.There was significant correlation between the expression of TGF-β 1 and the expression of VEGF(P<0.05，r=0.874).The positive expression and negative expression of TGF-β 1 and VEGF was correlation with the mean MVD(P<0.05).Conclusion There are high expres
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sion of TGF-β 1 and VEGF in gastric carcinoma，TGF-β 1 regulate VEGF expression，which may promote the angiogenesis of gastric carcinoma.
Key words TGF-β 1 VEGF MVD gastric carcinoma tumor angiogenesis immunohistochemistry
Folkman研究表明 [1] ，肿瘤的血管生成是由于血管生成因子和血管抑制因子平衡改变的结果，因此肿瘤血管的生成受控于一系列正负调节因子。目前已发现20多种与血管生成相关的因子，其中TGF-β 1 和VEGF共同对肿瘤血管形成方面的研究不多，对胃癌的研究更少。因此，我们采用免疫组化SP法研究TGF-β 1 和VEGF在胃癌中的表达，以及与微血管密度(MVD)关系，不仅有助于胃癌发病机制中肿瘤组织的血管生成理解，也为我们在肿瘤治疗和防治中提供一个新的思路。
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1 资料与方法
1.1 临床资料 选自我院外科1999年1月～2000年10月间手术治疗的胃癌病人45例，其中男35例，女10例，年龄33～78岁。术前所有的患者均进行过胃肠钡餐、内窥镜检查和活检，所有病例均经病理证实，患者术前均未进行过任何放疗或化疗。本组病例中根治性胃癌切除术35例，非 根治性手术者10例。
1.2 主要试剂 第一抗体试剂:免疫人多克隆TGFˉβ 1 抗体;购于武汉博士德生物技术公司。即用型兔抗人多克隆VEGF抗体;鼠抗人单克隆CD34抗体;购于福州迈新生物技术开发公司。第二抗体试剂:链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒，购于福州迈新生物技术开发公司。染色剂:二氨基联苯胺四盐酸盐(Diamino benziˉdine，DAB)。
1.3 实验方法和主要步骤 45例手术切除胃癌标本，采用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4张，切片厚4μm。取材部位:癌组织2块，距癌肿边缘5cm处取材2块，用于免疫组化染色。SP免疫组化法主要步骤如下:石蜡切片脱蜡水化;组织抗原微波修复(枸橼酸缓冲液0.01mol/L，pH=6.0，5min×3);滴加一抗，置湿盒中37℃温箱孵育20min;上述步骤之间均以磷酸盐缓冲液(pH=7.4)洗片3次，DAB显色，苏木素复染;脱水、中性树脂封片。取已知含有待检抗原的切片经上述步骤染色，作为阳性对照。用磷酸盐缓冲液代替第一抗体经上述步骤染色，作为阴性对照。
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1.4 统计学方法
1.4.1 计数资料 TGF-β 1 和VEGF的表达分级关系采用χ 2 检验。
1.4.2 计量资料 MVD值用(ˉx±s)表示，两组间均数比较采用成组t检验。采用SPSS软件10.0进行相关性分析，α=0.05。
2 结果
2.1 结果判定
2.1.1 TGF-β 1 和VEGF的阳性判定 TGF-β 1 和VEGF均为细胞浆着色，两者染色阳性以细胞浆呈棕色颗粒状染色为标准，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为阳性细胞染色。每张切片根据阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数的多少进行分级:染色强度(未着色、弱、中、强)及阳性细胞百分数(0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%)分别积分为0、1、2、3。并根据这两项指标的积分数之和分为4级，即两项分数之和为0分者，计为TGF-β 1 、VEGF表达阴性(-)，1～2分者为弱阳性(+)，3～4分者为阳性(++)，5～6分者为强阳性(+++)。
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2.1.2 CD34阳性判定 参照Weidner等的方法 [2] ，CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准;微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数。只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。低倍(×40)下观察切片，选择微血管分布最高密度区;然后在高倍(×200，每个视野面积为0.785mm 2 )下计数3个视野的微血管数，取其平均值为该例的MVD值。
2.2 TGF-β 1 和VEGE在胃癌中的表达 TGF-β 1 和VEGF的阳性表达产物主要分布在细胞的胞浆内，呈棕黄色颗粒染色，细胞核无阳性表达。见表1。
表1 TGFβ 1 在胃癌和癌周组织中的表达(略)
表2 VEGF在胃癌和癌周组织中的表达(略)
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2.3 TGF-β 1 和VEGF共同与胃癌血管生成的关系
2.3.1 TGF-β 1 与VEGF的关系 见表3。
表3 45例胃癌患者中TGF-β 1 与VEGF的关系(略)
由表3经卡方检验可得，P<0.05，提示VEGF与TGF-β 1 表达之间存在统计学意义;经SPSS软件计数资料相关性分析，TGF-β 1 与VEGF表达之间存在正相关关系(r=0.874)。这个结果提示，TGF-β 1 可能通过上调VEGF，促进胃癌血管的生成。
2.3.2 TGF-β 1 和VEGF与胃癌组织中肿瘤血管微密度的关系 见表4，在胃癌组织内可见血管内皮细胞胞浆呈棕黄色染色。
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表4 45例胃癌病例中TGFˉβ 1 和VEGF与MVD 表达之间的关系(略)
由表4可知，在45例胃癌病例中，TGFˉβ 1 和VEGF表达均阳性者，其MVD值明显高于两者表达均阴性的MVD值，两者相比较差异有显著性(P<0.05)，此结果表明TGFˉβ 1 与VEGF的表达与肿瘤血管微密度有关，提示两者有共同促进胃癌血管生成
作用。
3 讨论
最近Benjamin等 [3] 指出血管与血管壁细胞之间联系的形成标志着生长因子依赖性的结束，肿瘤血管则陷入一种高水平的生长因子引起和维持的、缺乏壁细胞包围的未成熟血管系统的循环，所以有人将其称之为“不可修复的创伤”，去除生长因子不仅停止了新血管的生长，同时也使未成熟的肿瘤血管解聚。除需要壁细胞包围新形成的管腔样结构和基底膜产生外，局部TGFˉβ 1 的活化是稳定新生血管结构的重要因素，TGFˉβ 1 可抑制内皮细胞的增生、迁移，同时刺激周细胞、血管平滑细胞的增生和分化，这样才能使血管样结构成为稳定的、成熟的血管床 [4] 。目前研究表明，TGFˉβ 1 对肿瘤血管生成的
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调控主要表现在影响内皮细胞血管生成，同时，它也是强烈的趋化因子，可吸引巨噬细胞和成纤维细胞的局部聚集，并释放bFGF、PDGF、TNFα等多种血管活性因子;此外，TGFˉβ 1 还可诱导成纤维细胞、上皮细胞、角化细胞等多种细胞生成和分泌VEGF这一强烈的促血管生成因子。有研究表明，TGFˉβ 1 与bFGF、VEGF等血管生成促进因子具有协同效应，并且不同条件下刺激内皮细胞表面的TβRⅠ、TβRⅡ的数量和功能有所改变，推测不同条件下内皮细胞表面的TGFˉβ受体的改变更有利于发挥TGFˉβ 1 对内皮细胞血管生成的调节作用。国外学者在研究中发现 [5，6] ，高浓度和低浓度TGF-β 1 可分别促进和抑制血管内皮的长入和毛细血管腔的形成，这个结果表明:在促进血管生成中TGF-β 1 表现出的双向效应，可能与不同量的TGF-β 1 对bFGF和VEGF不同的调控作用有关。此外，Perˉtovaara [7]等在研究中发现，由TGF-β 1 诱导下仅有VEGF的表达而无相应的TGF-β 1 受体的出现，因而推断TGF-β 1 对血管内皮细胞的促血管生成作用至少部分是通过对周围其它细胞内的VEGF的旁诱导生成来间接实现。
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我们的研究结果显示:TGFˉβ 1 和VEGF在胃癌中存在高表达，两者之间存在显著相关性(P<0.05，r=0.874)，这个结果提示，TGFˉβ 1 可能通过上调VEGF，促进肿瘤血管的生成。在45例胃癌病例中，TGFˉβ 1 和VEGF表达均为阳性者MVD值(62.43±17.07)明显高于两者表达均为阴性者MVD值(40.00±19.34)，提示TGFˉβ 1 与VEGF有共同促进肿瘤血管生成的作用。
参考文献
1 Folkman J，Wastin K，Ingber D，et al.Induction of angiogenesis during thetransiton formhyperplasia to neoplasia.Nature，1989，339(12):58-61.
2 Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new signifiˉcant independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl CancerInst，1992，84(9):1875-1887.
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3 Benjamin LE，Golijanin D，Itin A，et al.Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelialgrowth factor withdrawal.J Clin Invest，1999，10(3):159-165.
4 Roberts A，Sporn M.Transforming growth factorβin molecular and celˉlular biology of wound repair.PAF Clark，Med.New York:Plenum Press，1996，43(15):275-308.
5 Pepper MS，Vassalli JD，Orci L，et al.Biphasic effect of transforming growth factor-beta1on in vitro angiogenesis.Exp Cell Res，1993，20(4):356-363.
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6 Vailhe B，Tranqui L.The role of the transforming growth factor betal(TGF-beta1)and of vascular endothelial growth factor(VEGF)the vitro angiogenesis process.C R Acad SciⅢ，1996，3199(11):1003-1010.
7 Pertovaara L，Kaipainen A，Mustonen T，et al.Vascular endothelial growth factor is induced in response to transforming growth factor beta1in fibroblastic and epithelial cells.J Biol Chen，1994，269(9):6271-6274.
作者单位:1 710082陕西省西安市第五医院内科
2 710061西安交通大学第一医院消化内科
(收稿日期:2003-05-09) (编辑 于少伟), 百拇医药