胆囊癌中bFGF的表达及其与微血管计数的关系
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中华医学研究杂志
【摘要】 目的 研究原发性胆囊癌组织中bFGF的表达及其与微血管计数的关系。方法应用免疫组化SP法对49例胆囊癌组织常规石蜡包埋切片检测MVC和bFGF的表达。结果 49例胆囊癌MVC为(35±12)个/HP。MVC与胆囊癌Nevin分期、淋巴结转移和分化程度密切相关(P<0.01，P<0.01和P<0.05)。49例胆囊癌中bFGF表达的阳性率为53.1%(26/49)。bFGF在Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者中的表达显著低于S4～S5和有淋巴结转移者(P<0.05)。bFGF的表达与肿瘤分化程度无明显相关(P>0.05)。bFGF的表达与MVC值呈显著相关(t=4.04，P<0.01)。结论 bFGF的表达和MVC与原发性胆囊癌的生物学行为密切相关;bFGF是胆囊癌中重要的促血管生成因子。
关键词 胆囊肿瘤 新生血管化 病理性 碱性成纤维细胞生长因子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)09-0781-03
, 百拇医药
The relationship between the expression of basic fibroblast growth
factor(bFGF)and microvessel count(MVC)in gallbladder carcinoma
Tian Yu，Wu Xiaofei，Zhu Lili，et al.
2nd Department of General Surgery，First Affiliated Hospital，
China MedicalUniversity，Shenyang110001.
【Abstract】 Objective To study the relationship between the expression of bFGF and microvessel count in gallbladder carcinoma.Methods The stains of bFGF and MV were completed by the Streptavidin-Peroxidase comˉplex immunohistochemicalmethod in routine paraffin-embedded sections of49cases of gallbladder carcinoma.Reˉsults MVC in49cases with gallbladder cacinoma was(35±12)/HP.The value of MVC was correlated with Nevin staging，lymph node metastasis and tumor differen tiation(P<0.01，P<0.01，P<0.05).The positive rates of bFGF in49cases with gallbladder cacinoma was53.1%(26/49).The expression of bFGFwas significantly lowerin cases of Nevin staging S1～S3and without metastasis than that of Nevin staging S4～S5and with metastasis(P<0.05).The expression of bFGF was not correlatedwith tumor differentiation(P>0.05).The expression of bFGF was markedly correlated with MVC(t=4.04，P<0.01).Conclusion The expressions of bFGF and MVC closely related to the biological behaviors of gallbladder carcinoma;bFGF was one of the most important angiogenic factors.
, 百拇医药
Key words gallbladder neoplasms neovascularization pathologic basic fibroblast growth factor
继Folkman于1971年首次提出“肿瘤生长取决于血管生成”的理论后，针对肿瘤血管生成的研究不断深入，日益成为肿瘤学界研究的热点，肿瘤血管生成是一个十分复杂的过程，是多种促血管生成和抗血管生成因子的调节平衡破坏的结果。恶性肿瘤细胞可自行分泌多种促血管生成因子，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是第一个被发现的参与调节血管生成的促血管生成因子。胆囊癌是胆系恶性肿瘤中恶性度最高的一种，多因发生转移早而预后差。国内外关于胆囊癌bFGF表达与微血管计数(Microvessel count，MVC)的报道不多。本研究探讨原发性胆囊癌组织中bFGF的表达及其与MVC的关系和意义，现报告如下。
1 材料与方法
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1.1 标本及临床病理资料 收集中国医科大学附属第一、第二医院1999年3月～2001年12月间胆囊癌手术切除标本存档蜡块49例。男24例，女25例;男性平均年龄(62.0±9.8)岁，女性平均年龄(54.5±9.3)岁;病理组织学类型均为腺癌;分化程度:高分化16例(32.7%)，中分化17例(34.7%)，低分化10例(20.4%)，另外乳头状腺癌6例，占12.2%;临床分期依据Nevin分期标准 [1] :S1、S2、S319例(38.8%)，S4、S530例(61.2%)。有淋巴结转移者27例(55.1%)，无淋巴结转移者22例(44.9%)。所有病例术前均未经抗肿瘤血管生成治疗。上述胆囊癌蜡块标本常规切片，厚4μm。所有标本均经苏木素-伊红(HE)染色和病理确诊。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 鼠抗人第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体、兔抗人bFGF多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂等均由福州迈新生物技术公司提供。
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1.2.2 免疫组化染色 MV和bFGF染色方法为常规ST法，简述如下:切片常规脱蜡，3%过氧化氢37℃孵育15min，消除内源性过氧化酶的活性，抗原修复:第Ⅷ因子相关抗原采用胃蛋白酶37℃消化15min，非免疫性山羊血清37℃孵育20min，加一抗4℃冰箱过夜，加生物素标记的二抗37℃20min，加链霉素-过氧化物酶溶液37℃20min，DAB显色，苏木素轻度复染，中性树胶封固。
1.2.3 结果判定 由两名病理医师盲法判定。第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体标记的血管内皮细胞浆呈棕黄色至深棕黄色，其计数方法参照Weidner的方法 [2] :在低倍显微镜(×40)下对整张组织切片找出5个血管内皮细胞染色密集区域(热点)，然后每个热点在高倍(×200)视野下(0.74mm 2 )计数，取5个区域的平均数记为MVC值。注意事项:(1)直径大于或等于8个红细胞直径或管壁有平滑肌组织者不作为微血管;(2)有时独立的典型血管内皮细胞着色，但尚未形成管腔，可作为新生微血管计数。bFGF的结果判定:按bFGF染色强弱及阳性细胞百分比两个方面来计算bFGF表达评分:(1)染色强度(0=无，1=弱，2=中，3=强);(2)阳性细胞百分比(0=无，1=<20%，2=20%～40%，3=>40%)，计算(1)+(2)的值即为bFGF评分，4～6分者评定为bFGF免疫组化阳性。以扁桃体阳性切片为第Ⅷ因子相关抗原阳性对照;以食管癌阳性切片为bFGF阳性对照。以0.01M PBS液(pH7.4)替代一抗作为每次染色的阴性对照。
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1.2.4 统计学处理 在SPSS10.0软件上进行。MVC值以ˉx±s表示，采用χ2 检验和t检验。
2 结果
2.1 MV和bFGF在胆囊癌组织中的表达特征 MV在胆囊癌组织中的分布呈异质性，不同区域MVC不同(图1)。bFGF免疫反应阳性物质为棕黄色细颗粒状，主要定位于癌细胞胞浆，其分布也呈异质性(图2)。49例胆囊癌的MVC值为(35±12)个/HP。bFGF表达的阳性率为53.1%(26/49)。(图1、图2略)
2.2 bFGF的表达及MVC与临床病理参数之间的关系 bFGF在Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者中的表达显著低于S4～S5和有淋巴结转移者(P<0.05)。bFGF的表达与病理分化程度无关(P>0.05)。乳头状腺癌、高分化型、Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者的MVC显著低于中低分化型、S4～S5和有淋巴结转移者(P<0.05，P<0.01和P<0.01)。见表1。
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表1 bFGF的表达及MVC与临床病理参数之间的关系 (略)
2.3 bFGF的表达与MVC的关系 26例bFGF表达阳性者 MVC为(40±10)个/HP，23例bFGF表达阴性者MVC为(28±11)个/HP，两者差异有非常显著性(t=4.04，P<0.01)。
3 讨论
肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因。肿瘤侵袭转移是一个复杂的多阶段过程，可以概括为:原发瘤增殖、肿瘤新生血管生长;瘤细胞侵袭基底膜;穿入血管或淋巴管;在循环系统中存活，形成瘤栓并转运到远隔靶器官;滞留于靶器官的微小血管中;穿出血管并形成微小转移灶;肿瘤血管形成，转移癌灶增殖。可见在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，无论肿瘤转移的起始或终末阶段，血管生成均发挥着重要作用。大量研究证实血管生成与肿瘤的浸润深度、病理分期及核分级等呈正相关。本组研究中MVC与胆囊癌Nevin分期、淋巴结转移和分化程度密切相关，提示MVC高的胆囊癌多恶性程度高和易发生转移，进一步证实了上述结论。
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bFGF是血管内皮细胞很强的促分裂剂和趋化因子，其作用包括:(1)诱使蛋白酶、尿激酶血浆素激活物受体(uPˉAR)的表达，调节产生整和素(integrines);(2)诱发血管前改变，如血管样结构的形成、胶原蛋白的产生等，并最终导致新生血管的生成 [3] ;(3)刺激血管内皮细胞生长因子的分泌，并与其有良好的协同作用;(4)增强血管内皮细胞抗凋亡能力 [4] 。近年，国内外学者较广泛地研究了一些恶性肿瘤bFGF的表达与肿瘤生物学行为的关系。用原位杂交实验分析肿瘤组织发现，临床晚期(出现转移症状)肿瘤组织的外围(侵袭的边缘)细胞中bFGF过度表达。相比之下，临床早期的肿瘤组织的bFGF水平较低。本组研究发现bFGF在Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者中的表达显著低于S4～S5和有淋巴结转移者，提示bFGF的表达与原发性胆囊癌生物学行为、转移发生等有密切关系，与国内外的其他研究结果基本一致。本组胆囊癌VEGF、bFGF的表达与MVC值呈显著正相关，证实了bFGF具有明显的促肿瘤血管生成的作用。
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但目前对bFGF的研究还有很多不明之处。bFGF缺少信号肽，因此肿瘤细胞、细胞外基质、巨噬细胞如何在没有信号传递的情况下产生bFGF;bFGF不仅是内皮细胞的分裂原，同时也是成纤维细胞和平滑肌细胞的分裂原，而在肿瘤组织中毛细血管内皮细胞的增殖却远远超过成纤维细胞和平滑肌细胞的增殖，在肿瘤血管形成的过程中bFGF为何对内皮细胞有如此高的选择性等，这些问题都有待于进一步研究。
血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的先决条件，抑制了其生长途径也就遏制住了肿瘤的进一步发展，从而为其它治疗手段提供有利时机。胆囊癌确诊时多为晚期，手术切除率低，预后凶险，诸如针对bFGF等促血管生成因子的抗肿瘤血管生成治疗就显得格外有意义。现在，抗肿瘤血管生成方面的研究已取得了一定进展，使用血管抑制剂治疗肿瘤已在动物试验中取得成功 [5] ，并已进入临床试验。本研究结果不仅提示MVC和bFGF的表达与原发性胆囊癌的生物学行为密切相关，同时为针对促血管生成因子的胆囊癌抗血管新生治疗提供了一个依据。
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参考文献
1 郭仁宣.胆道肿瘤外科学.沈阳:辽宁科学技术出版社，2002，244.
2 Weidner N，Semple JP，Weleh WR，et al.Tumor angiogenesis and metasˉtasis-correlation in invasive breast carcinoma.N Eng1J Med，1991，324(1):1-8.
3 Seandel M，Noack-Kunnmann K，Zhu D，et al.Growth factor-induced angiogenesis in vivo requires specific cleavage of fibrillar type I collaˉgen.Blood，2001，97(8):2323-2332.
4 Kumar R，Yoneda J，Bucana CD，et al.Regulation of distinct steps of anˉ giogenesis by different angiogenic molecules.Int J Oncol，1998，12(4):749-757.
, http://www.100md.com
5 Kim KJ，Li B，Winer J，et al.Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo.Nature，1993，362(6423):841-844.
作者单位:1 110001沈阳中国医科大学附属第一医院普外二科
2 辽宁省盘锦市第一人民医院
3 中国医科大学附属第二医院普外二科
4 中国医科大学病理教研室
(收稿日期:2003-05-22) (编辑 于少伟), http://www.100md.com
关键词 胆囊肿瘤 新生血管化 病理性 碱性成纤维细胞生长因子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)09-0781-03
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The relationship between the expression of basic fibroblast growth
factor(bFGF)and microvessel count(MVC)in gallbladder carcinoma
Tian Yu，Wu Xiaofei，Zhu Lili，et al.
2nd Department of General Surgery，First Affiliated Hospital，
China MedicalUniversity，Shenyang110001.
【Abstract】 Objective To study the relationship between the expression of bFGF and microvessel count in gallbladder carcinoma.Methods The stains of bFGF and MV were completed by the Streptavidin-Peroxidase comˉplex immunohistochemicalmethod in routine paraffin-embedded sections of49cases of gallbladder carcinoma.Reˉsults MVC in49cases with gallbladder cacinoma was(35±12)/HP.The value of MVC was correlated with Nevin staging，lymph node metastasis and tumor differen tiation(P<0.01，P<0.01，P<0.05).The positive rates of bFGF in49cases with gallbladder cacinoma was53.1%(26/49).The expression of bFGFwas significantly lowerin cases of Nevin staging S1～S3and without metastasis than that of Nevin staging S4～S5and with metastasis(P<0.05).The expression of bFGF was not correlatedwith tumor differentiation(P>0.05).The expression of bFGF was markedly correlated with MVC(t=4.04，P<0.01).Conclusion The expressions of bFGF and MVC closely related to the biological behaviors of gallbladder carcinoma;bFGF was one of the most important angiogenic factors.
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Key words gallbladder neoplasms neovascularization pathologic basic fibroblast growth factor
继Folkman于1971年首次提出“肿瘤生长取决于血管生成”的理论后，针对肿瘤血管生成的研究不断深入，日益成为肿瘤学界研究的热点，肿瘤血管生成是一个十分复杂的过程，是多种促血管生成和抗血管生成因子的调节平衡破坏的结果。恶性肿瘤细胞可自行分泌多种促血管生成因子，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是第一个被发现的参与调节血管生成的促血管生成因子。胆囊癌是胆系恶性肿瘤中恶性度最高的一种，多因发生转移早而预后差。国内外关于胆囊癌bFGF表达与微血管计数(Microvessel count，MVC)的报道不多。本研究探讨原发性胆囊癌组织中bFGF的表达及其与MVC的关系和意义，现报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 标本及临床病理资料 收集中国医科大学附属第一、第二医院1999年3月～2001年12月间胆囊癌手术切除标本存档蜡块49例。男24例，女25例;男性平均年龄(62.0±9.8)岁，女性平均年龄(54.5±9.3)岁;病理组织学类型均为腺癌;分化程度:高分化16例(32.7%)，中分化17例(34.7%)，低分化10例(20.4%)，另外乳头状腺癌6例，占12.2%;临床分期依据Nevin分期标准 [1] :S1、S2、S319例(38.8%)，S4、S530例(61.2%)。有淋巴结转移者27例(55.1%)，无淋巴结转移者22例(44.9%)。所有病例术前均未经抗肿瘤血管生成治疗。上述胆囊癌蜡块标本常规切片，厚4μm。所有标本均经苏木素-伊红(HE)染色和病理确诊。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 鼠抗人第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体、兔抗人bFGF多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂等均由福州迈新生物技术公司提供。
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1.2.2 免疫组化染色 MV和bFGF染色方法为常规ST法，简述如下:切片常规脱蜡，3%过氧化氢37℃孵育15min，消除内源性过氧化酶的活性，抗原修复:第Ⅷ因子相关抗原采用胃蛋白酶37℃消化15min，非免疫性山羊血清37℃孵育20min，加一抗4℃冰箱过夜，加生物素标记的二抗37℃20min，加链霉素-过氧化物酶溶液37℃20min，DAB显色，苏木素轻度复染，中性树胶封固。
1.2.3 结果判定 由两名病理医师盲法判定。第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体标记的血管内皮细胞浆呈棕黄色至深棕黄色，其计数方法参照Weidner的方法 [2] :在低倍显微镜(×40)下对整张组织切片找出5个血管内皮细胞染色密集区域(热点)，然后每个热点在高倍(×200)视野下(0.74mm 2 )计数，取5个区域的平均数记为MVC值。注意事项:(1)直径大于或等于8个红细胞直径或管壁有平滑肌组织者不作为微血管;(2)有时独立的典型血管内皮细胞着色，但尚未形成管腔，可作为新生微血管计数。bFGF的结果判定:按bFGF染色强弱及阳性细胞百分比两个方面来计算bFGF表达评分:(1)染色强度(0=无，1=弱，2=中，3=强);(2)阳性细胞百分比(0=无，1=<20%，2=20%～40%，3=>40%)，计算(1)+(2)的值即为bFGF评分，4～6分者评定为bFGF免疫组化阳性。以扁桃体阳性切片为第Ⅷ因子相关抗原阳性对照;以食管癌阳性切片为bFGF阳性对照。以0.01M PBS液(pH7.4)替代一抗作为每次染色的阴性对照。
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1.2.4 统计学处理 在SPSS10.0软件上进行。MVC值以ˉx±s表示，采用χ2 检验和t检验。
2 结果
2.1 MV和bFGF在胆囊癌组织中的表达特征 MV在胆囊癌组织中的分布呈异质性，不同区域MVC不同(图1)。bFGF免疫反应阳性物质为棕黄色细颗粒状，主要定位于癌细胞胞浆，其分布也呈异质性(图2)。49例胆囊癌的MVC值为(35±12)个/HP。bFGF表达的阳性率为53.1%(26/49)。(图1、图2略)
2.2 bFGF的表达及MVC与临床病理参数之间的关系 bFGF在Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者中的表达显著低于S4～S5和有淋巴结转移者(P<0.05)。bFGF的表达与病理分化程度无关(P>0.05)。乳头状腺癌、高分化型、Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者的MVC显著低于中低分化型、S4～S5和有淋巴结转移者(P<0.05，P<0.01和P<0.01)。见表1。
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表1 bFGF的表达及MVC与临床病理参数之间的关系 (略)
2.3 bFGF的表达与MVC的关系 26例bFGF表达阳性者 MVC为(40±10)个/HP，23例bFGF表达阴性者MVC为(28±11)个/HP，两者差异有非常显著性(t=4.04，P<0.01)。
3 讨论
肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因。肿瘤侵袭转移是一个复杂的多阶段过程，可以概括为:原发瘤增殖、肿瘤新生血管生长;瘤细胞侵袭基底膜;穿入血管或淋巴管;在循环系统中存活，形成瘤栓并转运到远隔靶器官;滞留于靶器官的微小血管中;穿出血管并形成微小转移灶;肿瘤血管形成，转移癌灶增殖。可见在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，无论肿瘤转移的起始或终末阶段，血管生成均发挥着重要作用。大量研究证实血管生成与肿瘤的浸润深度、病理分期及核分级等呈正相关。本组研究中MVC与胆囊癌Nevin分期、淋巴结转移和分化程度密切相关，提示MVC高的胆囊癌多恶性程度高和易发生转移，进一步证实了上述结论。
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bFGF是血管内皮细胞很强的促分裂剂和趋化因子，其作用包括:(1)诱使蛋白酶、尿激酶血浆素激活物受体(uPˉAR)的表达，调节产生整和素(integrines);(2)诱发血管前改变，如血管样结构的形成、胶原蛋白的产生等，并最终导致新生血管的生成 [3] ;(3)刺激血管内皮细胞生长因子的分泌，并与其有良好的协同作用;(4)增强血管内皮细胞抗凋亡能力 [4] 。近年，国内外学者较广泛地研究了一些恶性肿瘤bFGF的表达与肿瘤生物学行为的关系。用原位杂交实验分析肿瘤组织发现，临床晚期(出现转移症状)肿瘤组织的外围(侵袭的边缘)细胞中bFGF过度表达。相比之下，临床早期的肿瘤组织的bFGF水平较低。本组研究发现bFGF在Nevin临床分期S1～S3和淋巴结未转移者中的表达显著低于S4～S5和有淋巴结转移者，提示bFGF的表达与原发性胆囊癌生物学行为、转移发生等有密切关系，与国内外的其他研究结果基本一致。本组胆囊癌VEGF、bFGF的表达与MVC值呈显著正相关，证实了bFGF具有明显的促肿瘤血管生成的作用。
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但目前对bFGF的研究还有很多不明之处。bFGF缺少信号肽，因此肿瘤细胞、细胞外基质、巨噬细胞如何在没有信号传递的情况下产生bFGF;bFGF不仅是内皮细胞的分裂原，同时也是成纤维细胞和平滑肌细胞的分裂原，而在肿瘤组织中毛细血管内皮细胞的增殖却远远超过成纤维细胞和平滑肌细胞的增殖，在肿瘤血管形成的过程中bFGF为何对内皮细胞有如此高的选择性等，这些问题都有待于进一步研究。
血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的先决条件，抑制了其生长途径也就遏制住了肿瘤的进一步发展，从而为其它治疗手段提供有利时机。胆囊癌确诊时多为晚期，手术切除率低，预后凶险，诸如针对bFGF等促血管生成因子的抗肿瘤血管生成治疗就显得格外有意义。现在，抗肿瘤血管生成方面的研究已取得了一定进展，使用血管抑制剂治疗肿瘤已在动物试验中取得成功 [5] ，并已进入临床试验。本研究结果不仅提示MVC和bFGF的表达与原发性胆囊癌的生物学行为密切相关，同时为针对促血管生成因子的胆囊癌抗血管新生治疗提供了一个依据。
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参考文献
1 郭仁宣.胆道肿瘤外科学.沈阳:辽宁科学技术出版社，2002，244.
2 Weidner N，Semple JP，Weleh WR，et al.Tumor angiogenesis and metasˉtasis-correlation in invasive breast carcinoma.N Eng1J Med，1991，324(1):1-8.
3 Seandel M，Noack-Kunnmann K，Zhu D，et al.Growth factor-induced angiogenesis in vivo requires specific cleavage of fibrillar type I collaˉgen.Blood，2001，97(8):2323-2332.
4 Kumar R，Yoneda J，Bucana CD，et al.Regulation of distinct steps of anˉ giogenesis by different angiogenic molecules.Int J Oncol，1998，12(4):749-757.
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5 Kim KJ，Li B，Winer J，et al.Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo.Nature，1993，362(6423):841-844.
作者单位:1 110001沈阳中国医科大学附属第一医院普外二科
2 辽宁省盘锦市第一人民医院
3 中国医科大学附属第二医院普外二科
4 中国医科大学病理教研室
(收稿日期:2003-05-22) (编辑 于少伟), http://www.100md.com