川芎嗪对大鼠胰腺腺泡细胞内游离钙离子浓度的影响及其机制研究
【摘要】 目的 对缺氧再复氧引起胰腺腺泡细胞损伤的机制及川芎嗪的保护作用的研究。方法 对离体胰腺腺泡细胞给予缺氧再复氧处理，观察不同阶段胰腺腺泡细胞的存活率，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的变化。同时应用显微荧光分光光度计和图像分析系统检测被荧光标记物标记的细胞内游离钙离子[Ca 2+ ]i浓度的变化。结果 对照组4h细胞存活率为77.85%，缺氧组4h细胞存活率54.28%(P<0.05)，缺氧3h再复氧1h细胞存活率为35.46%(P<0.01)，缺氧3h再复氧1h，细胞内([Ca 2+ ]i)较对照组明显升高(P<0.01)。缺氧再复氧组MDA含量较对照组明显增多(P<0.01)，且高于缺氧组(P<0.05)。用药组细胞存活率比非用药组明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)，细胞内[Ca 2+ ]i含量明显减少(P<0.05)。结论 缺氧再复氧可引起大鼠胰腺腺泡细胞明显损伤，比单纯缺氧更为严重。脂质过氧化反应的增加和细胞内[Ca 2+ ]i超载是胰腺腺泡细胞损伤和死亡的重要原因。川芎嗪可以减少腺泡细胞脂质过氧化反应并减少细胞内[Ca 2+ ]i超载。
, 百拇医药
关键词 胰腺腺泡细胞 缺氧 再复氧 细胞内游离钙离子([Ca 2+ ]i) 川芎嗪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0655-03
The effect of administered ligustrazine for the intracellular
free calcium([Ca 2+ ]i)concentration in pancreatic acinar cell
Xu Mingbao，Huang Yanping，Sheng Zisong，et al.
Department of Gastroenterology，Armed Police Forces General Hospital，Beijing100039.
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective The present studywas aimed to investigate the mechanism of isolated pancreatic acinar cell injury during hypoxiareoxygenation and effect ligustrazine in rats.Methods The intracellular free calcium([Ca 2+ ] i)concentration in pancreatic acinar cell were measured by OPTON30-UMP fluorescence microspectrophoto-meter.[Ca 2+ ]i of marked fluorescent indicator-Fura-2AM were analyzed by digital image processing system.Lipid peroxidized product Malondialdeyhde(MDA)and pancreatic acinar cell mortality were examined.Results With extended hypoxia time，the pancreatic acinar intracellular [Ca 2+ ]i rose gradually.At reoxygenation one hour after hypoxia three hours，intracellular [Ca 2+]i increased significantly(P<0.01).MDA content was similar to[Ca 2+ ]i change.Survival rates of normal，hypoxia four hours and reoxygenation one hour after hypoxia three hours groups approximate to77.85%，54.28%and35.46%respectively.In administered ligustrazine groups，[Ca 2+ ]i and MDA were lower significantly than in reoxygenation groups.Survival rates of administered ligustrazine groups was higher than that(P<0.05).Conclusion Hypoxia-reoxygenation might have caused obviously injury of isolated pancreatic acinar cell.Both lipid peroxidizedreaction and intracellular calcium overload were main mechanism of hypoxia-reoxygenation injury.Ligustrazine may prevent these injury from decreasing lipid preoxidized reaction and[Ca 2+ ]i overload.
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Key words pancreatic acinar cell hypoxia-reoxygenation intracellular free calcium[Ca 2+ ]i ligustrazine
众多研究证实组织在缺氧状态下产生大量自由基可引起细胞膜结构的脂质过氧化反应。另外，在缺氧状态下钙离子大量涌入细胞内，导致或(和)加重细胞损伤。我们对大鼠离体胰腺腺泡细胞给予缺氧再复氧处理，旨在探讨缺氧再复氧对胰腺细胞的损伤机制及川芎嗪对其的保护作用。
1 材料与方法
1.1 细胞分离 参照Peikin方法 [1] 。SD大鼠(购于解放军301医院动物室)，体重200～250g。断颈处死，取出胰腺，置于Hank’s液中[mM，NaCl137，KCl5.4，MgSO 4 ·7H2 O6.75，Na 2 HPO 4 ·12H 2 O3.35，KH 2 PO 4 4.41，Glucose5，CaCl 2 1.3]清洗。将胰腺组织剪成碎块(1～2mm)并置入三角烧瓶中，加入15～20ml0.1%胶原酶溶液，放在磁力搅拌器上以100转/min37℃消化30min。然后，另加入15～20ml含10%～20%小牛血清的Eagle培养液，中止消化。离心5～10min，1000rpm离心，弃上清液，重复离心一次，最后加入含小牛血清Eagle培养液，制成细胞悬液，以备计数及实验用。
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1.2 细胞存活率测定 取已制备好的细胞悬液0.9ml，0.4%台盼兰液0.1ml混均，弃去第一滴，在血球计数盘上数100个细胞，计算活细胞的百分数，活细胞不被染色，呈圆形无色透明，死亡细胞被染成深兰色。
1.3 缺氧再复氧细胞的制备 (1)缺氧组，将孵育离体胰腺细胞的培养瓶打开。同时向瓶内充氮气30s，以置换出瓶内空气，37℃恒温孵育3h后备用;(2)再复氧组，将上述孵育2h培养瓶取出，充95%氧气，5%二氧化碳混合气体30s，置换出原瓶中氮气，37℃恒温放置备用;(3)给药组，在上述缺氧再复氧同时加入50μmol/L川芎嗪20μl。
1.4 Fura-2AM负载 将细胞悬液在室温下静置1h，用Hank’s液冲洗2～3次，然后加入20μmol/L Fura-2AM溶液2ml(中科院上海生理所)。孵育30min后用Hank’s液冲洗。原理:Fura-2是一极性较强的酸性化合物，因细胞膜上的磷酸基团也是负电荷，故Fura-2不易进入细胞。Fura-2AM是在Fura-2上连接乙酰氟甲酯基，增加其脂溶性。Fura-2AM进入细胞后在胞浆中的酯酶作用下酯性基团被水解，还原为Fura-2。Fura-2不易透出细胞膜，所以留在细胞内与胞浆中的游离[Ca 2+ ]i结合，在一定波长的紫外光激发下产生荧光。
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1.5 细胞内[Ca 2+ ]i测定 [2] 将负载Fura-2AM的细胞室温下静置20min，用UMP-30显微荧光分光光度计测定(德国OPTON公司)。激发光源为高压汞灯，经滤波形成340nm及380nm波长紫外光。在紫外光激发下，细胞内与Fura-2结合的[Ca 2+ ]i产生荧光，将所产生荧光输入VIDAS计算机图像分析系统处理(德国OPTON公司)，以伪彩色显示细胞内[Ca2+ ]i分布情况，计算方法是以各成像的灰度值加权平均表示:
计算公式:[Ca 2+ ]i=kd·R-Rmin/Rmax-R ·Ff 2 Fb 2 (nmol/L)
其中，R为负载Fura-2细胞内340nm/380nm荧光强度比值，Rmax为最大340nm/380nm荧光强度比值，Rmin为最小340nm/380nm荧光强度比值，Ff 2 为无[Ca 2+ ]i时380nm激发的荧光强度，Fb 2 为[Ca 2+ ]i饱和时380nm激发的荧光强度，kb为Fura-2与[Ca 2+ ]i结合反应的解离常数，37℃时其值为224nm。
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测定过程:首先测定各组负载Fura-2AM细胞荧光强度R，然后加入0.2%Triton X-1000.1ml破坏细胞膜，使细胞内Fura-2被[Ca 2+ ]i饱和，测出Rmax，接着加入3nM EGTA0.1ml络合全部[Ca 2+ ]i使Fura-2游离，测出Rmin，Ff 2 取加入EGTA时380nm波长激发的荧光强度，Fb 2 取加入TritonX-100时380nm波长激发的荧光强度。
1.6 丙二醛(MDA)测定 采用硫代巴比妥酸荧光法(nmol/10 5 cell)。
1.7 统计学处理 细胞存活率用χ 2 检验，细胞内[Ca 2+ ]i含量浓度变化用t检验，细胞内MDA变化用t检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 缺氧再复氧时腺泡细胞存活率变化 对照组4h细胞存活率为77.85%，缺氧组4h存活率为54.28%，比对照组下降(P<0.05)。缺氧2h后再复氧1h细胞存活率为35.46%。明显低于对照组(P<0.01)。用药组4h细胞存活率为52.84%，明显高于再复氧组(P<0.05)，与缺氧组相比无明显差异(P>0.05)。
2.2 缺氧再复氧时腺泡细胞内[Ca 2+ ]i变化 缺氧组[Ca 2+ ]i含量高于对照组(P<0.05)，缺氧2h后再复氧2h细胞内[Ca 2+ ]i升高最为明显(P<0.01)且高于缺氧组(P<0.05)，用药组4h细胞内[Ca 2+ ]i浓度与对照组相比无明显差异(P>0.05)，见表1。
表1 缺氧再复氧时胰腺腺泡细胞内[Ca 2+ ]i含量变化(略)
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2.3 缺氧再复氧时腺泡细胞内MDA变化 缺氧4h细胞内MDA含量较对照组明显升高(P<0.01)，缺氧2h再复氧2h细胞内MDA含量比对照组明显升高(P<0.001)且高于缺氧组(P<0.01)，用药组MDA含量与对照组相比无明显增加(P>0.05)，见表2。
表2 缺氧再复氧时胰腺腺泡细胞MDA含量变化(略)
3 讨论
胰腺组织有丰富的血液供应，因此对缺氧状态较为敏感，研究表明，胰腺血液循环障碍在急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)发生发展中起重要作用，其可能的机制之一是缺氧造成组织自由基的大量增加，导致了脂质过氧化反应 [3，4] 。本实验结果显示，缺氧组胰腺腺泡细胞的MDA含量增高(P<0.01)，细胞存活率降低为54.28%(P<0.05)。这说明在缺氧状态下，胰腺腺泡细胞自由基生成增加，脂质过氧化反应加强，造成了腺泡细胞损伤和死亡。再复氧时MDA含量进一步升高，而细胞存活率继续下降，这表明再复氧时自由基生成进一步增加，腺泡细胞损伤明显加重。有人用缺氧再复氧方法观察了大鼠心肌细胞及肝细胞脂质过氧化反应及自由基清除剂对其的保护作用，发现缺氧时脂质过氧化产物MDA随缺氧时间的延长而增加。细胞存活率随缺氧时间的延长而减少，再给氧时这种损伤短期内明显加重 [5，6] 。因此，我们认为自由基大量产生引起的脂质过氧化反应增强是胰腺腺泡细胞受损和死亡的重要原因。
, 百拇医药
近年来，有关细胞内[Ca 2+ ]i超载与细胞损伤的关系，受到愈来愈多的关注。通过动态观察胰腺细胞中[Ca 2+ ]i含量的变化，发现在AP时胰腺组织中[Ca 2+ ]i异常增多，磷脂酶A 2 活性增加 [7，8] 。本实验结果显示，缺氧时腺泡细胞内[Ca 2+ ]i含量增加(P<0.05)，而再复氧时细胞内[Ca 2+ ]i增加最为明显(P<0.01)。且腺泡细胞存活率为35.46%(P<0.01)，脂质过氧化产物MDA明显增加(P<0.01)。这一结果提示，[Ca 2+ ]i在细胞内的大量积聚是被缺氧状态所诱发，随着脂质过氧化引起的细胞膜损伤而进一步加剧，并引起腺泡细胞的大量死亡。这一变化在再复氧时被进一步加重。[Ca 2+ ]i超载导致腺泡细胞损伤可能与[Ca 2+ ]i依赖性磷脂酶A 2 的激活有关，磷脂酶A 2 通过降解膜结构中的磷脂生成具有细胞毒作用的溶血卵磷脂，加重细胞损伤。另外，[Ca 2+ ]i超载可以激活某些线粒体膜上的脂酶使线粒体膜受损，氧化磷酸化过程受阻，钙泵失活，钙离子不能泵出，线粒体内[Ca 2+ ]i进一步积聚，加重线粒体损伤。同时[Ca 2+ ]i超载引起[Ca 2+ ]i依赖性蛋白水解酶活性增高，可促进黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，后者导致大量超氧阴离子自由基(O 2 ·- )和其它自由基的生成，直接损伤腺泡细胞或加重膜结构的脂质过氧化反应，导致腺泡细胞死亡 [9，10] ，我们的实验结果显示，川芎嗪可以明显减少缺氧再复氧胰腺腺泡细胞内[Ca 2+ ]i增加(P<0.05)，明显提高细胞存活率，减少细胞内脂质过氧化产物MDA含量(P<0.05)。川芎嗪对胰腺细胞的保护作用可能与阻止Ca 2+ 进入细胞内，从而抑制黄嘌呤氧化酶生成，减少了自由基生成或(和)抑制了依赖Ca 2+ 的磷脂酶激活，阻止了花生四烯酸的异常代谢，稳定了细胞膜结构有关。另外，川芎嗪可进入细胞内，调节线粒体中Ca 2+ 的再分布，使ATP合成增加，钙泵活性增强，线粒体损伤减轻。
, 百拇医药
参考文献
1 潘国宗.离体胰腺腺泡的制备方法及其应用.生理科学进展， 1984，15:18.
2 张川里，吴本阶.钙荧光探剂的研究及其在生命科学中的应用.生理科学进展，1996，27:37.
3 klar E，Messmer K，Warshaw AL，et al.Pancreatic ischemia in experimental acute pancreatitis:mechanism，significance and therapy.Br J Surg，1990，77(11):1205.
4 Marco S，Peter H，Gerold L.Development of acute pancreatitis in rat after single ethanol administration and induction of a pancreatic juice edema.Int J Pancreatol，1991，8(2):169.
, 百拇医药
5 Dhalla AK，SingalPK.Antioxidant changes in hyperterophied and failing gninea pig hearts.Am J Physiol，1994，266(4):1280-1285.
6 Helset E，Kjaeve J，BjertnaesL，et al.ET-1release and clecrease release of calctonin gene-relaled peptide in isolated perfused rat liver.Scand J Clin lab Invest，1995，50(5):369-376.
7 Rattner DW，Napolitano LM，Corsetti J，et al.Hypocalcemia in experimental pancreatitis occurs independently of changes in serum nonesterified fatty acid levels.Int J Pancreatol，1990，6(4):249.
, 百拇医药
8 Farber JL.The role of calcium ions toxic cell injury.Envirom Health Perspect，1999，84(1):107.
9 雷志永，徐铭宝，黄燕苹，等.川芎嗪对大鼠胰腺缺血再灌注损伤保护作用的实验研究.中国中西医结合杂志，2000，20:44.
10 孙经建，吴孟超，陈汉，等.川芎嗪对缺血再灌注肝钙含量和线粒体功能的影响.解放军医学杂志，1998，23(2):133.
作者单位:100039北京武警总医院
(编辑 元红), 百拇医药
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关键词 胰腺腺泡细胞 缺氧 再复氧 细胞内游离钙离子([Ca 2+ ]i) 川芎嗪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0655-03
The effect of administered ligustrazine for the intracellular
free calcium([Ca 2+ ]i)concentration in pancreatic acinar cell
Xu Mingbao，Huang Yanping，Sheng Zisong，et al.
Department of Gastroenterology，Armed Police Forces General Hospital，Beijing100039.
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective The present studywas aimed to investigate the mechanism of isolated pancreatic acinar cell injury during hypoxiareoxygenation and effect ligustrazine in rats.Methods The intracellular free calcium([Ca 2+ ] i)concentration in pancreatic acinar cell were measured by OPTON30-UMP fluorescence microspectrophoto-meter.[Ca 2+ ]i of marked fluorescent indicator-Fura-2AM were analyzed by digital image processing system.Lipid peroxidized product Malondialdeyhde(MDA)and pancreatic acinar cell mortality were examined.Results With extended hypoxia time，the pancreatic acinar intracellular [Ca 2+ ]i rose gradually.At reoxygenation one hour after hypoxia three hours，intracellular [Ca 2+]i increased significantly(P<0.01).MDA content was similar to[Ca 2+ ]i change.Survival rates of normal，hypoxia four hours and reoxygenation one hour after hypoxia three hours groups approximate to77.85%，54.28%and35.46%respectively.In administered ligustrazine groups，[Ca 2+ ]i and MDA were lower significantly than in reoxygenation groups.Survival rates of administered ligustrazine groups was higher than that(P<0.05).Conclusion Hypoxia-reoxygenation might have caused obviously injury of isolated pancreatic acinar cell.Both lipid peroxidizedreaction and intracellular calcium overload were main mechanism of hypoxia-reoxygenation injury.Ligustrazine may prevent these injury from decreasing lipid preoxidized reaction and[Ca 2+ ]i overload.
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Key words pancreatic acinar cell hypoxia-reoxygenation intracellular free calcium[Ca 2+ ]i ligustrazine
众多研究证实组织在缺氧状态下产生大量自由基可引起细胞膜结构的脂质过氧化反应。另外，在缺氧状态下钙离子大量涌入细胞内，导致或(和)加重细胞损伤。我们对大鼠离体胰腺腺泡细胞给予缺氧再复氧处理，旨在探讨缺氧再复氧对胰腺细胞的损伤机制及川芎嗪对其的保护作用。
1 材料与方法
1.1 细胞分离 参照Peikin方法 [1] 。SD大鼠(购于解放军301医院动物室)，体重200～250g。断颈处死，取出胰腺，置于Hank’s液中[mM，NaCl137，KCl5.4，MgSO 4 ·7H2 O6.75，Na 2 HPO 4 ·12H 2 O3.35，KH 2 PO 4 4.41，Glucose5，CaCl 2 1.3]清洗。将胰腺组织剪成碎块(1～2mm)并置入三角烧瓶中，加入15～20ml0.1%胶原酶溶液，放在磁力搅拌器上以100转/min37℃消化30min。然后，另加入15～20ml含10%～20%小牛血清的Eagle培养液，中止消化。离心5～10min，1000rpm离心，弃上清液，重复离心一次，最后加入含小牛血清Eagle培养液，制成细胞悬液，以备计数及实验用。
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1.2 细胞存活率测定 取已制备好的细胞悬液0.9ml，0.4%台盼兰液0.1ml混均，弃去第一滴，在血球计数盘上数100个细胞，计算活细胞的百分数，活细胞不被染色，呈圆形无色透明，死亡细胞被染成深兰色。
1.3 缺氧再复氧细胞的制备 (1)缺氧组，将孵育离体胰腺细胞的培养瓶打开。同时向瓶内充氮气30s，以置换出瓶内空气，37℃恒温孵育3h后备用;(2)再复氧组，将上述孵育2h培养瓶取出，充95%氧气，5%二氧化碳混合气体30s，置换出原瓶中氮气，37℃恒温放置备用;(3)给药组，在上述缺氧再复氧同时加入50μmol/L川芎嗪20μl。
1.4 Fura-2AM负载 将细胞悬液在室温下静置1h，用Hank’s液冲洗2～3次，然后加入20μmol/L Fura-2AM溶液2ml(中科院上海生理所)。孵育30min后用Hank’s液冲洗。原理:Fura-2是一极性较强的酸性化合物，因细胞膜上的磷酸基团也是负电荷，故Fura-2不易进入细胞。Fura-2AM是在Fura-2上连接乙酰氟甲酯基，增加其脂溶性。Fura-2AM进入细胞后在胞浆中的酯酶作用下酯性基团被水解，还原为Fura-2。Fura-2不易透出细胞膜，所以留在细胞内与胞浆中的游离[Ca 2+ ]i结合，在一定波长的紫外光激发下产生荧光。
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1.5 细胞内[Ca 2+ ]i测定 [2] 将负载Fura-2AM的细胞室温下静置20min，用UMP-30显微荧光分光光度计测定(德国OPTON公司)。激发光源为高压汞灯，经滤波形成340nm及380nm波长紫外光。在紫外光激发下，细胞内与Fura-2结合的[Ca 2+ ]i产生荧光，将所产生荧光输入VIDAS计算机图像分析系统处理(德国OPTON公司)，以伪彩色显示细胞内[Ca2+ ]i分布情况，计算方法是以各成像的灰度值加权平均表示:
计算公式:[Ca 2+ ]i=kd·R-Rmin/Rmax-R ·Ff 2 Fb 2 (nmol/L)
其中，R为负载Fura-2细胞内340nm/380nm荧光强度比值，Rmax为最大340nm/380nm荧光强度比值，Rmin为最小340nm/380nm荧光强度比值，Ff 2 为无[Ca 2+ ]i时380nm激发的荧光强度，Fb 2 为[Ca 2+ ]i饱和时380nm激发的荧光强度，kb为Fura-2与[Ca 2+ ]i结合反应的解离常数，37℃时其值为224nm。
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测定过程:首先测定各组负载Fura-2AM细胞荧光强度R，然后加入0.2%Triton X-1000.1ml破坏细胞膜，使细胞内Fura-2被[Ca 2+ ]i饱和，测出Rmax，接着加入3nM EGTA0.1ml络合全部[Ca 2+ ]i使Fura-2游离，测出Rmin，Ff 2 取加入EGTA时380nm波长激发的荧光强度，Fb 2 取加入TritonX-100时380nm波长激发的荧光强度。
1.6 丙二醛(MDA)测定 采用硫代巴比妥酸荧光法(nmol/10 5 cell)。
1.7 统计学处理 细胞存活率用χ 2 检验，细胞内[Ca 2+ ]i含量浓度变化用t检验，细胞内MDA变化用t检验。
2 结果
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2.1 缺氧再复氧时腺泡细胞存活率变化 对照组4h细胞存活率为77.85%，缺氧组4h存活率为54.28%，比对照组下降(P<0.05)。缺氧2h后再复氧1h细胞存活率为35.46%。明显低于对照组(P<0.01)。用药组4h细胞存活率为52.84%，明显高于再复氧组(P<0.05)，与缺氧组相比无明显差异(P>0.05)。
2.2 缺氧再复氧时腺泡细胞内[Ca 2+ ]i变化 缺氧组[Ca 2+ ]i含量高于对照组(P<0.05)，缺氧2h后再复氧2h细胞内[Ca 2+ ]i升高最为明显(P<0.01)且高于缺氧组(P<0.05)，用药组4h细胞内[Ca 2+ ]i浓度与对照组相比无明显差异(P>0.05)，见表1。
表1 缺氧再复氧时胰腺腺泡细胞内[Ca 2+ ]i含量变化(略)
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2.3 缺氧再复氧时腺泡细胞内MDA变化 缺氧4h细胞内MDA含量较对照组明显升高(P<0.01)，缺氧2h再复氧2h细胞内MDA含量比对照组明显升高(P<0.001)且高于缺氧组(P<0.01)，用药组MDA含量与对照组相比无明显增加(P>0.05)，见表2。
表2 缺氧再复氧时胰腺腺泡细胞MDA含量变化(略)
3 讨论
胰腺组织有丰富的血液供应，因此对缺氧状态较为敏感，研究表明，胰腺血液循环障碍在急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)发生发展中起重要作用，其可能的机制之一是缺氧造成组织自由基的大量增加，导致了脂质过氧化反应 [3，4] 。本实验结果显示，缺氧组胰腺腺泡细胞的MDA含量增高(P<0.01)，细胞存活率降低为54.28%(P<0.05)。这说明在缺氧状态下，胰腺腺泡细胞自由基生成增加，脂质过氧化反应加强，造成了腺泡细胞损伤和死亡。再复氧时MDA含量进一步升高，而细胞存活率继续下降，这表明再复氧时自由基生成进一步增加，腺泡细胞损伤明显加重。有人用缺氧再复氧方法观察了大鼠心肌细胞及肝细胞脂质过氧化反应及自由基清除剂对其的保护作用，发现缺氧时脂质过氧化产物MDA随缺氧时间的延长而增加。细胞存活率随缺氧时间的延长而减少，再给氧时这种损伤短期内明显加重 [5，6] 。因此，我们认为自由基大量产生引起的脂质过氧化反应增强是胰腺腺泡细胞受损和死亡的重要原因。
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近年来，有关细胞内[Ca 2+ ]i超载与细胞损伤的关系，受到愈来愈多的关注。通过动态观察胰腺细胞中[Ca 2+ ]i含量的变化，发现在AP时胰腺组织中[Ca 2+ ]i异常增多，磷脂酶A 2 活性增加 [7，8] 。本实验结果显示，缺氧时腺泡细胞内[Ca 2+ ]i含量增加(P<0.05)，而再复氧时细胞内[Ca 2+ ]i增加最为明显(P<0.01)。且腺泡细胞存活率为35.46%(P<0.01)，脂质过氧化产物MDA明显增加(P<0.01)。这一结果提示，[Ca 2+ ]i在细胞内的大量积聚是被缺氧状态所诱发，随着脂质过氧化引起的细胞膜损伤而进一步加剧，并引起腺泡细胞的大量死亡。这一变化在再复氧时被进一步加重。[Ca 2+ ]i超载导致腺泡细胞损伤可能与[Ca 2+ ]i依赖性磷脂酶A 2 的激活有关，磷脂酶A 2 通过降解膜结构中的磷脂生成具有细胞毒作用的溶血卵磷脂，加重细胞损伤。另外，[Ca 2+ ]i超载可以激活某些线粒体膜上的脂酶使线粒体膜受损，氧化磷酸化过程受阻，钙泵失活，钙离子不能泵出，线粒体内[Ca 2+ ]i进一步积聚，加重线粒体损伤。同时[Ca 2+ ]i超载引起[Ca 2+ ]i依赖性蛋白水解酶活性增高，可促进黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，后者导致大量超氧阴离子自由基(O 2 ·- )和其它自由基的生成，直接损伤腺泡细胞或加重膜结构的脂质过氧化反应，导致腺泡细胞死亡 [9，10] ，我们的实验结果显示，川芎嗪可以明显减少缺氧再复氧胰腺腺泡细胞内[Ca 2+ ]i增加(P<0.05)，明显提高细胞存活率，减少细胞内脂质过氧化产物MDA含量(P<0.05)。川芎嗪对胰腺细胞的保护作用可能与阻止Ca 2+ 进入细胞内，从而抑制黄嘌呤氧化酶生成，减少了自由基生成或(和)抑制了依赖Ca 2+ 的磷脂酶激活，阻止了花生四烯酸的异常代谢，稳定了细胞膜结构有关。另外，川芎嗪可进入细胞内，调节线粒体中Ca 2+ 的再分布，使ATP合成增加，钙泵活性增强，线粒体损伤减轻。
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参考文献
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作者单位:100039北京武警总医院
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