人心肌组织中诱导型血红素氧合酶表达的检测及其意义
【摘要】 目的 研究先天性心脏病心肌组织中血红素氧合酶表达的检测及其变化的规律。方法 先天性心脏病手术病例共9例，均于术中取其右心室心肌标本，冰冻切片或石蜡包埋后，进行常规组织学检查，采用血红素氧合酶-1单克隆抗体进行免疫组化检查。结果 所有病例心肌胞浆及胞膜均有不同程度的HO-1表达，HO-1表达主要见于细胞浆。结论 人心肌细胞血红素氧合酶-1的表达可通过免疫组化的方法检测，在紫绀型先心病例，心肌组织表达较强，其意义有待进一步的研究。
关键词 血红素氧合酶 心肌 先天性心脏病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)10-0877-02
Detection of the expression of induced heme oxygenase in human
myocardiac tissue and its clinical significance
, 百拇医药
Jiang Hongjun，Jia Bing，Chen Zhanggen，et al.
Dept of Surgery of Cardiovascular Center of Pedeatric Hospital Affiliated to
Fu-Dan University，Shanghai200023.
【Abstract】 Objective This study was aimed to investigate heme oxyginase-1 expression in human heart tisˉsues from congenital heart defect cases and its possible pathophysiologic roles.Methods Right ventricular heart tisˉsues were took out from nine cases with tetralogy of Fallot during operation.Routine histolog
, 百拇医药
ic examination were carried out and heme oxyginame-1expression was detected by immunohistochemistry using monoclone antibody.Results Strong heme oxyginae-1expressions were detected in all cyanotic congenital heart defect cases and they were mainly found in cytoplasm.Conclusion The exact role of heme oxyginase in congen
ital heart defect cases need a further study.
Key words heme oxyginase myocardium congenital heart defect
, 百拇医药
血红素氧合酶(HO)同功酶有结构型和诱导型二类。其中诱导型血红素氧合酶(HO-1)正常在血管内皮细胞和平滑肌细胞有低的表达，可在重金属、低氧、氧化应激、炎症调节因子、氧化型低密度脂蛋白以及血流动力学影响下表达水平发生改变[1] 。目前的研究表明血红素氧合酶是一种应激蛋白，具有细胞保护作用的酶，其生理作用是降解血红素，产生CO、胆红素和铁。其中CO能增加细胞内环磷酸鸟苷水平，调节血管张力和平滑肌运动，是新近发现的扩张血管的气体分子，并有抗炎作用。为研究先天性心脏病心肌组织中HO的表达及意义，我们对2002年1月～2003年1月部分手术中心肌组织标本进行了研究，现报告如下。
1 资料和方法
1.1 临床资料 先心手术病例共9例，其中男5例，女4例，平均年龄4.86±1.46岁(3～7岁)，诊断均为法乐氏四联征。于术中取其增生的心肌标本，立即置于10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片;或置于液氮中冻存，进行冰冻切片检查。
, 百拇医药
1.2 试剂盒 血红素氧合酶-1单克隆抗体(鼠抗人)购自B&D Co。二抗(山羊抗人)试剂盒购自Lab Vision。
1.3 主要步骤 HO-1的检测:切片置于二甲苯中，常规脱蜡。经梯度酒精浸水，再次水化，采用微波炉修复抗原。 将切片置于Hydrogen peroxide block，10min，扑灭内源性过氧化酶。缓冲液中洗涤2次，将切片置于Apply Ultra V Block中，在室温下孵育7min，以消除非特异性背景染色，加一抗(1:50稀释)，室温孵育1.5h后，弃去一抗，在缓冲液中充分洗涤。加入Bioctinylated Goat Anti-Mouse室温孵育10min，在缓冲液中充分洗涤。加入Streptavidin Peroxidase，孵育10min，充分洗涤后，加DAB显色剂，显色3min。洗涤后，常规透明封片。光镜下观察，拍片保存。
心肌组织进行常规组织学检查，HE染色，光镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
心肌组织学检查发现心室心肌组织轻度混浊肿胀，血红素氧合酶-1在心肌组织中有较强的表达，其表达的部位以胞浆为主，在心肌细胞膜上也有一定的表达。见图1，HO-1的表达在胞浆中比较弥散，在胞膜上的表达略呈线条型。
3 讨论
心肌缺血缺氧是先天性心脏病常见的病理生理过程。先天性心脏病根据其解剖畸形和病理生理特点分为紫绀型及非紫绀型。紫绀型先心病患儿全身组织(包括心肌)缺氧，围术期由于体外循环、主动脉阻断等影响因素，心肌缺血、缺氧损害更为严重。血红素氧合酶是一种热休克蛋白，又称HSP32，其在心肌缺血缺氧过程中的作用日益受到研究者的重视。
HO-1为诱导型血红素氧合酶。Yet SF [2] 研究了低氧(10%)对HO-1丢失裸鼠(HO-1(-/-))心肌的影响，发现裸鼠和野生型鼠压力增加相似，而裸鼠右心室重量增加较野生型多。证实了HO-1对心肌细胞的损伤具有保护 作用，HO-1表达缺失小鼠心肌细胞对缺氧的调节反应降低，进而发生肺动脉高压。
, 百拇医药
图1 心肌组织中HO-1的表达(略)
2000年Hangaishi M [3] 等通过鼠缺血再灌注损伤模型发现，HO-1蛋白的表达最早在再灌注后24h增加，单核/巨噬细胞及肌纤维细胞内均有较强的表达。我们的实验表明，血红素氧合酶在紫绀型先心病患儿心肌组织中也有较强的表达，以胞浆为主。这与相关的文献报道一致 [4] 。HO-1在先心病常见的病理过程，如心肌缺血，缺氧及肺动脉高压等中的意义目前尚不清楚，有待进一步阐明。
血红素氧合酶检测过程中，一抗的稀释度比较关键，预实验中，我们根据试剂盒的说明，采用1:250，结果发现组织无任何染色。经反复实验，结果发现1:50的稀释度的结果较为满意。由于采用的心肌组织均为新鲜组织，抗原一般保存较好，为减少在固定包埋过程中抗原的丢失，保证有足够的抗原供检测，我们对石蜡包埋的切片均进行微波抗原修复处理。新鲜组织中内源性的过氧化氢酶的活性很高，因而，特别是对于冰冻切片，妥善扑灭内源性过氧化氢酶的活性对消除非特异性染色至为重要。与大多数切片相比， 其灭活内源性过氧化氢酶的时间要略长。采用免疫组织化学的方法检测心肌细胞中血红素氧合酶是切实可行的。
, 百拇医药
参考文献
1 Siow RC，Sato H，Mann GE.Heme oxygenase-carbon monoxide sigˉnalling pathway in atherosclerosis:anti-atherogenic actions of bilirubin and carbon monoxide?Cardiovas Res，1999，44(2):385-394.
2 Yet SF，Perrella MA，Layne MD，Hsieh CM，Maemura K，Kobzik L，Wiesel P，Christou H，Kourembanas S，Lee ME.Hypoxia induces severe right ventricular dialtation and infarction in heme oxygenase-1null mice.J-Clin-Invest，1999，103(8):23-29.
, 百拇医药
3 Hangaishi M，Ishizaka N，Aizawa T，Kurihara Y，Taguchi J，Nagai R，Kimura S，OhnoM.Induction of heme oxygenase-1can act protectively against cardiac ischemia/reperfusion in vivo.Biochem Biophys Res Commun，2000，279(2):582-588.
4 温进坤，韩梅.医学分子生物学理论与研究技术，北京:科学出版社，2002，.
作者单位:1 200023上海复旦大学附属儿科医院心血管中心外科
2 上海复旦大学附属中山医院心研所
(编辑 晓亮), 百拇医药(蒋红军)
关键词 血红素氧合酶 心肌 先天性心脏病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)10-0877-02
Detection of the expression of induced heme oxygenase in human
myocardiac tissue and its clinical significance
, 百拇医药
Jiang Hongjun，Jia Bing，Chen Zhanggen，et al.
Dept of Surgery of Cardiovascular Center of Pedeatric Hospital Affiliated to
Fu-Dan University，Shanghai200023.
【Abstract】 Objective This study was aimed to investigate heme oxyginase-1 expression in human heart tisˉsues from congenital heart defect cases and its possible pathophysiologic roles.Methods Right ventricular heart tisˉsues were took out from nine cases with tetralogy of Fallot during operation.Routine histolog
, 百拇医药
ic examination were carried out and heme oxyginame-1expression was detected by immunohistochemistry using monoclone antibody.Results Strong heme oxyginae-1expressions were detected in all cyanotic congenital heart defect cases and they were mainly found in cytoplasm.Conclusion The exact role of heme oxyginase in congen
ital heart defect cases need a further study.
Key words heme oxyginase myocardium congenital heart defect
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血红素氧合酶(HO)同功酶有结构型和诱导型二类。其中诱导型血红素氧合酶(HO-1)正常在血管内皮细胞和平滑肌细胞有低的表达，可在重金属、低氧、氧化应激、炎症调节因子、氧化型低密度脂蛋白以及血流动力学影响下表达水平发生改变[1] 。目前的研究表明血红素氧合酶是一种应激蛋白，具有细胞保护作用的酶，其生理作用是降解血红素，产生CO、胆红素和铁。其中CO能增加细胞内环磷酸鸟苷水平，调节血管张力和平滑肌运动，是新近发现的扩张血管的气体分子，并有抗炎作用。为研究先天性心脏病心肌组织中HO的表达及意义，我们对2002年1月～2003年1月部分手术中心肌组织标本进行了研究，现报告如下。
1 资料和方法
1.1 临床资料 先心手术病例共9例，其中男5例，女4例，平均年龄4.86±1.46岁(3～7岁)，诊断均为法乐氏四联征。于术中取其增生的心肌标本，立即置于10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片;或置于液氮中冻存，进行冰冻切片检查。
, 百拇医药
1.2 试剂盒 血红素氧合酶-1单克隆抗体(鼠抗人)购自B&D Co。二抗(山羊抗人)试剂盒购自Lab Vision。
1.3 主要步骤 HO-1的检测:切片置于二甲苯中，常规脱蜡。经梯度酒精浸水，再次水化，采用微波炉修复抗原。 将切片置于Hydrogen peroxide block，10min，扑灭内源性过氧化酶。缓冲液中洗涤2次，将切片置于Apply Ultra V Block中，在室温下孵育7min，以消除非特异性背景染色，加一抗(1:50稀释)，室温孵育1.5h后，弃去一抗，在缓冲液中充分洗涤。加入Bioctinylated Goat Anti-Mouse室温孵育10min，在缓冲液中充分洗涤。加入Streptavidin Peroxidase，孵育10min，充分洗涤后，加DAB显色剂，显色3min。洗涤后，常规透明封片。光镜下观察，拍片保存。
心肌组织进行常规组织学检查，HE染色，光镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
心肌组织学检查发现心室心肌组织轻度混浊肿胀，血红素氧合酶-1在心肌组织中有较强的表达，其表达的部位以胞浆为主，在心肌细胞膜上也有一定的表达。见图1，HO-1的表达在胞浆中比较弥散，在胞膜上的表达略呈线条型。
3 讨论
心肌缺血缺氧是先天性心脏病常见的病理生理过程。先天性心脏病根据其解剖畸形和病理生理特点分为紫绀型及非紫绀型。紫绀型先心病患儿全身组织(包括心肌)缺氧，围术期由于体外循环、主动脉阻断等影响因素，心肌缺血、缺氧损害更为严重。血红素氧合酶是一种热休克蛋白，又称HSP32，其在心肌缺血缺氧过程中的作用日益受到研究者的重视。
HO-1为诱导型血红素氧合酶。Yet SF [2] 研究了低氧(10%)对HO-1丢失裸鼠(HO-1(-/-))心肌的影响，发现裸鼠和野生型鼠压力增加相似，而裸鼠右心室重量增加较野生型多。证实了HO-1对心肌细胞的损伤具有保护 作用，HO-1表达缺失小鼠心肌细胞对缺氧的调节反应降低，进而发生肺动脉高压。
, 百拇医药
图1 心肌组织中HO-1的表达(略)
2000年Hangaishi M [3] 等通过鼠缺血再灌注损伤模型发现，HO-1蛋白的表达最早在再灌注后24h增加，单核/巨噬细胞及肌纤维细胞内均有较强的表达。我们的实验表明，血红素氧合酶在紫绀型先心病患儿心肌组织中也有较强的表达，以胞浆为主。这与相关的文献报道一致 [4] 。HO-1在先心病常见的病理过程，如心肌缺血，缺氧及肺动脉高压等中的意义目前尚不清楚，有待进一步阐明。
血红素氧合酶检测过程中，一抗的稀释度比较关键，预实验中，我们根据试剂盒的说明，采用1:250，结果发现组织无任何染色。经反复实验，结果发现1:50的稀释度的结果较为满意。由于采用的心肌组织均为新鲜组织，抗原一般保存较好，为减少在固定包埋过程中抗原的丢失，保证有足够的抗原供检测，我们对石蜡包埋的切片均进行微波抗原修复处理。新鲜组织中内源性的过氧化氢酶的活性很高，因而，特别是对于冰冻切片，妥善扑灭内源性过氧化氢酶的活性对消除非特异性染色至为重要。与大多数切片相比， 其灭活内源性过氧化氢酶的时间要略长。采用免疫组织化学的方法检测心肌细胞中血红素氧合酶是切实可行的。
, 百拇医药
参考文献
1 Siow RC，Sato H，Mann GE.Heme oxygenase-carbon monoxide sigˉnalling pathway in atherosclerosis:anti-atherogenic actions of bilirubin and carbon monoxide?Cardiovas Res，1999，44(2):385-394.
2 Yet SF，Perrella MA，Layne MD，Hsieh CM，Maemura K，Kobzik L，Wiesel P，Christou H，Kourembanas S，Lee ME.Hypoxia induces severe right ventricular dialtation and infarction in heme oxygenase-1null mice.J-Clin-Invest，1999，103(8):23-29.
, 百拇医药
3 Hangaishi M，Ishizaka N，Aizawa T，Kurihara Y，Taguchi J，Nagai R，Kimura S，OhnoM.Induction of heme oxygenase-1can act protectively against cardiac ischemia/reperfusion in vivo.Biochem Biophys Res Commun，2000，279(2):582-588.
4 温进坤，韩梅.医学分子生物学理论与研究技术，北京:科学出版社，2002，.
作者单位:1 200023上海复旦大学附属儿科医院心血管中心外科
2 上海复旦大学附属中山医院心研所
(编辑 晓亮), 百拇医药(蒋红军)