NDV-ATV治疗对胃癌患者免疫功能的影响
【摘要】 目的 探讨胃癌患者术后新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤疫苗(NDV-ATV)治疗对免疫功能的影响。方法 采用流式细胞仪分析50例术后接受NDV-ATV治疗的胃癌患者外周静脉血T淋巴细胞亚群及NK细胞活性的变化情况，并与35例术后未接受NDV-ATV治疗的胃癌患者作为对照。结果 NDV-ATV治疗组，术后外周血CD3 + 、CD4 + 、NK细胞和CD4 + /CD8 + 均较治疗前显著增高(P<0.01)，且明显高于未接受NDV-ATV治疗的手术对照组(P<0.05)。结论 NDV-ATV可改善肿瘤患者术后机体的免疫功能。
关键词 新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤疫苗 胃癌 T淋巴细胞 自然杀伤细胞
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0673-02
The effect of immune function for patient with stomach cancer
, http://www.100md.com
with NDV-ATVtreatment after operation
Zeng Dongzhu，Yu Peiwu，Cai Zhimin，et al.
The Department of General Surgery，Southwest Hospital，
the Third Military Medical University，Chongqing400038.
【Abstract】 Objective To discuss the effect of immune function for patient with stomach cancer with NDV-ATV treatment after operation.Methods T lymphocyte subsets and NK cell in peripheral venous blood of50patients with stomach cancer who accepted NDV-ATV treatment were analysed by flow cytometer after operation，36patients without NDV-ATV treatment were used as control.Results The amount of CD3 + 、CD4 + 、NK and CD4/CD8were significantly increased after NDV-ATV treatment(P<0.01).Moreover，which remarkablely higher than those without treatment with NDV-ATV.Conclusion NDV-ATV can improve patients’immune function after operation.
, 百拇医药
Key words new castle disease virus-modified autologous tumor vaccine stomach cancer T lymphocyte subsets natural killer cells
新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤细胞疫苗(new castle disease virus-modified autologous tumor vaccine，NDV-ATV)是一种新的肿瘤疫苗，一种是利用新城鸡瘟病毒感染患者自体肿瘤细胞制成疫苗，对肿瘤患者进行主动特异性免疫治疗的方法。其疗效可靠、安全性高，一直受到研究者的重视 [1] 。但其对肿瘤患者术后细胞免疫功能的影响尚不清楚，本研究通过检测50例胃癌患者术后淋巴细胞亚群及NK细胞的变化，探讨NDV-ATV对胃癌患者术后细胞免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 研究对象 2001年5月～2002年10月收治的胃癌患者85例，均行根治手术。手术对照组35例:系接受常规治疗，但未接受NDV瘤苗治疗的患者，其中男19例，女16例，年龄18～72岁，平均年龄47岁。治疗组50例，除接受常规治疗外，同时接受NDV瘤苗治疗，其中男33例，女17例，年龄15～81岁，平均年龄45岁。
, http://www.100md.com
1.2 NDV瘤苗的制备 用生理盐水反复冲洗肿瘤组织(约3g)，剪碎成1.0mm 3 小块，置于生理盐水中，在100目不锈钢网上挤碎，收集细胞以300目不锈钢网过滤，再以生理盐水800～1000rpm×5min，洗涤2次，收集细胞悬浮于2ml生理盐水中。用细胞活性液、检测液染色所得细胞，用下列公式计算活瘤细胞:活瘤细胞/ml=四大格细胞总数/4 ×10 4 ×稀释倍数。取2×10 8 个细胞，加入2号液1ml，于5%CO 2 培养箱中37℃孵育1h;生理盐水洗涤2次，稀释成2ml细胞悬液;加等量3号液，轻轻混匀，室温下置40min，生理盐水洗2次;加等量4号液，轻轻混匀，室温下置20min;生理盐水洗2次，取5号液按1～2×10 7 /0.5ml稀释成细胞悬液，4℃保存;取6号液5ml于培养瓶，接种100μl瘤苗于瓶中液体，37℃培养3天，检测有无细菌生长，将菌检验合格瘤苗分装成4支，每支1ml，4℃保存。
, 百拇医药 1.3 NDV-ATV的应用 手术后第1周环磷酰胺400mg静滴，进行免疫调动。免疫调动1周后开始应用NDV-ATV，于肩三角区或上肢前臂皮肤三点注射，每点相距3～5cm皮内一点0.2ml;皮下2点，每点0.4ml。以后每周应用1次，共4次。
1.4 检测方法 NDV-ATV治疗组于术前、术后第2周(NDV-ATV应用前)及术后第6周(NDV-ATV治疗结束后)采集外周静脉血标本;手术对照组外周静脉血采集时象点与治疗组相同。用Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪及Cell Quest软件分析外周血CD3、CD4、CD8、CD4/CD8和CD16+56(NK)变化。
1.5 统计学方法 数据用均数±标准差(ˉx±s)表示，采用SPSS10.0统计程序进行t检验和方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
, 百拇医药
2.1 手术对照组外周血淋巴细胞亚群的变化 手术对照 组外周血淋巴细胞亚群中CD3 + 细胞、CD4 + 细胞及NK细胞在手术前表现为低下，CD4 + 与CD8 + 比值下降。术后2周上述各项指标较术前明显改善(P<0.05)。见表1。
表1 T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化 (略)
2.2 NDV-ATV治疗组外周血淋巴细胞亚群的变化 同对照组类似，术前患者外周血淋巴细胞亚群中的CD3 + 细胞、CD4 + 细胞及NK细胞偏低，CD4 + 与CD8 + 比值下降。术后2周NDV-ATV治疗前明显提高(P<0.05)。治疗结束后其CD3 + 、CD4 + 、CD4 + /CD8 +及NK与治疗前比较差异有非常显著性(P<0.01);与对照组相比较，差异有显著性(P<0.05)。见表1。
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3 讨论
新城疫病毒(new castle disease virus，NDV)是一种快速生长的RNA病毒，具有多组织亲和性的特点，它可以不依赖于肿瘤细胞的增殖能在其细胞质中选择性的复制，属于非致癌性病毒;通过其自身表面的血凝素-神经酰胺分子与广泛存在于人肿瘤细胞表面的受体———唾液酸(Sialyl-α-2-3-Galβl-4)结合 [2] 。因为NDV感染肿瘤细胞后可增强肿瘤的免疫原性，诱导细胞因子、趋化因子以及其刺激信号的产生 [3，4] ，而对正常细胞影响小。因此以NDV感染患者自体肿瘤细胞制成肿瘤疫苗，即NDV-ATV，用于肿瘤患者手术后特异性主动免疫治疗成为近年来受瞩目的肿瘤生物治疗的新方法。
机体抗肿瘤效应主要是T淋巴细胞介导的细胞免疫;因而细胞免疫的状态直接反映机体的抗瘤免疫机能，也常常作为术后肿瘤患者预后的一种指标。CD3 + 细胞即总T淋巴细胞，在根据T细胞上CD4 + 、CD8 + 的表达而将其分为:CD4 + 辅助性T细胞，既可产生IL-2、IFN等细胞因子介导效应细胞的细胞毒反应和吞噬功能，又能协助B细胞产生抗体而参与体液免疫。CD8 + 为机体抗肿瘤的主要效应细胞。CD4 + /CD8 + 细胞比值反映机体免疫调节状态，比值降低说明机体T细胞亚群失衡，提示机体免疫功能低下。NK细胞反映机体对肿瘤细胞的非特异的免疫效应。因此，患者外周血T细胞亚群及NK细胞的变化是机体抗瘤免疫能力的一个侧面反映。
, 百拇医药
本实验结果显示，肿瘤患者在手术去除肿瘤负荷后，其外周血中CD3 + 、CD4 + 、NK细胞活性和CD4 + /CD8 + 均较手术前明显提高，在应用NDV-ATV治疗后，外周血淋巴细胞亚群及NK细胞活性可以得到更明显的改善。不但NDV-ATV治疗前后差异有非常显著性(P<0.01)，同时与手术对照组比较差异有显著性(P<0.05)。说明NDV-ATV主动免疫对细胞免疫的调节作用非常明显。NDV-ATV可被视为一种免疫调节剂，经过NDV-ATV免疫治疗后可以改善肿瘤患者术后外周血淋巴细胞亚群及NK细胞活性，促进细胞免疫功能恢复和提高，增强机体杀灭残留和转移癌细胞的能力，减少肿瘤复发，改善预后。
NDV-ATV作为胃癌患者综合治疗的一项重要的措施，在临床肿瘤综合治疗中的优势将日益体现。其对免疫调节维持的时间及肿瘤患者远期疗效等相关问题有待于进一步研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Schirrmacher V，Hass C，Bonifer R.Human tumor cell modification by virus infection:an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastle Disease Virus.Gene Thera，1999，61(1):63-73.
2 Suzuki Y，Suzuki T，Matsunage M，et al.Gangliosodes as paramyxovirus receptor.Structual requirement of sialo-oligosaccharides in receptors for henagglutinating virus of Japan(Sendal virus)and New Castle Disease Virus.J Biochem(Tokyo)，1985，97:1189.
, 百拇医药
3 Hass C，Ertel C，Gerhards R，et al.Introduction of adhesive and costimulatory immune functions into tumor cells by infection with Newcastle Disease Virus.Int J Oncol，1998，13(6):1105-1115.
4 Termeer CC，Schirrmacher V，Brocher EB，et al.Newcastle disease virus infection induces B7-1/B7-2-independent T-cell costimulatory activity in human melanoma cells.Cancer Gene Ther，2000，7(2):316-323.
作者单位:400038重庆第三军医大学西南医院普外科
(编辑 于少伟), 百拇医药(曾冬竹)
关键词 新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤疫苗 胃癌 T淋巴细胞 自然杀伤细胞
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0673-02
The effect of immune function for patient with stomach cancer
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with NDV-ATVtreatment after operation
Zeng Dongzhu，Yu Peiwu，Cai Zhimin，et al.
The Department of General Surgery，Southwest Hospital，
the Third Military Medical University，Chongqing400038.
【Abstract】 Objective To discuss the effect of immune function for patient with stomach cancer with NDV-ATV treatment after operation.Methods T lymphocyte subsets and NK cell in peripheral venous blood of50patients with stomach cancer who accepted NDV-ATV treatment were analysed by flow cytometer after operation，36patients without NDV-ATV treatment were used as control.Results The amount of CD3 + 、CD4 + 、NK and CD4/CD8were significantly increased after NDV-ATV treatment(P<0.01).Moreover，which remarkablely higher than those without treatment with NDV-ATV.Conclusion NDV-ATV can improve patients’immune function after operation.
, 百拇医药
Key words new castle disease virus-modified autologous tumor vaccine stomach cancer T lymphocyte subsets natural killer cells
新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤细胞疫苗(new castle disease virus-modified autologous tumor vaccine，NDV-ATV)是一种新的肿瘤疫苗，一种是利用新城鸡瘟病毒感染患者自体肿瘤细胞制成疫苗，对肿瘤患者进行主动特异性免疫治疗的方法。其疗效可靠、安全性高，一直受到研究者的重视 [1] 。但其对肿瘤患者术后细胞免疫功能的影响尚不清楚，本研究通过检测50例胃癌患者术后淋巴细胞亚群及NK细胞的变化，探讨NDV-ATV对胃癌患者术后细胞免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 研究对象 2001年5月～2002年10月收治的胃癌患者85例，均行根治手术。手术对照组35例:系接受常规治疗，但未接受NDV瘤苗治疗的患者，其中男19例，女16例，年龄18～72岁，平均年龄47岁。治疗组50例，除接受常规治疗外，同时接受NDV瘤苗治疗，其中男33例，女17例，年龄15～81岁，平均年龄45岁。
, http://www.100md.com
1.2 NDV瘤苗的制备 用生理盐水反复冲洗肿瘤组织(约3g)，剪碎成1.0mm 3 小块，置于生理盐水中，在100目不锈钢网上挤碎，收集细胞以300目不锈钢网过滤，再以生理盐水800～1000rpm×5min，洗涤2次，收集细胞悬浮于2ml生理盐水中。用细胞活性液、检测液染色所得细胞，用下列公式计算活瘤细胞:活瘤细胞/ml=四大格细胞总数/4 ×10 4 ×稀释倍数。取2×10 8 个细胞，加入2号液1ml，于5%CO 2 培养箱中37℃孵育1h;生理盐水洗涤2次，稀释成2ml细胞悬液;加等量3号液，轻轻混匀，室温下置40min，生理盐水洗2次;加等量4号液，轻轻混匀，室温下置20min;生理盐水洗2次，取5号液按1～2×10 7 /0.5ml稀释成细胞悬液，4℃保存;取6号液5ml于培养瓶，接种100μl瘤苗于瓶中液体，37℃培养3天，检测有无细菌生长，将菌检验合格瘤苗分装成4支，每支1ml，4℃保存。
, 百拇医药 1.3 NDV-ATV的应用 手术后第1周环磷酰胺400mg静滴，进行免疫调动。免疫调动1周后开始应用NDV-ATV，于肩三角区或上肢前臂皮肤三点注射，每点相距3～5cm皮内一点0.2ml;皮下2点，每点0.4ml。以后每周应用1次，共4次。
1.4 检测方法 NDV-ATV治疗组于术前、术后第2周(NDV-ATV应用前)及术后第6周(NDV-ATV治疗结束后)采集外周静脉血标本;手术对照组外周静脉血采集时象点与治疗组相同。用Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪及Cell Quest软件分析外周血CD3、CD4、CD8、CD4/CD8和CD16+56(NK)变化。
1.5 统计学方法 数据用均数±标准差(ˉx±s)表示，采用SPSS10.0统计程序进行t检验和方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
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2.1 手术对照组外周血淋巴细胞亚群的变化 手术对照 组外周血淋巴细胞亚群中CD3 + 细胞、CD4 + 细胞及NK细胞在手术前表现为低下，CD4 + 与CD8 + 比值下降。术后2周上述各项指标较术前明显改善(P<0.05)。见表1。
表1 T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化 (略)
2.2 NDV-ATV治疗组外周血淋巴细胞亚群的变化 同对照组类似，术前患者外周血淋巴细胞亚群中的CD3 + 细胞、CD4 + 细胞及NK细胞偏低，CD4 + 与CD8 + 比值下降。术后2周NDV-ATV治疗前明显提高(P<0.05)。治疗结束后其CD3 + 、CD4 + 、CD4 + /CD8 +及NK与治疗前比较差异有非常显著性(P<0.01);与对照组相比较，差异有显著性(P<0.05)。见表1。
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3 讨论
新城疫病毒(new castle disease virus，NDV)是一种快速生长的RNA病毒，具有多组织亲和性的特点，它可以不依赖于肿瘤细胞的增殖能在其细胞质中选择性的复制，属于非致癌性病毒;通过其自身表面的血凝素-神经酰胺分子与广泛存在于人肿瘤细胞表面的受体———唾液酸(Sialyl-α-2-3-Galβl-4)结合 [2] 。因为NDV感染肿瘤细胞后可增强肿瘤的免疫原性，诱导细胞因子、趋化因子以及其刺激信号的产生 [3，4] ，而对正常细胞影响小。因此以NDV感染患者自体肿瘤细胞制成肿瘤疫苗，即NDV-ATV，用于肿瘤患者手术后特异性主动免疫治疗成为近年来受瞩目的肿瘤生物治疗的新方法。
机体抗肿瘤效应主要是T淋巴细胞介导的细胞免疫;因而细胞免疫的状态直接反映机体的抗瘤免疫机能，也常常作为术后肿瘤患者预后的一种指标。CD3 + 细胞即总T淋巴细胞，在根据T细胞上CD4 + 、CD8 + 的表达而将其分为:CD4 + 辅助性T细胞，既可产生IL-2、IFN等细胞因子介导效应细胞的细胞毒反应和吞噬功能，又能协助B细胞产生抗体而参与体液免疫。CD8 + 为机体抗肿瘤的主要效应细胞。CD4 + /CD8 + 细胞比值反映机体免疫调节状态，比值降低说明机体T细胞亚群失衡，提示机体免疫功能低下。NK细胞反映机体对肿瘤细胞的非特异的免疫效应。因此，患者外周血T细胞亚群及NK细胞的变化是机体抗瘤免疫能力的一个侧面反映。
, 百拇医药
本实验结果显示，肿瘤患者在手术去除肿瘤负荷后，其外周血中CD3 + 、CD4 + 、NK细胞活性和CD4 + /CD8 + 均较手术前明显提高，在应用NDV-ATV治疗后，外周血淋巴细胞亚群及NK细胞活性可以得到更明显的改善。不但NDV-ATV治疗前后差异有非常显著性(P<0.01)，同时与手术对照组比较差异有显著性(P<0.05)。说明NDV-ATV主动免疫对细胞免疫的调节作用非常明显。NDV-ATV可被视为一种免疫调节剂，经过NDV-ATV免疫治疗后可以改善肿瘤患者术后外周血淋巴细胞亚群及NK细胞活性，促进细胞免疫功能恢复和提高，增强机体杀灭残留和转移癌细胞的能力，减少肿瘤复发，改善预后。
NDV-ATV作为胃癌患者综合治疗的一项重要的措施，在临床肿瘤综合治疗中的优势将日益体现。其对免疫调节维持的时间及肿瘤患者远期疗效等相关问题有待于进一步研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Schirrmacher V，Hass C，Bonifer R.Human tumor cell modification by virus infection:an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastle Disease Virus.Gene Thera，1999，61(1):63-73.
2 Suzuki Y，Suzuki T，Matsunage M，et al.Gangliosodes as paramyxovirus receptor.Structual requirement of sialo-oligosaccharides in receptors for henagglutinating virus of Japan(Sendal virus)and New Castle Disease Virus.J Biochem(Tokyo)，1985，97:1189.
, 百拇医药
3 Hass C，Ertel C，Gerhards R，et al.Introduction of adhesive and costimulatory immune functions into tumor cells by infection with Newcastle Disease Virus.Int J Oncol，1998，13(6):1105-1115.
4 Termeer CC，Schirrmacher V，Brocher EB，et al.Newcastle disease virus infection induces B7-1/B7-2-independent T-cell costimulatory activity in human melanoma cells.Cancer Gene Ther，2000，7(2):316-323.
作者单位:400038重庆第三军医大学西南医院普外科
(编辑 于少伟), 百拇医药(曾冬竹)