芍药甙对人肝癌细胞Bel-7402凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响
【摘要】 目的 研究芍药甙诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡的作用及其机制。方法 采用人肝癌细胞Bel-7402和细胞药理学方法，对比观察(阴性无药对照、阳性阿霉素对照)芍药甙对Bel-7402细胞凋亡及凋亡相关调控基因Bax、Bcl-2的影响。原位末端标记方法(TUNEL技术)观察芍药甙诱导Bel-7402细胞凋亡的作用。免疫组织化学染色(SABC)法检测芍药甙对Bax和Bcl-2基因表达的调控。结果 芍药甙0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml处理组Bel-7402细胞凋亡率(%)分别为4.67±0.58、5.33±0.58、9.67±2.08，与无药对照组(1.67±1.53)比较差异有显著性，P<0.05;且芍药甙2mg/ml组凋亡率上升较0.5mg/ml、1mg/ml组明显，P<0.05，呈显著的量效关系;与阳性对照组阿霉素10μmol/L比较，芍药甙2mg/ml诱导Bel-7402凋亡的作用与之相当，P>0.05。芍药甙0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml处理组Bax阳性细胞率(%)分别为29.67±1.53、32.33±2.52、36.67±2.08，较无药对照组(24.00±2.65)明显上调，P<0.05;且Bax阳性细胞率呈浓度依赖性，r=0.998，P<0.05。进一步相关分析亦显示Bax表达与凋亡率有良好的相关性，r=0.9778，P<0.01，经药物作用，凋亡细胞数越多，表达Bax阳性率越高。结论 芍药甙具有诱导Bel-7402细胞凋亡的作用。芍药甙诱导Bel-7402细胞凋亡的作用机制之一可能是上调促凋亡基因Bax的表达。
, 百拇医药
关键词 芍药甙 人肝癌细胞 细胞凋亡 Bax Bcl-2
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)07-0577-03
Studies on effects of paeoniflorin on apoptosis of
Bel-7402and correlative apoptosis regulator Bax and Bcl-2gene
Li Hanmin，Yan Xuesheng，Ming Anping，et al.
Hepatic Institute of HuBei Traiditional Chinese Medicine College，Wuhan430061.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective Study the action of Paeoniflorin on inducing human hepatocarcinoma cell strain Bel-7402to apoptosis in vitro and primarily investigating the mechanism of that action.Methods The model of human hepatocarcinoma cellstrain Bel-7402and the technique of cytopharmacology were adopted.Effects of Paeoniflorin on apotosis of Bel-7402and correlative apoptosis regulator Bax and Bcl-2gene were observed by contrast.That three efficacious concentrations of Paeoniflorin induced Bel-7402to apoptosis after had incubated48hours together were determinated by end labeling method in situ(TUNEL technique).Immunohistochemicalstaining(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC)was applied to detecting adjustment of Bax and Bcl-2gene expression by three efficaˉcious concentrations of Paeoniflorin.Results Apoptosis rate(%)were4.67±0.58，5.33±0.58and9.67±2.08in2mg/ml，1mg/ml and0.5mg/ml Paeoniflorin treat-groups correspondingly，and the differences were remarkable in comparison with which in non-drug control-group(P<0.05).There are apparent rising of apoptosis rate in2mg/ml Paeoniflorin treat-group compared with0.5mg/ml and1mg/ml treat-groups(P<0.05).Effect on inducing apoptosis of2mg/ml Paeoniflorin was equal to that of10μmol/L adriamycin(P>0.05).Postive cell rates of Bax(%)were29.67±1.53，32.33±2.52and36.67±2.08in2mg/ml，1mg/ml and0.5mg/ml Paeoniflorin treat-groups correspondingly，and those were up-regulated evidently in comparison with which in non-drug control-group(P<0.05).Furthermore，positive cell rate of Bax had a dependence relationship with concentration(r=0.998，P<0.05).The level of Bcl-2gene expression was down-regulated without significance(P>0.05).Advanced relationship analysis either indicated that there was good correlation in Bax gene expression with apoptosis rate(r=0.9778，P<0.01).The more apoptotic cells appeared，the higher positive rate of Bax gene expression existed after treated with drugs.This research couldn’tfind apparent mutual relationship of the Bcl-2gene with apoptosis rate.Conclusion Paeoniflorin have action on inducing Bel-7402to apoptosis.That up-regulating the expression of Bax gene as an apoptosis accelerator is probably one mechanism of that action.
, 百拇医药
Key words Paeoniflorin human hepatocarcionma cell apoptosis Bax Bcl-2
抗毒软坚胶囊防治肝炎后肝硬化和肝癌的新药开发研究受湖北省科委“九五”攻关重点科技发展计划项目资助，已完成药学、主要药效学和部分临床观察的研究工作。既往的实验和临床观察结果表明，抗毒软坚胶囊有一定的抗肝纤维化、肝硬化和肝癌的作用，能在一定程度上阻断和逆转肝炎→肝纤维化→肝硬化或(和)肝癌的病程进展。通过进一步研究发现，芍药甙(Paeoniflorin，C 23 H 28 O 11 )是抗毒软坚胶囊的主要有效成分之一，芍药甙对人肝癌细胞株Bel-7402的增殖有显著地抑制作用 [1] 。为进一步考察芍药甙对Bel-7402影响的药理活性，我们对其诱导人肝癌细胞株Bel-7402凋亡的作用及其机制进行了初步研究。
1 材料与方法
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1.1 实验材料
1.1.1 细胞株及主要试剂 人肝癌细胞株Bel-7402由武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心提供。芍药甙标准品，由中国药品生物制品检定所提供(批号:0736-200014)。RPMI1640培养基(Lot NO.1074811)及胎牛血清(Lot NO.1061247)为GIBCO公司产品。注射用盐酸阿霉素，由浙江海正药业股份有限公司生产(批号:浙卫药准字(1996)第135501号)。MTT(Lot921102)由华美生物工程公司提供。HEPES为香港EMERK产品。胰蛋白酶为上海化学试剂厂产品。
1.1.2 主要实验仪器 倒置相差显微镜，为日本Olympus公司产品;CO 2 培养箱(DODEL2300型)，为美国Shellab公司产品。DG3022A型酶联免疫检测仪，由南京华东电子管厂生产。
1.2 实验方法
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1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株Bel-7402接种于含10%胎牛血清，适量HEPES、抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的RPMI1640培养液中，置培养箱于5%CO 2 、37℃充分湿化条件下培养传代。细胞换液时间为2～3天，3～5天传代，0.25%胰蛋白酶消化后1∶2传代。
1.2.2 TUNEL技术检测细胞凋亡
1.2.2.1 细胞爬片分组及制备 24孔培养板每孔置入一块无菌玻片。取对数生长期Bel-7402细胞消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×10 5 /ml，接种于24孔板内1ml/孔。置培养箱24h后，中药组加入芍药甙，终浓度分别为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml，阳性对照组加入阿霉素，终浓度为10μmol/L，无药对照组仅加培养液。以上各组均平行3孔，继续培养48h后，取出爬满细胞的玻片，用PBS漂洗两遍，经4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤后自然风干，-20℃保存备用。
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1.2.2.2 检测方法 取上述细胞爬片以渗透液(0.1%TriˉtonX-100+0.1%-枸橼酸钠)冰上反应2min;滴加50μl新鲜配制的TUNEL混合反应液(含45μl TdT反应缓冲液，5μl荧光素标记的dUTP)，37℃水浴共孵60min。以上各步骤间均以PBS(pH7.4)缓冲液冲洗3次。中性树胶封片。对照实验:以50μl标记液代替TUNEL混合反应液作阴性对照;阳性对照玻片经DNaseⅠ预处理10min后，按TUNEL染色步骤进行。
1.2.2.3 结果判断 荧光显微镜下以450～500nm波长范围激发荧光;在515～565nm波长范围数。以细胞核内出现较强荧光者计为TUNEL阳性细胞。每张玻片随机观察 10个高倍视野(×400倍)，计数阳性细胞占全部癌细胞的比例作为凋亡率(%)。
1.2.3 免疫组织化学(SABC)染色法检测Bax及Bcl-2蛋白表达
1.2.3.1 取上述细胞爬片作下列处理 (1)纯丙酮室温固定15min，蒸馏水冲洗2次;(2)纯甲醇加H 2 O 2 至0.5%，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次;(3)滴加正常山羊血清封闭液，室温20min后，甩去多余液体;(4)分别滴加Bax单抗及Bcl-2多抗，37℃40min;(5)分别滴加生物素化羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG，37℃20min，0.1MPBS洗2min×3次;(6)滴加SABC，37℃20min，0.1MPBS洗5min×4次;(7)DAB显色，蒸馏水洗涤;(8)苏木素轻度复染。酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对照试验;以PBS代替Bax单抗、Bcl-2多抗作阴性对照，用已知乳腺癌阳性切片作为阳性对照。
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1.2.3.2 结果判断 胞浆和(或)胞膜被染成棕褐色判为Bax和Bcl-2阳性细胞。显微镜下每张切片随机选5个高倍视野(×400)，不少于500个肿瘤细胞，计数阳性细胞占全部肿瘤细胞的比例作为Bax和Bcl-2阳性细胞率。
1.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，均数间比较采用t检验，两变量间相互关系采用直线相关分析。
2 结果
2.1 芍药甙对Bel-7402细胞凋亡的影响 见表1。荧光显微镜下，凋亡细胞核呈现较强荧光，部分细胞核碎裂，呈大小不等、形态不规则的碎片，或呈梅花状细胞核。由表1可知，各用药组均能有效诱导Bel-7402细胞凋亡，尤以2mg/ml芍药甙及10μmol/L阿霉素作用显著，P<0.01，且二者诱导凋亡的作用差异无显著性，P>0.05。
表1 芍药甙对肝癌细胞凋亡率的影响 (ˉx±s)略
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2.2 芍药甙对Bax、Bcl-2表达的影响 见表2。Bax、Bcl-2蛋白主要定位于细胞浆，亦可见于胞膜，染色阳性信号呈棕褐色。各药物组Bcl-2表达显色与对照组差别不明显，而Bax表达显色较对照组明显加深，呈强染色，且标本中阳性细胞数明显增多。表2结果亦显示，芍药甙各剂量及阿霉素组均能使Bcl-2表达减少，但差异无显著性，P>0.05;均能明显增强Bax蛋白表达，P<0.05或P<0.01，且呈剂量依赖性，r=0.998，P<0.05。
2.3 芍药甙对Bel-7402细胞凋亡与Bax、Bcl-2表达的相互关系 芍药甙及阿霉素诱导Bel-7402细胞凋亡的同时，Bax及Bcl-2表达水平均发生了相应的变化。直线相关分析显示，Bax表达与凋亡率有良好的相互关系，r=0.9778，P<0.01，经药物作用，凋亡细胞越多，表达Bax阳性率越高;本次实验结果未发现Bcl-2与凋亡率有明显的相互关系。
表2 芍药甙对凋亡相关调控基因Bax、Bcl-2的表达的影响 (ˉx±s)略
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3 讨论
根据目前对肿瘤发生与凋亡关系的认识，诱导肿瘤细胞凋亡，已成为癌症治疗的新策略。蒽环类广谱非特异性抗癌药阿霉素，对人体多种肿瘤诸如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、软组织肿瘤、膀胱癌及恶性淋巴瘤等均有较好的抗癌效应。大量研究表明，具强烈细胞毒性的阿霉素除主要嵌入细胞DNA中干扰转录RNA，对增殖细胞群的各期及静止期的细胞均有杀灭作用外;尚有一定的诱导肿瘤细胞凋亡的作用 [2，3] ，其诱导凋亡的能力同样决定其抗癌疗效。但由于阿霉素骨髓抑制、心脏毒性积累作用、脱发、胃肠道反应等各种毒副反应的存在，限制了阿霉素剂量和疗效的进一步提高。在本实验研究中，芍药甙及阿霉素与人肝癌细胞Bel-7402孵育作用48h后，经原位末端标记检测发现:芍药甙0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml处理组Bel-7402细胞凋亡率(%)分别为4.67±0.58、5.33±0.58、9.67±2.08，与无药对照组(1.67±1.53)比较差异有显著性(P<0.05)，且芍药甙2mg/ml组凋亡率上升较0.5mg/ml、1mg/ml组明显(P<0.05);与阳性对照组阿霉素10μmol/L比较，芍药甙2mg/ml诱导Bel-7402凋亡的作用与之相当(P>0.05)。这种诱导肝癌细胞凋亡和毒性很小的药理作用特点，为将芍药甙开发成安全有效的治疗原发性肝癌的新型中药制剂奠定了 实验基础。
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细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程，涉及一系列基因表达的级联反应。Bcl-2基因家族是哺乳动物细胞中调节凋亡最重要的调控基因之一，在细胞凋亡过程中处于调控机制的终末部分，对维持细胞生理性分化发育和细胞数量的动态平衡，以及肿瘤发生、发展和治疗均产生重大的影响。目前发现Bcl-2基因家族的至少15个成员，促凋亡的成员包括Bax、Bcl-xs、Bad、Bak、Bik、Bid等，抗凋亡的成员包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、A1、MCL-1等。Bax、Bcl-2可彼此形成异二聚体或与自身形成同源二聚体，其抑制或促进凋亡主要取决于两者的比例。当Bax蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，细胞凋亡可被诱导;当Bcl-2蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，细胞凋亡被抑制 [4，5] 。本次实验结果表明，经芍药甙处理的Bel-7402细胞，与无药对照组比较，其Bax基因表达明显上调(P<0.05)，Bcl-2基因表达水平有所下调，但差异无显著性(P>0.05);相关分析亦显示Bax表达与凋亡率有良好的相关性。提示芍药甙诱导Bel-7402细胞凋亡作用机制之一可能是通过上调促凋亡基因Bax表达来实现的。
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参考文献
1 晏雪生，李瀚，彭亚琴，等.芍药甙对人肝癌细胞Bel-7402增殖的影响.中西医结合肝病杂志，2001，11(5):287.
2 穆峰，金吴东，蔡瑞君.阿霉素诱导肺癌细胞凋亡.第二军医大学学报，1999，20(3):161.
3 李陆英，王晓燕，张霆筠，等.阿霉素诱导S-180瘤细胞凋亡核型分析.青岛医学院学报，1997，33(2):103.
4 Vaux DL，Cory S，Adams JM.Bcl-2gene promotes haemopietic cell survival and
cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells.Naˉture，1998，(35)5:440.
5 Reed JC.Bcl-2and the regulation of programmed cell death.J Cell Biˉol，1994，124(2):1.
基金项目:湖北省科委“九五”攻关重点科技发展计划项目(No.鄂96IP1702)及湖北省卫生厅课题(No.鄂卫2000-138)
作者单位:430061湖北中医学院附属医院肝病研究所
(收稿日期:2003-04-15)
(编辑 夫凡), 百拇医药
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关键词 芍药甙 人肝癌细胞 细胞凋亡 Bax Bcl-2
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)07-0577-03
Studies on effects of paeoniflorin on apoptosis of
Bel-7402and correlative apoptosis regulator Bax and Bcl-2gene
Li Hanmin，Yan Xuesheng，Ming Anping，et al.
Hepatic Institute of HuBei Traiditional Chinese Medicine College，Wuhan430061.
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【Abstract】 Objective Study the action of Paeoniflorin on inducing human hepatocarcinoma cell strain Bel-7402to apoptosis in vitro and primarily investigating the mechanism of that action.Methods The model of human hepatocarcinoma cellstrain Bel-7402and the technique of cytopharmacology were adopted.Effects of Paeoniflorin on apotosis of Bel-7402and correlative apoptosis regulator Bax and Bcl-2gene were observed by contrast.That three efficacious concentrations of Paeoniflorin induced Bel-7402to apoptosis after had incubated48hours together were determinated by end labeling method in situ(TUNEL technique).Immunohistochemicalstaining(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC)was applied to detecting adjustment of Bax and Bcl-2gene expression by three efficaˉcious concentrations of Paeoniflorin.Results Apoptosis rate(%)were4.67±0.58，5.33±0.58and9.67±2.08in2mg/ml，1mg/ml and0.5mg/ml Paeoniflorin treat-groups correspondingly，and the differences were remarkable in comparison with which in non-drug control-group(P<0.05).There are apparent rising of apoptosis rate in2mg/ml Paeoniflorin treat-group compared with0.5mg/ml and1mg/ml treat-groups(P<0.05).Effect on inducing apoptosis of2mg/ml Paeoniflorin was equal to that of10μmol/L adriamycin(P>0.05).Postive cell rates of Bax(%)were29.67±1.53，32.33±2.52and36.67±2.08in2mg/ml，1mg/ml and0.5mg/ml Paeoniflorin treat-groups correspondingly，and those were up-regulated evidently in comparison with which in non-drug control-group(P<0.05).Furthermore，positive cell rate of Bax had a dependence relationship with concentration(r=0.998，P<0.05).The level of Bcl-2gene expression was down-regulated without significance(P>0.05).Advanced relationship analysis either indicated that there was good correlation in Bax gene expression with apoptosis rate(r=0.9778，P<0.01).The more apoptotic cells appeared，the higher positive rate of Bax gene expression existed after treated with drugs.This research couldn’tfind apparent mutual relationship of the Bcl-2gene with apoptosis rate.Conclusion Paeoniflorin have action on inducing Bel-7402to apoptosis.That up-regulating the expression of Bax gene as an apoptosis accelerator is probably one mechanism of that action.
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Key words Paeoniflorin human hepatocarcionma cell apoptosis Bax Bcl-2
抗毒软坚胶囊防治肝炎后肝硬化和肝癌的新药开发研究受湖北省科委“九五”攻关重点科技发展计划项目资助，已完成药学、主要药效学和部分临床观察的研究工作。既往的实验和临床观察结果表明，抗毒软坚胶囊有一定的抗肝纤维化、肝硬化和肝癌的作用，能在一定程度上阻断和逆转肝炎→肝纤维化→肝硬化或(和)肝癌的病程进展。通过进一步研究发现，芍药甙(Paeoniflorin，C 23 H 28 O 11 )是抗毒软坚胶囊的主要有效成分之一，芍药甙对人肝癌细胞株Bel-7402的增殖有显著地抑制作用 [1] 。为进一步考察芍药甙对Bel-7402影响的药理活性，我们对其诱导人肝癌细胞株Bel-7402凋亡的作用及其机制进行了初步研究。
1 材料与方法
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1.1 实验材料
1.1.1 细胞株及主要试剂 人肝癌细胞株Bel-7402由武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心提供。芍药甙标准品，由中国药品生物制品检定所提供(批号:0736-200014)。RPMI1640培养基(Lot NO.1074811)及胎牛血清(Lot NO.1061247)为GIBCO公司产品。注射用盐酸阿霉素，由浙江海正药业股份有限公司生产(批号:浙卫药准字(1996)第135501号)。MTT(Lot921102)由华美生物工程公司提供。HEPES为香港EMERK产品。胰蛋白酶为上海化学试剂厂产品。
1.1.2 主要实验仪器 倒置相差显微镜，为日本Olympus公司产品;CO 2 培养箱(DODEL2300型)，为美国Shellab公司产品。DG3022A型酶联免疫检测仪，由南京华东电子管厂生产。
1.2 实验方法
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1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株Bel-7402接种于含10%胎牛血清，适量HEPES、抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的RPMI1640培养液中，置培养箱于5%CO 2 、37℃充分湿化条件下培养传代。细胞换液时间为2～3天，3～5天传代，0.25%胰蛋白酶消化后1∶2传代。
1.2.2 TUNEL技术检测细胞凋亡
1.2.2.1 细胞爬片分组及制备 24孔培养板每孔置入一块无菌玻片。取对数生长期Bel-7402细胞消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×10 5 /ml，接种于24孔板内1ml/孔。置培养箱24h后，中药组加入芍药甙，终浓度分别为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml，阳性对照组加入阿霉素，终浓度为10μmol/L，无药对照组仅加培养液。以上各组均平行3孔，继续培养48h后，取出爬满细胞的玻片，用PBS漂洗两遍，经4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤后自然风干，-20℃保存备用。
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1.2.2.2 检测方法 取上述细胞爬片以渗透液(0.1%TriˉtonX-100+0.1%-枸橼酸钠)冰上反应2min;滴加50μl新鲜配制的TUNEL混合反应液(含45μl TdT反应缓冲液，5μl荧光素标记的dUTP)，37℃水浴共孵60min。以上各步骤间均以PBS(pH7.4)缓冲液冲洗3次。中性树胶封片。对照实验:以50μl标记液代替TUNEL混合反应液作阴性对照;阳性对照玻片经DNaseⅠ预处理10min后，按TUNEL染色步骤进行。
1.2.2.3 结果判断 荧光显微镜下以450～500nm波长范围激发荧光;在515～565nm波长范围数。以细胞核内出现较强荧光者计为TUNEL阳性细胞。每张玻片随机观察 10个高倍视野(×400倍)，计数阳性细胞占全部癌细胞的比例作为凋亡率(%)。
1.2.3 免疫组织化学(SABC)染色法检测Bax及Bcl-2蛋白表达
1.2.3.1 取上述细胞爬片作下列处理 (1)纯丙酮室温固定15min，蒸馏水冲洗2次;(2)纯甲醇加H 2 O 2 至0.5%，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次;(3)滴加正常山羊血清封闭液，室温20min后，甩去多余液体;(4)分别滴加Bax单抗及Bcl-2多抗，37℃40min;(5)分别滴加生物素化羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG，37℃20min，0.1MPBS洗2min×3次;(6)滴加SABC，37℃20min，0.1MPBS洗5min×4次;(7)DAB显色，蒸馏水洗涤;(8)苏木素轻度复染。酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对照试验;以PBS代替Bax单抗、Bcl-2多抗作阴性对照，用已知乳腺癌阳性切片作为阳性对照。
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1.2.3.2 结果判断 胞浆和(或)胞膜被染成棕褐色判为Bax和Bcl-2阳性细胞。显微镜下每张切片随机选5个高倍视野(×400)，不少于500个肿瘤细胞，计数阳性细胞占全部肿瘤细胞的比例作为Bax和Bcl-2阳性细胞率。
1.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，均数间比较采用t检验，两变量间相互关系采用直线相关分析。
2 结果
2.1 芍药甙对Bel-7402细胞凋亡的影响 见表1。荧光显微镜下，凋亡细胞核呈现较强荧光，部分细胞核碎裂，呈大小不等、形态不规则的碎片，或呈梅花状细胞核。由表1可知，各用药组均能有效诱导Bel-7402细胞凋亡，尤以2mg/ml芍药甙及10μmol/L阿霉素作用显著，P<0.01，且二者诱导凋亡的作用差异无显著性，P>0.05。
表1 芍药甙对肝癌细胞凋亡率的影响 (ˉx±s)略
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2.2 芍药甙对Bax、Bcl-2表达的影响 见表2。Bax、Bcl-2蛋白主要定位于细胞浆，亦可见于胞膜，染色阳性信号呈棕褐色。各药物组Bcl-2表达显色与对照组差别不明显，而Bax表达显色较对照组明显加深，呈强染色，且标本中阳性细胞数明显增多。表2结果亦显示，芍药甙各剂量及阿霉素组均能使Bcl-2表达减少，但差异无显著性，P>0.05;均能明显增强Bax蛋白表达，P<0.05或P<0.01，且呈剂量依赖性，r=0.998，P<0.05。
2.3 芍药甙对Bel-7402细胞凋亡与Bax、Bcl-2表达的相互关系 芍药甙及阿霉素诱导Bel-7402细胞凋亡的同时，Bax及Bcl-2表达水平均发生了相应的变化。直线相关分析显示，Bax表达与凋亡率有良好的相互关系，r=0.9778，P<0.01，经药物作用，凋亡细胞越多，表达Bax阳性率越高;本次实验结果未发现Bcl-2与凋亡率有明显的相互关系。
表2 芍药甙对凋亡相关调控基因Bax、Bcl-2的表达的影响 (ˉx±s)略
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3 讨论
根据目前对肿瘤发生与凋亡关系的认识，诱导肿瘤细胞凋亡，已成为癌症治疗的新策略。蒽环类广谱非特异性抗癌药阿霉素，对人体多种肿瘤诸如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、软组织肿瘤、膀胱癌及恶性淋巴瘤等均有较好的抗癌效应。大量研究表明，具强烈细胞毒性的阿霉素除主要嵌入细胞DNA中干扰转录RNA，对增殖细胞群的各期及静止期的细胞均有杀灭作用外;尚有一定的诱导肿瘤细胞凋亡的作用 [2，3] ，其诱导凋亡的能力同样决定其抗癌疗效。但由于阿霉素骨髓抑制、心脏毒性积累作用、脱发、胃肠道反应等各种毒副反应的存在，限制了阿霉素剂量和疗效的进一步提高。在本实验研究中，芍药甙及阿霉素与人肝癌细胞Bel-7402孵育作用48h后，经原位末端标记检测发现:芍药甙0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml处理组Bel-7402细胞凋亡率(%)分别为4.67±0.58、5.33±0.58、9.67±2.08，与无药对照组(1.67±1.53)比较差异有显著性(P<0.05)，且芍药甙2mg/ml组凋亡率上升较0.5mg/ml、1mg/ml组明显(P<0.05);与阳性对照组阿霉素10μmol/L比较，芍药甙2mg/ml诱导Bel-7402凋亡的作用与之相当(P>0.05)。这种诱导肝癌细胞凋亡和毒性很小的药理作用特点，为将芍药甙开发成安全有效的治疗原发性肝癌的新型中药制剂奠定了 实验基础。
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细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程，涉及一系列基因表达的级联反应。Bcl-2基因家族是哺乳动物细胞中调节凋亡最重要的调控基因之一，在细胞凋亡过程中处于调控机制的终末部分，对维持细胞生理性分化发育和细胞数量的动态平衡，以及肿瘤发生、发展和治疗均产生重大的影响。目前发现Bcl-2基因家族的至少15个成员，促凋亡的成员包括Bax、Bcl-xs、Bad、Bak、Bik、Bid等，抗凋亡的成员包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、A1、MCL-1等。Bax、Bcl-2可彼此形成异二聚体或与自身形成同源二聚体，其抑制或促进凋亡主要取决于两者的比例。当Bax蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，细胞凋亡可被诱导;当Bcl-2蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，细胞凋亡被抑制 [4，5] 。本次实验结果表明，经芍药甙处理的Bel-7402细胞，与无药对照组比较，其Bax基因表达明显上调(P<0.05)，Bcl-2基因表达水平有所下调，但差异无显著性(P>0.05);相关分析亦显示Bax表达与凋亡率有良好的相关性。提示芍药甙诱导Bel-7402细胞凋亡作用机制之一可能是通过上调促凋亡基因Bax表达来实现的。
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参考文献
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5 Reed JC.Bcl-2and the regulation of programmed cell death.J Cell Biˉol，1994，124(2):1.
基金项目:湖北省科委“九五”攻关重点科技发展计划项目(No.鄂96IP1702)及湖北省卫生厅课题(No.鄂卫2000-138)
作者单位:430061湖北中医学院附属医院肝病研究所
(收稿日期:2003-04-15)
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