骨髓单个核细胞Coombs试验在全血细胞减少症中的意义
【摘要】 目的 了解骨髓单个核细胞直接抗人球蛋白试验(BMMNC-Coombs)对全血细胞减少症鉴别诊断的意义。方法 对30例全血细胞减少症患者进行BMMNC-Coombs试验，流式细胞术检测CD +19 和CD +19 CD +5 表达。聚合酶链反应(PCR)检测TCRVrⅠ-Jr基因重排。结果 30例全血细胞减少症患者，入院后进一步检查有15例分别确诊为阵发性睡眠性血红蛋白尿(2例)、慢性再生障碍性贫血(5例)、骨髓增生异常综合征(5例)、缺铁性贫血(1例)和巨幼细胞贫血(2例)。15例未能明确诊断的全血细胞减少症患者，其中12例显示BMMNC-Coombs试验阳性，其阳性者CD +19 和CD +19 CD +5 的表达明显高于BMMNC-Coombs试验阴性者(P0.01)。BMMNC-Coombs试验检测为阳性者具有TCRVrⅠ-Jr基因重排。结论 部分全血细胞减少症患者可能是由于免疫异常(特别是自身抗体)所介导的造血细胞破坏所致。BMMNC-Coombs试验在全血细胞减少症的鉴别诊断中有重要作用。
, http://www.100md.com
关键词 全血细胞减少症 骨髓单个核细胞 直接抗人球蛋白试验 B淋巴细胞 TCRVrⅠ-Jr基因重排
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)12-1060-02
Significance of Coombs test of bone marrow mononuclear cells for pancytopenia Yuan Liya，Xiao Xibin，Gao Linlin，et al.
Department of Hematology，Jiangxi Institute of Medical Science，Nanchang330006.
【Abstract】 Objective To explore the diagnostic role of direct antiglobinreaction(Commbs test)of bone marˉron mononuclear cells(BMMNC)forpancytopenia.Methods 30patients with pancytopeina were investigated by usˉing BMMNC-Coombs test.The expression of CD +19 and CD +19 CD +5 cells was tested by immunofluorescence flow cytomˉetry.T cell receptor VrI-Jr gene(TCRVrI-Jr)rearrangement detected with polymerase chain reaction.Results 15/30of patients have been diagnosed with PNH(2)、CAA(5)、MDS-RA(5)、IDA(1)and MA(2)after hospitalization.12patients with15uncertain diagnostic pancytopenia showed a positive BMMNC-Coombs test.The expression of CD +19 and CD +19 CD +5 in the patients with positive BMMNC-Coombs test is significantly higher than that with negative BMMNC-Coombs test.The patients with positive BMMNC-Coombs test were endowed with positive TCRVrⅠ-Jr gene rearrangement.Conclusion A subpopulation of the patients with pancytopenia might be caused by abnormal imˉmunity(autoantibody)mediated destruction of hematopoietic cells.BMMNC-Coombs test plays an important role in differentiated diagnosis of pancytopeina.
, 百拇医药
Key words Pancytopenia bone marron mononuclear cells coombs test blymphocytes TCRVrⅠ-Jr gene rearrangenent
我们在临床日常观察到一组表现为全血细胞减少(或一系、二系细胞减少)的病例，而常规检查不符合慢性病贫血、陈发性睡眠性血红蛋白尿、缺铁性贫血、巨幼细胞贫血、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及先天性溶血性贫血。因此，临床医师对此类病人的诊断十分困难。近年来，人们发现此类病人的一部分患者中，虽其外周血红细胞Commbs试验阴性，但其骨髓单个核细胞Coombs(BMMNC-Coombs)试验阳性，提示这部分病人可能存在与异常免疫介导的造血细胞胞破坏有关。邵宗鸿等 [1] 将这类病人称之为免疫相关性全血细胞减少症(imˉmunorelated pancytopenia，IRP)。我们自2002年5月～2003年8月对这类病人进行了BMMNC-Coombs试验，结果也证实有部分患者BMMNC-Coombs试验阳性，现报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例 入院时全血细胞减少或一系、二系减少病例30例，其中男18例，女12例，中位年龄38.6岁(15～58岁)。1.2 BMMNC-Coombs试验
1.2.1 试剂 抗人球蛋白血清购自中国医学院血液学研究所，淋巴细胞分离液购自TBD公司。
1.2.2 骨髓单个核细胞悬液制备 取肝素抗凝骨髓2ml，用灭菌PBS3倍稀释混匀，用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，然后加生理盐水5ml洗涤(1500rpm)，重复洗涤3次，用生理盐水配成5×10 6 /ml细胞悬液待用。
1.2.3 结果判断 取抗人球蛋白血清20μl，对照组用生理盐水20μl，依次加于清洁玻璃片上，再分别加20μl细胞悬液与之混匀，置于37℃水浴30min，低倍光镜下观察结果。结果判定按常规Coombs试验。
, 百拇医药
1.3 CD +19 CD +5 淋巴细胞测定 取患者骨髓150μl，分别加入CD 19 -FITC和CD 5-PE标记的鼠抗人单抗20μl，混匀置于4℃40min，加入2ml红细胞裂解液室温10min，PBS洗涤2遍。最后加200μl10g/L的多聚甲醛固定液混匀，4℃固定30min。流式细胞仪检测CD +19、CD +19 CD +5 细胞的表达率。
1.4 TCR VTI-Jr基因重排检测
1.4.1 DNA抽提 取患者骨髓200μl，用UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(上海生工公司)抽提DNA。
1.4.2 引物 由上海生工公司合成。上游引物为:5’-TCTTCCAACTTGGAAGGGAGA-3’，下游引物为:5’-CCCTCˉTATTACCTTGGAAATG-3’。
, 百拇医药
1.4.3 PCR反应 DNA扩增试验盒购于上海生工公司。在50μl反应体系中含2×PCR混合反应液25μl，引物1和引物2各20pmol/L，Tag酶1.5U。PCR循环95℃预变性5min，第1次PCR93℃50s，54℃1min，72℃1min，5个循环后改为第2次PCR94℃50s，54℃40s，72℃40s，25个循环后，72℃延伸10min。
1.4.4 PCR产物检测 取5μlPCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下观察结果。
2 结果
2.1 BMMNC-Coombs试验阳性率 入院时在院外未明确诊断的全血细胞减少症30例，入院后经过骨髓染色体核型、免疫学检查、溶血等检查，确诊为骨髓增生异常综合征(MDS-RA5例)、缺铁性贫血(IDA1例)、阵发性睡眠性血红蛋白(PNH2例)、慢性再生障碍性贫血(CAA5例)、巨幼细胞性贫血(MA2例)者共15例，而其它15例经各种检查未能明确诊断。在这15例病人中，其中12例患者BMMNC-Coombs试验为阳性。
, 百拇医药
2.2 CD +5 、CD +19 表达率 我们对所有患者均进行了CD +19 和CD +5 CD +19 双标检测，其中BMMNC-Coombs阴性者CD +19 表达率为10.79±5.21%，CD +5 CD +19 双阳性为1.29±0.54%，CD +19 CD +5 双阳占CD +19 比例为11.95%。而BMMNC-Coombs阳性者CD+19 26.36±10.86%，CD +5 CD +19 双阳性为6.66±1.36%，CD +19 CD +5 比例为25.26%。Coombs阳性组均高于阴性组，两者比例差异显著(P均<0.01)。
2.3 TCRVrI-Jr基因重排 我们对10例BMMNC-Coombs阴性和6例阳性患者进行了RCRVrI-Jr基因重排检查，结果显示:6例BMMNC-Coombs阳性患者TCRrI-Jr基因重排均为阳性，而10例BMMNC-Coombs阴性患者TCRVrI-Jr基因重排均为阴性。
, http://www.100md.com
3 讨论Coombs试验分为直接和间断两种，经典的直接Coombs试验是检查被检查者红细胞上是否存在自身抗体，从而用于自身免疫性溶血性贫血的诊断。但有学者 [2，3] 提出自身抗体不仅仅结合于循环红细胞上，而且可结合在骨髓内的有核红细胞上，或者存在针对有核细胞的自身抗体。基于上述思路，和虹等 [4] 采用骨髓单个核细胞进行抗人球蛋白试验，结果发现有一部分全血细胞减少症患者BMMNC-Coombs试验阳性，而其它溶血性检查未见异常，这部分患者临床上无法归于哪一种疾病的诊断。因此，邵宗鸿等将 此类疾病称之为免疫相关性全血细胞减少症(IRP) [1] 。IRP患者可能存在了针对骨髓造血细胞的自身抗体，这种自身抗体结合在BMMNC的细胞膜上而引起骨髓造血细胞破坏，最终导致全血(或一系、二系)细胞减少，我们的实验也证明全血细胞减少症患者的一部分病人BMMNC上存在抗体的现象。
B淋巴细胞与体液免疫有关，如果此类患者产生了针对BMMNC的自身抗体，推测其B淋巴细胞的数量会有改变。我们的实验证明:BMMNC-Coombs试验阳性者，其CD +19 和CD +19 CD +5 表达明显高于Coombs试验阴性者，并且亚群失衡，特别是CD +5 B淋巴细胞明显增多。这与付蓉等报道 [5] 的结果一致。目前认为:CD +5 B淋巴细胞与抗体介导的自身免疫性疾病相关 [6] ，因此，IRP患者体内抗BMMNC自身抗体的产生可能与CD +5 淋巴细胞异常增高有关。
, http://www.100md.com
我们的实验还进一步显示:BMMNC-Coombs试验阳性者存在TCRVrI-Jr基因重排。TCRVrI-Jr重排不仅存在于T细胞，而且在B细胞也同样存在。以往的观点认为淋巴细胞基因重排见于恶性淋巴细胞系肿瘤，但现在的研究证实在某些良性疾病和反应性炎症疾病中也存在淋巴细胞基因重排现象，如慢性GVHD、自身免疫性疾病、EBV和CMV感染等 [7] 。因此，BMMNC-Coombs试验阳性者TCRVrI-Jr基因重排的现象提示此类患者存在异常增生的淋巴细胞克隆。
从上可知，BMMNC-Coombs试验有助于全血细胞减少症的鉴别诊断，邵宗鸿等 [1] 已将常规检查阴性而BMMNC-Coombs试验阳性者称为IRP，由于这类患者对糖皮质激素和环孢素A等治疗效果较好，因此，提高对IRP的认识十分重要。
参考文献
1 邵宗鸿，和虹，刘鸿，等.与异常免疫相关的全血细胞减少症.中华血液学杂志，2001，22:79-82.
, 百拇医药
2 Herro R，Clark M，Smith S.An antibody with activity dependent on red cell age in the serum of a patientwith autoimmune hemolytic anemia and a negative direct antiglobulin test.Vax Sang，1987，52:71-74.
3 Liesveld JL，Rowe JM，Lichtman M.Variability of the erythropoietic reˉsponse in autoimmune hemolytic anemia，analysis of109cases.Blood，1987，69:820-826.
4 和虹，邵宗鸿，曹增，等.骨髓单个核细胞抗人球蛋白分型试验.中华血液学杂志，2000，21:550-551.
, http://www.100md.com
5 付蓉，邵宗鸿，和虹，等.免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓B淋巴细胞数量及凋亡相关蛋白水平.中华血液学杂志，2002，23:236-238.
6 Lee KW，Lee SH，Kim HJ，et al.Experimental autoimmune myasthema gravis andCD +5 B-lymphocyte expression.J Korean Med Sci，1999，14:75-79.
7 Hodges E，Krishna MT，Pickard C，et al.Diagnostic role of tests for T cell
receptor(TCR)gene.J Chin Pathol，2003，56:1-11.
(收稿日期:2003-08-18)
(编辑 罗彬)
作者单位:1 330006江西省医学科学研究所血液学研究室
2 330006江西医学院第一附属医院血液科, 百拇医药(袁利亚)
, http://www.100md.com
关键词 全血细胞减少症 骨髓单个核细胞 直接抗人球蛋白试验 B淋巴细胞 TCRVrⅠ-Jr基因重排
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)12-1060-02
Significance of Coombs test of bone marrow mononuclear cells for pancytopenia Yuan Liya，Xiao Xibin，Gao Linlin，et al.
Department of Hematology，Jiangxi Institute of Medical Science，Nanchang330006.
【Abstract】 Objective To explore the diagnostic role of direct antiglobinreaction(Commbs test)of bone marˉron mononuclear cells(BMMNC)forpancytopenia.Methods 30patients with pancytopeina were investigated by usˉing BMMNC-Coombs test.The expression of CD +19 and CD +19 CD +5 cells was tested by immunofluorescence flow cytomˉetry.T cell receptor VrI-Jr gene(TCRVrI-Jr)rearrangement detected with polymerase chain reaction.Results 15/30of patients have been diagnosed with PNH(2)、CAA(5)、MDS-RA(5)、IDA(1)and MA(2)after hospitalization.12patients with15uncertain diagnostic pancytopenia showed a positive BMMNC-Coombs test.The expression of CD +19 and CD +19 CD +5 in the patients with positive BMMNC-Coombs test is significantly higher than that with negative BMMNC-Coombs test.The patients with positive BMMNC-Coombs test were endowed with positive TCRVrⅠ-Jr gene rearrangement.Conclusion A subpopulation of the patients with pancytopenia might be caused by abnormal imˉmunity(autoantibody)mediated destruction of hematopoietic cells.BMMNC-Coombs test plays an important role in differentiated diagnosis of pancytopeina.
, 百拇医药
Key words Pancytopenia bone marron mononuclear cells coombs test blymphocytes TCRVrⅠ-Jr gene rearrangenent
我们在临床日常观察到一组表现为全血细胞减少(或一系、二系细胞减少)的病例，而常规检查不符合慢性病贫血、陈发性睡眠性血红蛋白尿、缺铁性贫血、巨幼细胞贫血、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及先天性溶血性贫血。因此，临床医师对此类病人的诊断十分困难。近年来，人们发现此类病人的一部分患者中，虽其外周血红细胞Commbs试验阴性，但其骨髓单个核细胞Coombs(BMMNC-Coombs)试验阳性，提示这部分病人可能存在与异常免疫介导的造血细胞胞破坏有关。邵宗鸿等 [1] 将这类病人称之为免疫相关性全血细胞减少症(imˉmunorelated pancytopenia，IRP)。我们自2002年5月～2003年8月对这类病人进行了BMMNC-Coombs试验，结果也证实有部分患者BMMNC-Coombs试验阳性，现报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例 入院时全血细胞减少或一系、二系减少病例30例，其中男18例，女12例，中位年龄38.6岁(15～58岁)。1.2 BMMNC-Coombs试验
1.2.1 试剂 抗人球蛋白血清购自中国医学院血液学研究所，淋巴细胞分离液购自TBD公司。
1.2.2 骨髓单个核细胞悬液制备 取肝素抗凝骨髓2ml，用灭菌PBS3倍稀释混匀，用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，然后加生理盐水5ml洗涤(1500rpm)，重复洗涤3次，用生理盐水配成5×10 6 /ml细胞悬液待用。
1.2.3 结果判断 取抗人球蛋白血清20μl，对照组用生理盐水20μl，依次加于清洁玻璃片上，再分别加20μl细胞悬液与之混匀，置于37℃水浴30min，低倍光镜下观察结果。结果判定按常规Coombs试验。
, 百拇医药
1.3 CD +19 CD +5 淋巴细胞测定 取患者骨髓150μl，分别加入CD 19 -FITC和CD 5-PE标记的鼠抗人单抗20μl，混匀置于4℃40min，加入2ml红细胞裂解液室温10min，PBS洗涤2遍。最后加200μl10g/L的多聚甲醛固定液混匀，4℃固定30min。流式细胞仪检测CD +19、CD +19 CD +5 细胞的表达率。
1.4 TCR VTI-Jr基因重排检测
1.4.1 DNA抽提 取患者骨髓200μl，用UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(上海生工公司)抽提DNA。
1.4.2 引物 由上海生工公司合成。上游引物为:5’-TCTTCCAACTTGGAAGGGAGA-3’，下游引物为:5’-CCCTCˉTATTACCTTGGAAATG-3’。
, 百拇医药
1.4.3 PCR反应 DNA扩增试验盒购于上海生工公司。在50μl反应体系中含2×PCR混合反应液25μl，引物1和引物2各20pmol/L，Tag酶1.5U。PCR循环95℃预变性5min，第1次PCR93℃50s，54℃1min，72℃1min，5个循环后改为第2次PCR94℃50s，54℃40s，72℃40s，25个循环后，72℃延伸10min。
1.4.4 PCR产物检测 取5μlPCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下观察结果。
2 结果
2.1 BMMNC-Coombs试验阳性率 入院时在院外未明确诊断的全血细胞减少症30例，入院后经过骨髓染色体核型、免疫学检查、溶血等检查，确诊为骨髓增生异常综合征(MDS-RA5例)、缺铁性贫血(IDA1例)、阵发性睡眠性血红蛋白(PNH2例)、慢性再生障碍性贫血(CAA5例)、巨幼细胞性贫血(MA2例)者共15例，而其它15例经各种检查未能明确诊断。在这15例病人中，其中12例患者BMMNC-Coombs试验为阳性。
, 百拇医药
2.2 CD +5 、CD +19 表达率 我们对所有患者均进行了CD +19 和CD +5 CD +19 双标检测，其中BMMNC-Coombs阴性者CD +19 表达率为10.79±5.21%，CD +5 CD +19 双阳性为1.29±0.54%，CD +19 CD +5 双阳占CD +19 比例为11.95%。而BMMNC-Coombs阳性者CD+19 26.36±10.86%，CD +5 CD +19 双阳性为6.66±1.36%，CD +19 CD +5 比例为25.26%。Coombs阳性组均高于阴性组，两者比例差异显著(P均<0.01)。
2.3 TCRVrI-Jr基因重排 我们对10例BMMNC-Coombs阴性和6例阳性患者进行了RCRVrI-Jr基因重排检查，结果显示:6例BMMNC-Coombs阳性患者TCRrI-Jr基因重排均为阳性，而10例BMMNC-Coombs阴性患者TCRVrI-Jr基因重排均为阴性。
, http://www.100md.com
3 讨论Coombs试验分为直接和间断两种，经典的直接Coombs试验是检查被检查者红细胞上是否存在自身抗体，从而用于自身免疫性溶血性贫血的诊断。但有学者 [2，3] 提出自身抗体不仅仅结合于循环红细胞上，而且可结合在骨髓内的有核红细胞上，或者存在针对有核细胞的自身抗体。基于上述思路，和虹等 [4] 采用骨髓单个核细胞进行抗人球蛋白试验，结果发现有一部分全血细胞减少症患者BMMNC-Coombs试验阳性，而其它溶血性检查未见异常，这部分患者临床上无法归于哪一种疾病的诊断。因此，邵宗鸿等将 此类疾病称之为免疫相关性全血细胞减少症(IRP) [1] 。IRP患者可能存在了针对骨髓造血细胞的自身抗体，这种自身抗体结合在BMMNC的细胞膜上而引起骨髓造血细胞破坏，最终导致全血(或一系、二系)细胞减少，我们的实验也证明全血细胞减少症患者的一部分病人BMMNC上存在抗体的现象。
B淋巴细胞与体液免疫有关，如果此类患者产生了针对BMMNC的自身抗体，推测其B淋巴细胞的数量会有改变。我们的实验证明:BMMNC-Coombs试验阳性者，其CD +19 和CD +19 CD +5 表达明显高于Coombs试验阴性者，并且亚群失衡，特别是CD +5 B淋巴细胞明显增多。这与付蓉等报道 [5] 的结果一致。目前认为:CD +5 B淋巴细胞与抗体介导的自身免疫性疾病相关 [6] ，因此，IRP患者体内抗BMMNC自身抗体的产生可能与CD +5 淋巴细胞异常增高有关。
, http://www.100md.com
我们的实验还进一步显示:BMMNC-Coombs试验阳性者存在TCRVrI-Jr基因重排。TCRVrI-Jr重排不仅存在于T细胞，而且在B细胞也同样存在。以往的观点认为淋巴细胞基因重排见于恶性淋巴细胞系肿瘤，但现在的研究证实在某些良性疾病和反应性炎症疾病中也存在淋巴细胞基因重排现象，如慢性GVHD、自身免疫性疾病、EBV和CMV感染等 [7] 。因此，BMMNC-Coombs试验阳性者TCRVrI-Jr基因重排的现象提示此类患者存在异常增生的淋巴细胞克隆。
从上可知，BMMNC-Coombs试验有助于全血细胞减少症的鉴别诊断，邵宗鸿等 [1] 已将常规检查阴性而BMMNC-Coombs试验阳性者称为IRP，由于这类患者对糖皮质激素和环孢素A等治疗效果较好，因此，提高对IRP的认识十分重要。
参考文献
1 邵宗鸿，和虹，刘鸿，等.与异常免疫相关的全血细胞减少症.中华血液学杂志，2001，22:79-82.
, 百拇医药
2 Herro R，Clark M，Smith S.An antibody with activity dependent on red cell age in the serum of a patientwith autoimmune hemolytic anemia and a negative direct antiglobulin test.Vax Sang，1987，52:71-74.
3 Liesveld JL，Rowe JM，Lichtman M.Variability of the erythropoietic reˉsponse in autoimmune hemolytic anemia，analysis of109cases.Blood，1987，69:820-826.
4 和虹，邵宗鸿，曹增，等.骨髓单个核细胞抗人球蛋白分型试验.中华血液学杂志，2000，21:550-551.
, http://www.100md.com
5 付蓉，邵宗鸿，和虹，等.免疫相关性全血细胞减少症患者骨髓B淋巴细胞数量及凋亡相关蛋白水平.中华血液学杂志，2002，23:236-238.
6 Lee KW，Lee SH，Kim HJ，et al.Experimental autoimmune myasthema gravis andCD +5 B-lymphocyte expression.J Korean Med Sci，1999，14:75-79.
7 Hodges E，Krishna MT，Pickard C，et al.Diagnostic role of tests for T cell
receptor(TCR)gene.J Chin Pathol，2003，56:1-11.
(收稿日期:2003-08-18)
(编辑 罗彬)
作者单位:1 330006江西省医学科学研究所血液学研究室
2 330006江西医学院第一附属医院血液科, 百拇医药(袁利亚)