四逆汤对供心冷缺血再灌注损伤的研究
【摘要】 目的 探讨中药制剂四逆汤(按附子:干姜:甘草配剂)对供心缺血再灌注损伤的保护作用。方法 选用16只新西兰大白兔随机分为对照组和实验组。常规取心后用UW液冷保存6h;然后在Langendorff模型上，对照组用KHB液灌注，实验组用KHB+四逆汤灌注30min。分别测定灌注前、后的心肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 实验组MDA含量明显低于对照组(P<0.05)，SOD活性明显高于对照组(P<0.05)。结论 中药制剂四逆汤对供心冷缺血再灌注损伤具有保护作用，值得临床应用。
关键词 四逆汤 缺血再灌注损伤 供体心肌保护
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)08-0680-02
Sini decoction in ischemic reperfusion injury of donor heart
, 百拇医药
Wu Guoyong，Lu Jianjun，Zhong Fotian，et al.
Department of Cardiothorac Surgery，First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect of Sini Decoction(including FuZi，GanJiang，GanˉChao)on ischemic reperfusion injury of donor heart.Methods New-Zealand Rabbits(n=16)were divided into two groups:the control and tested.After isolated，hearts were preserved in UW fluid for six hours.Furthermore，on lanˉgendorff model，hearts in the control group were reperfused with KHB fluid，while hearts in the tested group with KHB+Sini Decoction fluid for30minutes.The MDA and SOD were determined before and at the end of reperfusion.Reˉsults The MDA in the tested was lower than in the control，but the SOD in the tested was higher(P<0.05).Conˉclusion Sini Decoction has an obvious protective effect on ischemic reperfusion injury of donor heart.
, 百拇医药
Key words Sini dectocion ischemic reperfusion injury preservation of donor heart
中药制剂四逆汤具有氧自由基清除作用及抗脂质过氧化的作用，故能预防和减少心肌细胞在缺血再灌注过程中的损伤。心脏移植中，缺血再灌注损伤直接影响供心的成活及功能。本实验探讨中药制剂四逆汤对供心冷缺血再灌注损伤的保护作用，为临床应用提供理论依据。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 新西兰大白兔，体重2.51±0.13kg，雌雄不拘。由中山医科大学动物中心提供。随机分为1组(对照组)和2组(实验组)(n=8)。
1.2 四逆汤的制备 [1] (1)四逆汤汤剂的制备:四逆汤按附子:干姜:甘草以5:2:2配伍(广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定)。附子、甘草用水浸泡30min，加入干姜用水煎3次，每次45min，合并滤液，水浴上浓缩成浓度为1g生药/ml，备用。(2)四逆汤针剂的制备:四逆汤按附子:干姜:甘草以5:2:2配伍(广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定)。将附子、甘草用水浸泡30min，加入干姜用水煎3次，每次45min，合并滤液，水浴上浓缩成糖浆状，加95%乙醇使含乙醇量达50%，搅拌，静置24h，过滤，回收乙醇，再浓缩成糖浆状，加95%乙醇至含乙醇量达80%，放置24h，过滤，回收乙醇，水浴上浓缩至无乙醇味，保留。用新鲜注射用水将所得之糖浆状物溶解为注射液(每ml相当生药1g)，密闭，于100℃40min消毒后，保存备用。
, 百拇医药
所加95%乙醇量=(原药液体积×所要的乙醇浓度)/(95%-所要的乙醇浓度)
1.3 取心与保存 新西兰大白兔称重后用乙醚吸入麻醉，连接心电电极监测心率(HR)，经股动脉和颈静脉分别穿刺插管测动脉压(BP)和中心静脉压(CVP)，颈静脉穿刺管注射肝素液(3mg/kg)行全身肝素化。正中劈开胸骨切口，显露心脏及大血管。迅速切断主动脉、肺动脉及各腔静脉，取出心脏，在主动脉根部灌注UW液(温度:4℃，量:10ml/kg体重，压力80mmHg)，其中2组UW液中加入四逆汤注射液(浓度10ml/L，下同);同时将心脏置入0～4℃生理盐水中。待灌注完毕心脏停跳冠状动脉至无血后，将心脏称重后将1组移入4℃UW液中，2组放入UW+四逆汤注射液(浓度10ml/L)中置入4℃冰箱中保存6h。
1.4 离体供心Langendorff缺血、再灌注模型灌注 [2] 将供心取出后在右心前壁剪取少许心肌置于液氮中备用，然后将供心置于37℃恒温、恒压(60mmHg)之langendoff模型中用预先制备氧合好的KHB液再灌30min，其中2组中的KHB液加入四逆汤注射液(浓度为10ml/L)。
, 百拇医药
1.5 观察指标 再灌注前及再灌注末MDA和SOD含量，分别取再灌注前供心右室心肌及再灌注末左室心肌少许，按改良的八木国大法 [3] 测定心肌MDA含量，按邻苯三酚法 [4] 测定心肌SOD含量。
1.6 统计方法 结果以均数±标准差(X±s)表示，采用两组间t检验。当P<0.05时差异有显著性。
2 结果
2.1 取心前一般情况 包括体重、心率、平均动脉压、中心静脉压、胸腔温度等见表1。表明各组间具有可比性。
表1 取心前一般情况(略)
2.2 再灌注前及再灌注末MDA和SOD含量 见表2、3。
表2 再灌注前及再灌注末MDA含量(略)
, 百拇医药
表3 再灌注前及再灌注末SOD含量(略)
3 讨论
心脏移植已成为终末期心脏病人的常规治疗方法，由于供心缺乏，许多病人在等待中死亡。因而许多学者致力于增加供心来源的研究，延长供心保存时限是增加供心来源的主要途径之一。而供心保存的基本原则是:(1)通过降温和化学方法尽量降低组织代谢需要，并增加组织对缺氧损伤的抵抗力;(2)人工供给必要的生命基质，以维持最低的能量消耗[5] 。因此必须尽可能缩短供心热缺血和冷缺血的时间。目前，大多数学者认为供心保存液允许供心热缺血时限不能超过10min，冷保存时间在5～6h以内为安全。四逆汤能增加缺血心肌的营养血流，降低氧自由基的浓度，增加SOD的活性，改善能量代谢，并已用于内科心肌缺血的治疗。为了解四逆汤对供心冷保存作用，我们通过供心冷缺血后代谢变化进行比较研究，并对其保护作用机制作了探讨。目前，单纯低温保存仍是大多数心脏移植中心采用的供心保存方法。一般保存液允许供心保存的时限仅3～4h，即使是UW液也只是5～6h以内，且UW液价格较昂贵。许多学者都在进一步改善保存液以达到进一步延长保存时限的要求。四逆汤是中医回阳救逆的经典名方，有增加缺血心肌营养血流、清除氧自由基、改善缺血心肌能量供给的作用，已用于缺血性心脏病的内科治疗。本研究将四逆汤作为冷保存液成分，了解其对供心冷保存的保护作用。
, 百拇医药
在缺血再灌注损伤中，氧自由基的爆发生成是其主要机制之一。这主要与黄嘌呤氧化酶催化的O -2 的生成有关。此外线粒体电子漏、白细胞呼吸爆发、儿茶酚胺自氧化 等均使得再灌注过程中自由基的生成大量增加。上述产生 的氧自由基通过对细胞膜和细胞器膜中的多不饱和脂肪酸的氧化连锁反应，生成过氧化脂质，使膜的流动性及通透性发生障碍，并产生代谢产物丙二醛(MDA)。此外氧自由基还可以氧化膜中含硫基的蛋白成分，使膜的完整性遭到破坏。
吴伟康等报道 [6] ，四逆汤中附子、甘草均能明显抑制缺血心肌中的脂质过氧化反应，且四逆汤全方的效果显著大于各单方。四逆汤抑制脂质过氧反应的作用，主要是由于四逆汤中附子、甘草均能直接清除氧自由基。
MDA的浓度为膜脂质过氧化损害程度的标志。本实验结果显示:在再灌注前，实验组MDA含量虽少于对照组，两者间差异无显著性，这可能是由于自由基的产生主要发生于再灌注过程当中，缺血时生成较少的缘故。在再灌注过程中，缺血心肌会产生大量的MDA，这是由于再灌注时分子氧的重新引入，自由基生成暴发，氧自由基引起膜脂质过氧化生成大量过氧化脂质，产生降解产物MDA [7] 。再灌注30min后，实验组MDA的增加量明显低于对照组，两组间差异有显著性，表明四逆汤能明显减少供心保存时及再灌注后氧自由基的形成，增强心肌抗脂质过氧化能力，预防或减少心肌再灌注损伤。SOD是清除机体内氧自由基的主要防御机制。SOD活性的降低提示心肌内有大量氧自由基生成。在本实验中，实验组SOD活性无论是再灌注前还是再灌注后均明显高于对照组，说明四逆汤对内源性SOD有保护作用。四逆汤可能是通过保护内源性SOD来预防或减少心肌再灌注损伤。
, 百拇医药
参考文献
1 天津南开医院.生脉、四逆汤注射液.中草药，1972，4:21.
2 徐淑云.药理实验方法学，第2版，北京:人民卫生出版社，1992，38.
3 齐凤菊，周玫，陈瑗，等.血浆丙二醛含量的测定方法--改良的八木国法.第一军医大学学报，1986，6(2):152.
4 Marklund S，Marlund G.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide disˉmutase.Eur J Biochem，1974，47:469.
5 Belzer FO，Southard JH.Principles of solid organ preservation by cold storage.Transplantation，1988，45(4):673-676.
, 百拇医药
6 吴伟康，侯灿，罗汉川，等.四逆汤方药抗缺血心肌脂质过氧化作用及其量效时效的研究.中国中药杂志，1995，20(4):235.
7 Jennings RB，Murry CE，steenbergen-C Jr，et al.Development of cell injury in sustained acute ischemia.Circ，1990，82(3suppl):2-12.
基金项目:广东省中医药局基金资助(课题号99555)
作者单位:510080广东广州中山大学附属一院胸心外科
(收稿日期:2003-04-22)
(编辑 浮萍), http://www.100md.com(巫国勇)
关键词 四逆汤 缺血再灌注损伤 供体心肌保护
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)08-0680-02
Sini decoction in ischemic reperfusion injury of donor heart
, 百拇医药
Wu Guoyong，Lu Jianjun，Zhong Fotian，et al.
Department of Cardiothorac Surgery，First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect of Sini Decoction(including FuZi，GanJiang，GanˉChao)on ischemic reperfusion injury of donor heart.Methods New-Zealand Rabbits(n=16)were divided into two groups:the control and tested.After isolated，hearts were preserved in UW fluid for six hours.Furthermore，on lanˉgendorff model，hearts in the control group were reperfused with KHB fluid，while hearts in the tested group with KHB+Sini Decoction fluid for30minutes.The MDA and SOD were determined before and at the end of reperfusion.Reˉsults The MDA in the tested was lower than in the control，but the SOD in the tested was higher(P<0.05).Conˉclusion Sini Decoction has an obvious protective effect on ischemic reperfusion injury of donor heart.
, 百拇医药
Key words Sini dectocion ischemic reperfusion injury preservation of donor heart
中药制剂四逆汤具有氧自由基清除作用及抗脂质过氧化的作用，故能预防和减少心肌细胞在缺血再灌注过程中的损伤。心脏移植中，缺血再灌注损伤直接影响供心的成活及功能。本实验探讨中药制剂四逆汤对供心冷缺血再灌注损伤的保护作用，为临床应用提供理论依据。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 新西兰大白兔，体重2.51±0.13kg，雌雄不拘。由中山医科大学动物中心提供。随机分为1组(对照组)和2组(实验组)(n=8)。
1.2 四逆汤的制备 [1] (1)四逆汤汤剂的制备:四逆汤按附子:干姜:甘草以5:2:2配伍(广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定)。附子、甘草用水浸泡30min，加入干姜用水煎3次，每次45min，合并滤液，水浴上浓缩成浓度为1g生药/ml，备用。(2)四逆汤针剂的制备:四逆汤按附子:干姜:甘草以5:2:2配伍(广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定)。将附子、甘草用水浸泡30min，加入干姜用水煎3次，每次45min，合并滤液，水浴上浓缩成糖浆状，加95%乙醇使含乙醇量达50%，搅拌，静置24h，过滤，回收乙醇，再浓缩成糖浆状，加95%乙醇至含乙醇量达80%，放置24h，过滤，回收乙醇，水浴上浓缩至无乙醇味，保留。用新鲜注射用水将所得之糖浆状物溶解为注射液(每ml相当生药1g)，密闭，于100℃40min消毒后，保存备用。
, 百拇医药
所加95%乙醇量=(原药液体积×所要的乙醇浓度)/(95%-所要的乙醇浓度)
1.3 取心与保存 新西兰大白兔称重后用乙醚吸入麻醉，连接心电电极监测心率(HR)，经股动脉和颈静脉分别穿刺插管测动脉压(BP)和中心静脉压(CVP)，颈静脉穿刺管注射肝素液(3mg/kg)行全身肝素化。正中劈开胸骨切口，显露心脏及大血管。迅速切断主动脉、肺动脉及各腔静脉，取出心脏，在主动脉根部灌注UW液(温度:4℃，量:10ml/kg体重，压力80mmHg)，其中2组UW液中加入四逆汤注射液(浓度10ml/L，下同);同时将心脏置入0～4℃生理盐水中。待灌注完毕心脏停跳冠状动脉至无血后，将心脏称重后将1组移入4℃UW液中，2组放入UW+四逆汤注射液(浓度10ml/L)中置入4℃冰箱中保存6h。
1.4 离体供心Langendorff缺血、再灌注模型灌注 [2] 将供心取出后在右心前壁剪取少许心肌置于液氮中备用，然后将供心置于37℃恒温、恒压(60mmHg)之langendoff模型中用预先制备氧合好的KHB液再灌30min，其中2组中的KHB液加入四逆汤注射液(浓度为10ml/L)。
, 百拇医药
1.5 观察指标 再灌注前及再灌注末MDA和SOD含量，分别取再灌注前供心右室心肌及再灌注末左室心肌少许，按改良的八木国大法 [3] 测定心肌MDA含量，按邻苯三酚法 [4] 测定心肌SOD含量。
1.6 统计方法 结果以均数±标准差(X±s)表示，采用两组间t检验。当P<0.05时差异有显著性。
2 结果
2.1 取心前一般情况 包括体重、心率、平均动脉压、中心静脉压、胸腔温度等见表1。表明各组间具有可比性。
表1 取心前一般情况(略)
2.2 再灌注前及再灌注末MDA和SOD含量 见表2、3。
表2 再灌注前及再灌注末MDA含量(略)
, 百拇医药
表3 再灌注前及再灌注末SOD含量(略)
3 讨论
心脏移植已成为终末期心脏病人的常规治疗方法，由于供心缺乏，许多病人在等待中死亡。因而许多学者致力于增加供心来源的研究，延长供心保存时限是增加供心来源的主要途径之一。而供心保存的基本原则是:(1)通过降温和化学方法尽量降低组织代谢需要，并增加组织对缺氧损伤的抵抗力;(2)人工供给必要的生命基质，以维持最低的能量消耗[5] 。因此必须尽可能缩短供心热缺血和冷缺血的时间。目前，大多数学者认为供心保存液允许供心热缺血时限不能超过10min，冷保存时间在5～6h以内为安全。四逆汤能增加缺血心肌的营养血流，降低氧自由基的浓度，增加SOD的活性，改善能量代谢，并已用于内科心肌缺血的治疗。为了解四逆汤对供心冷保存作用，我们通过供心冷缺血后代谢变化进行比较研究，并对其保护作用机制作了探讨。目前，单纯低温保存仍是大多数心脏移植中心采用的供心保存方法。一般保存液允许供心保存的时限仅3～4h，即使是UW液也只是5～6h以内，且UW液价格较昂贵。许多学者都在进一步改善保存液以达到进一步延长保存时限的要求。四逆汤是中医回阳救逆的经典名方，有增加缺血心肌营养血流、清除氧自由基、改善缺血心肌能量供给的作用，已用于缺血性心脏病的内科治疗。本研究将四逆汤作为冷保存液成分，了解其对供心冷保存的保护作用。
, 百拇医药
在缺血再灌注损伤中，氧自由基的爆发生成是其主要机制之一。这主要与黄嘌呤氧化酶催化的O -2 的生成有关。此外线粒体电子漏、白细胞呼吸爆发、儿茶酚胺自氧化 等均使得再灌注过程中自由基的生成大量增加。上述产生 的氧自由基通过对细胞膜和细胞器膜中的多不饱和脂肪酸的氧化连锁反应，生成过氧化脂质，使膜的流动性及通透性发生障碍，并产生代谢产物丙二醛(MDA)。此外氧自由基还可以氧化膜中含硫基的蛋白成分，使膜的完整性遭到破坏。
吴伟康等报道 [6] ，四逆汤中附子、甘草均能明显抑制缺血心肌中的脂质过氧化反应，且四逆汤全方的效果显著大于各单方。四逆汤抑制脂质过氧反应的作用，主要是由于四逆汤中附子、甘草均能直接清除氧自由基。
MDA的浓度为膜脂质过氧化损害程度的标志。本实验结果显示:在再灌注前，实验组MDA含量虽少于对照组，两者间差异无显著性，这可能是由于自由基的产生主要发生于再灌注过程当中，缺血时生成较少的缘故。在再灌注过程中，缺血心肌会产生大量的MDA，这是由于再灌注时分子氧的重新引入，自由基生成暴发，氧自由基引起膜脂质过氧化生成大量过氧化脂质，产生降解产物MDA [7] 。再灌注30min后，实验组MDA的增加量明显低于对照组，两组间差异有显著性，表明四逆汤能明显减少供心保存时及再灌注后氧自由基的形成，增强心肌抗脂质过氧化能力，预防或减少心肌再灌注损伤。SOD是清除机体内氧自由基的主要防御机制。SOD活性的降低提示心肌内有大量氧自由基生成。在本实验中，实验组SOD活性无论是再灌注前还是再灌注后均明显高于对照组，说明四逆汤对内源性SOD有保护作用。四逆汤可能是通过保护内源性SOD来预防或减少心肌再灌注损伤。
, 百拇医药
参考文献
1 天津南开医院.生脉、四逆汤注射液.中草药，1972，4:21.
2 徐淑云.药理实验方法学，第2版，北京:人民卫生出版社，1992，38.
3 齐凤菊，周玫，陈瑗，等.血浆丙二醛含量的测定方法--改良的八木国法.第一军医大学学报，1986，6(2):152.
4 Marklund S，Marlund G.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide disˉmutase.Eur J Biochem，1974，47:469.
5 Belzer FO，Southard JH.Principles of solid organ preservation by cold storage.Transplantation，1988，45(4):673-676.
, 百拇医药
6 吴伟康，侯灿，罗汉川，等.四逆汤方药抗缺血心肌脂质过氧化作用及其量效时效的研究.中国中药杂志，1995，20(4):235.
7 Jennings RB，Murry CE，steenbergen-C Jr，et al.Development of cell injury in sustained acute ischemia.Circ，1990，82(3suppl):2-12.
基金项目:广东省中医药局基金资助(课题号99555)
作者单位:510080广东广州中山大学附属一院胸心外科
(收稿日期:2003-04-22)
(编辑 浮萍), http://www.100md.com(巫国勇)