热休克蛋白70和糖调节蛋白94在人食管癌组织中的表达及生物学意义
【摘要】 目的 探讨人食管癌组织中热休克蛋白70(HSP70)和糖调节蛋白94(grp94)的表达及意义。方法 采用SABC法检测人食管癌组织HSP70和grp94的表达，图像分析HSP70和grp94在癌组织及癌旁组织中的表达特点。结果 92.3%(72/78)食管癌组织中存在HSP70的表达，癌细胞存在胞浆、胞核表达强度及部位的差异;grp94的表达阳性率为71.8%(56/78)，以胞浆表达为主，而癌旁组织表达较少。结论 免疫组化检测结果证实人食管癌组织存在HSP70和grp94的表达异质性，呈现了胞浆、胞核的表达差异，HSP70的表达强度与食管癌的分化程度相关。掌握HSP70和grp94在人食管癌组织的表达特点为以后肿瘤抗原肽瘤苗的提取和实验奠定了基础。 关键词 食管癌 热休克蛋白70 糖调节蛋白94 免疫组化
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1443-02
Identification of heat shock protein-70and glucosal-related
, http://www.100md.com
protein-94expressing in human esophagus carcinoma
Wang Xiaoping，Liu Guozhen，Song Aili，et al.
Department of Pathology，Capital University of Medical Sciences，Beijing100078.
【Abstract】 Objective To study expression of HSP70and grp94in human esophagus carcinoma(EC).Methˉods HSP70and grp94expression were detected by immunohistochemistry，the character of which were analyzed by biological microscope.Results Of78cases of EC，92.3%(72/78)showed HSP70positive stained，and the expres
, 百拇医药
ˉsion character were various and different，while grp94was mainly stained in cell plasma，and the positive rate was71.8%(56/78).Conclusion Owing to the heteroity in EC，HSP70and grp94expressed differently in cell plasma and nucleolus.Theexpression intensity of HSP70was related to the differentiation of EC.The expression rule of HSP70and grp94in EC will lay a better basis on tumor vaccine.
Key words esophagus carcinoma heat shock protein70 glucosal-related protein-94 immunohistocheˉmistry
, http://www.100md.com
热休克蛋白70(HSP70)和糖调节蛋白94(grp94)在肿瘤免疫中的作用成为研究的热点，已经证实它们具有良好的“分子伴侣”和免疫佐剂的效应，能和多种肿瘤抗原肽结合，参与抗原的提成和加工，是体内肿瘤抗原肽的“分子佐剂”，可在体内诱导特异性主动免疫[1，2] 。目前有关人食管癌组织HSP70和grp94表达研究的报道较少，本次研究以检测人食管癌组织HSP70和grp94的表达为起始，分析其在食管癌细胞中表达特点，为以后食管癌抗原肽肿瘤疫苗的提取和免疫研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 组织标本和试剂 1999～2002年人食管鳞癌组织标本由首都医科大学病理教研室和首都医科大学附属友谊医院提供，经中性福尔马林固定，石蜡包埋，超薄切片，保存备用;SABC试剂盒购自中山生物公司;鼠抗人HSP70和grp94IgG单克隆抗体由Santa公司提供;细胞图像分析系统为北京航空航天大学产品。
, 百拇医药
1.2 SABC法检测HSP70和grp94在人食管癌组织的表达 组织切片脱蜡至水，3%H 2 O 2 封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤;2%羊血清封闭非特异性位点，加入鼠抗人HSP70或grp94IgG单克隆抗体(1:100)，4℃孵育过夜;次日PBS漂洗3次，加入生物素标记羊抗鼠IgG抗体(1:100)，37℃孵育30min，PBS漂洗，加入HRP标记链霉卵白素(1:100)，37℃孵育30min，充分漂洗，DAB-H 2 O 2 显色，苏木素复染核，脱水透明，中性树脂封片，镜下观察结果。以PBS代替I抗作空白对照，小鼠血清代替I抗作为阴性对照。阳性为黄褐色着染，阴性不着色。免疫组化结果采用多功能图像分析系统采集组织分析食管癌细胞分化程度与HSP70表达强度。
1.3 统计学处理 采用χ 2 检验。
2 结果
2.1 HSP70和grp94在人食管癌组织的表达程度 78例食管鳞癌按WHO肿瘤分级标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，72例食管癌组织中有HSP70不同程度的表达，以胞核表达为主，部分细胞见胞浆表达。分化不同的食管癌组织及癌细胞HSP70的表达强度存在一定的差异。分化Ⅱ～Ⅲ级的食管癌细胞HSP70表达较强，分化较好的Ⅰ级食管癌细胞表达较弱;分化Ⅱ～Ⅲ级的食管癌癌旁组织存在HSP70的较弱表达，分化Ⅰ级的食管癌癌旁组织未见着色。而grp94在癌组织中以胞浆表达为主，胞核表达较少，表达阳性率为71.8%(56/78)，统计学处理显示HSP70和grp94在癌细胞及癌旁组织中的表达存在明显差异。
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2.2 HSP70和grp94在人食管癌组织的表达部位 分化不同的食管癌组织及癌细胞表达分布存在一定的差异，同一食管癌组织不同癌细胞呈现了胞浆、胞核的定位表达，显示了癌组织分化的异质性。见表1，2。
表1 HSP70和grp94在食管癌组织中的表达(略)
表2 食管癌细胞分化与HSP70的表达关系 (略)
3 讨论
近年HSP70和grp94在免疫中的作用日益受到重视。肿瘤细胞自身与机体不相协调的增殖和恶性特征一定程度上与HSP的表达密切相关，HSP70和grp94在肿瘤免疫中充当了双重角色，一方面作为“分子伴侣”参与肿瘤细胞的功能代谢，保护肿瘤细胞免受有害因素的损害;另一方面作为“分子佐剂”，HSP70和grp94成为肿瘤抗原多肽结合的靶载体，在参与肿瘤抗原的免疫反应中充当了举足轻重的角色。
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研究中检测的78例食管癌组织中有92.3%(72/78)HSP70和71.8%(56/78)grp94不同程度的表达，与其癌旁组织的比较存在明确的统计学差异。检测结果发现分化不同的食管癌组织及癌细胞表达分布存在一定的差异，这与肿瘤细胞的异质性密切相关。正常细胞生长发育分化过程中，HSP70和grp94的少量表达受细胞周期的严格调控，而肿瘤细胞中突变基因及其产物的存在刺激HSP70和grp94的合成，使其呈现持续的高诱导表达。同样，正常组织细胞少量表达的HSP70主要定位于胞浆;而肿瘤细胞除胞浆外， 胞核和胞膜均有不同程度的分布 [3，4] 。本次研究中发现食管癌细胞分化与HSP70的表达具有一定关系，统计学处理显示分化程度较低的Ⅲ级食管癌组织HSP70表达较强，分化较成熟的Ⅰ级食管癌组织表达较弱;癌旁组织表达很弱甚至未见着色，进一步显示了癌组织分化的异质性，提示HSP70对于判断食管癌组织的分化程度和患者预后可能有一定的意义。一定程度上，HSP70和grp94在肿瘤细胞异于正常细胞的定位分布反映了癌细胞生物学行为的异常，这与肿瘤自身不断增殖和无限生长的特性相适应，这种异常的表达分布可能在诱导抗肿瘤免疫中起作用。
, 百拇医药
HSP70和grp94在肿瘤免疫中的作用已成为研究的热点。国内外一些学者从动物肿瘤如肺癌、结肠癌、黑色素瘤细胞中提取并纯化了HSP70、60和grp94分子，以其作为抗肿瘤免疫小鼠产生保护性免疫反应，小鼠体内不易成瘤;而由正常组织提取的HSP70不能诱发小鼠保护性免疫反应 [5] 。近年研究表明HSP70和grp94免疫效应的发挥依赖于免疫系统的综合作用，涉及到α/βT细胞、γ/δT细胞和NK、LAK样细胞的协同作用，其杀伤肿瘤细胞的效应是通过识别grp94和HSP70递呈的肿瘤抗原肽而激活发挥效应 [3] 。一个有意义的启示就是通过肿瘤组织提取或体外重组的HSP70或grp94-抗原肽复合物，作为疫苗免疫机体，激发机体产生抗肿瘤特异的CTL效应 [6] 。本次研究发现人食管癌组织中HSP70和grp94异质性表达特点，癌细胞以胞核、胞浆表达为主，胞膜表达较少，启示需从癌组织得到足量有效的热休克蛋白疫苗，可以通过体外分离大量培养及癌组织应激处理如热处理、非致死性放射线照射等方法，使肿瘤细胞HSP70和grp94的表达定位重新分布，同时增加其表达量，从而为进一步提取纯化足量的HSP70抗原肽蛋白瘤苗进行抗人食管癌的免疫研究奠定基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Manjili MH，Wang XY，Park J，et al.Immunotherapy of cancer using heat shock proteins.Front Biosci，2002，7:43-60.
2 Cinpita AM，Peterson M，Kono K，et al.Immunization with heat shock protein70from methylcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell responses.Cancer Immunol Immunother，2002，51:163-170.
3 Ponomarev Ed，Tarasenko TN，Sapozhnikov AM.Splenic cytotoxic cells recognize surface HSP70on culture-adapted EL-4mouse lymphoma cels.Immunol.Lett，2000，74:133-139.
, 百拇医药
4 王小平，刘彦仿，杨守京，等.热休克蛋白70在人肝癌细胞SMMC-7721中的表达规律.临床与实验病理学杂志，2001，4(suppl):1-3.
5 Ishii T，Udono H，Yamano T，et al.Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proˉteins hsp70，hsp90and gp96.J Immunol，1999，162:1303-1309.
6 王小平，刘彦仿，杨守京，等.热休克蛋白70复合物抗人肝癌免疫的实验研究.美国中华医药杂志，2001，7(2):7-9.
ˇ 基金项目:北京市青年骨干教师培养基金资助项目，首都医科大学基础临床合作基金(N0.02-31)
作者单位:100054首都医科大学病理学教研室
(编辑 小川), 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1443-02
Identification of heat shock protein-70and glucosal-related
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protein-94expressing in human esophagus carcinoma
Wang Xiaoping，Liu Guozhen，Song Aili，et al.
Department of Pathology，Capital University of Medical Sciences，Beijing100078.
【Abstract】 Objective To study expression of HSP70and grp94in human esophagus carcinoma(EC).Methˉods HSP70and grp94expression were detected by immunohistochemistry，the character of which were analyzed by biological microscope.Results Of78cases of EC，92.3%(72/78)showed HSP70positive stained，and the expres
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ˉsion character were various and different，while grp94was mainly stained in cell plasma，and the positive rate was71.8%(56/78).Conclusion Owing to the heteroity in EC，HSP70and grp94expressed differently in cell plasma and nucleolus.Theexpression intensity of HSP70was related to the differentiation of EC.The expression rule of HSP70and grp94in EC will lay a better basis on tumor vaccine.
Key words esophagus carcinoma heat shock protein70 glucosal-related protein-94 immunohistocheˉmistry
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热休克蛋白70(HSP70)和糖调节蛋白94(grp94)在肿瘤免疫中的作用成为研究的热点，已经证实它们具有良好的“分子伴侣”和免疫佐剂的效应，能和多种肿瘤抗原肽结合，参与抗原的提成和加工，是体内肿瘤抗原肽的“分子佐剂”，可在体内诱导特异性主动免疫[1，2] 。目前有关人食管癌组织HSP70和grp94表达研究的报道较少，本次研究以检测人食管癌组织HSP70和grp94的表达为起始，分析其在食管癌细胞中表达特点，为以后食管癌抗原肽肿瘤疫苗的提取和免疫研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 组织标本和试剂 1999～2002年人食管鳞癌组织标本由首都医科大学病理教研室和首都医科大学附属友谊医院提供，经中性福尔马林固定，石蜡包埋，超薄切片，保存备用;SABC试剂盒购自中山生物公司;鼠抗人HSP70和grp94IgG单克隆抗体由Santa公司提供;细胞图像分析系统为北京航空航天大学产品。
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1.2 SABC法检测HSP70和grp94在人食管癌组织的表达 组织切片脱蜡至水，3%H 2 O 2 封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤;2%羊血清封闭非特异性位点，加入鼠抗人HSP70或grp94IgG单克隆抗体(1:100)，4℃孵育过夜;次日PBS漂洗3次，加入生物素标记羊抗鼠IgG抗体(1:100)，37℃孵育30min，PBS漂洗，加入HRP标记链霉卵白素(1:100)，37℃孵育30min，充分漂洗，DAB-H 2 O 2 显色，苏木素复染核，脱水透明，中性树脂封片，镜下观察结果。以PBS代替I抗作空白对照，小鼠血清代替I抗作为阴性对照。阳性为黄褐色着染，阴性不着色。免疫组化结果采用多功能图像分析系统采集组织分析食管癌细胞分化程度与HSP70表达强度。
1.3 统计学处理 采用χ 2 检验。
2 结果
2.1 HSP70和grp94在人食管癌组织的表达程度 78例食管鳞癌按WHO肿瘤分级标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，72例食管癌组织中有HSP70不同程度的表达，以胞核表达为主，部分细胞见胞浆表达。分化不同的食管癌组织及癌细胞HSP70的表达强度存在一定的差异。分化Ⅱ～Ⅲ级的食管癌细胞HSP70表达较强，分化较好的Ⅰ级食管癌细胞表达较弱;分化Ⅱ～Ⅲ级的食管癌癌旁组织存在HSP70的较弱表达，分化Ⅰ级的食管癌癌旁组织未见着色。而grp94在癌组织中以胞浆表达为主，胞核表达较少，表达阳性率为71.8%(56/78)，统计学处理显示HSP70和grp94在癌细胞及癌旁组织中的表达存在明显差异。
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2.2 HSP70和grp94在人食管癌组织的表达部位 分化不同的食管癌组织及癌细胞表达分布存在一定的差异，同一食管癌组织不同癌细胞呈现了胞浆、胞核的定位表达，显示了癌组织分化的异质性。见表1，2。
表1 HSP70和grp94在食管癌组织中的表达(略)
表2 食管癌细胞分化与HSP70的表达关系 (略)
3 讨论
近年HSP70和grp94在免疫中的作用日益受到重视。肿瘤细胞自身与机体不相协调的增殖和恶性特征一定程度上与HSP的表达密切相关，HSP70和grp94在肿瘤免疫中充当了双重角色，一方面作为“分子伴侣”参与肿瘤细胞的功能代谢，保护肿瘤细胞免受有害因素的损害;另一方面作为“分子佐剂”，HSP70和grp94成为肿瘤抗原多肽结合的靶载体，在参与肿瘤抗原的免疫反应中充当了举足轻重的角色。
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研究中检测的78例食管癌组织中有92.3%(72/78)HSP70和71.8%(56/78)grp94不同程度的表达，与其癌旁组织的比较存在明确的统计学差异。检测结果发现分化不同的食管癌组织及癌细胞表达分布存在一定的差异，这与肿瘤细胞的异质性密切相关。正常细胞生长发育分化过程中，HSP70和grp94的少量表达受细胞周期的严格调控，而肿瘤细胞中突变基因及其产物的存在刺激HSP70和grp94的合成，使其呈现持续的高诱导表达。同样，正常组织细胞少量表达的HSP70主要定位于胞浆;而肿瘤细胞除胞浆外， 胞核和胞膜均有不同程度的分布 [3，4] 。本次研究中发现食管癌细胞分化与HSP70的表达具有一定关系，统计学处理显示分化程度较低的Ⅲ级食管癌组织HSP70表达较强，分化较成熟的Ⅰ级食管癌组织表达较弱;癌旁组织表达很弱甚至未见着色，进一步显示了癌组织分化的异质性，提示HSP70对于判断食管癌组织的分化程度和患者预后可能有一定的意义。一定程度上，HSP70和grp94在肿瘤细胞异于正常细胞的定位分布反映了癌细胞生物学行为的异常，这与肿瘤自身不断增殖和无限生长的特性相适应，这种异常的表达分布可能在诱导抗肿瘤免疫中起作用。
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HSP70和grp94在肿瘤免疫中的作用已成为研究的热点。国内外一些学者从动物肿瘤如肺癌、结肠癌、黑色素瘤细胞中提取并纯化了HSP70、60和grp94分子，以其作为抗肿瘤免疫小鼠产生保护性免疫反应，小鼠体内不易成瘤;而由正常组织提取的HSP70不能诱发小鼠保护性免疫反应 [5] 。近年研究表明HSP70和grp94免疫效应的发挥依赖于免疫系统的综合作用，涉及到α/βT细胞、γ/δT细胞和NK、LAK样细胞的协同作用，其杀伤肿瘤细胞的效应是通过识别grp94和HSP70递呈的肿瘤抗原肽而激活发挥效应 [3] 。一个有意义的启示就是通过肿瘤组织提取或体外重组的HSP70或grp94-抗原肽复合物，作为疫苗免疫机体，激发机体产生抗肿瘤特异的CTL效应 [6] 。本次研究发现人食管癌组织中HSP70和grp94异质性表达特点，癌细胞以胞核、胞浆表达为主，胞膜表达较少，启示需从癌组织得到足量有效的热休克蛋白疫苗，可以通过体外分离大量培养及癌组织应激处理如热处理、非致死性放射线照射等方法，使肿瘤细胞HSP70和grp94的表达定位重新分布，同时增加其表达量，从而为进一步提取纯化足量的HSP70抗原肽蛋白瘤苗进行抗人食管癌的免疫研究奠定基础。
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参考文献
1 Manjili MH，Wang XY，Park J，et al.Immunotherapy of cancer using heat shock proteins.Front Biosci，2002，7:43-60.
2 Cinpita AM，Peterson M，Kono K，et al.Immunization with heat shock protein70from methylcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell responses.Cancer Immunol Immunother，2002，51:163-170.
3 Ponomarev Ed，Tarasenko TN，Sapozhnikov AM.Splenic cytotoxic cells recognize surface HSP70on culture-adapted EL-4mouse lymphoma cels.Immunol.Lett，2000，74:133-139.
, 百拇医药
4 王小平，刘彦仿，杨守京，等.热休克蛋白70在人肝癌细胞SMMC-7721中的表达规律.临床与实验病理学杂志，2001，4(suppl):1-3.
5 Ishii T，Udono H，Yamano T，et al.Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proˉteins hsp70，hsp90and gp96.J Immunol，1999，162:1303-1309.
6 王小平，刘彦仿，杨守京，等.热休克蛋白70复合物抗人肝癌免疫的实验研究.美国中华医药杂志，2001，7(2):7-9.
ˇ 基金项目:北京市青年骨干教师培养基金资助项目，首都医科大学基础临床合作基金(N0.02-31)
作者单位:100054首都医科大学病理学教研室
(编辑 小川), 百拇医药