尿中绒毛膜包囊的电镜结构研究
【摘要】 目的 研究尿绒毛膜包囊的电镜结构。方法 分离纯化尿中绒毛膜包囊，用尿绒毛膜酶单克隆抗体将细胞膜包囊免疫沉淀下来，进行电镜结构分析。结果 被免疫沉淀下来的大分子酶，在电镜下显示出许多大小不等的包囊，这些包囊具有典型的脂质双层结构。结论 绒毛膜酶在尿液中的存在形式为细胞膜包囊。
关键词 尿绒毛膜酶 包囊
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)12-1065-02
Research on urinary brush border bundle using electron microscope
Guan Guangju，Cao Yali，Hu Xiaoyan，et al.
Department of Nephrology，The Second Affiliated Hospital，Shan Dong University，Jinan250033.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective Research of urinary brush border bundle using electron microscope.Methods Sepaˉrated and purificated brush border bundle in the urine，immunoprecipitated the bundle using monoclonal antibody，then studied the existence form of the enzyme using electron microscope.Results There were many vesicle of different size under electron microscope，which had typicaldouble-cell-membrane of liposome.Conclusion The existence of brush-border enzyme in urine is vesicle.
, 百拇医药
Key words urinary brush border enzyme vesicle
近年来，尿酶的检测越来越引起临床的重视。正常人尿中有多种酶排出，其中包括尿绒毛膜酶，又称刷状缘酶，主要包括碱性磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶，位于肾小管刷状缘，刷状缘是肾小管重吸收和物质代谢很活跃的部位，对缺血、缺氧和氧自由基等有害刺激十分敏[1]。当存在肾脏损害的因素时，首先对外界刺激进行迅速生物反应的是肾小管刷状缘，导致尿绒毛膜酶在尿中排出增多[2～4] 。可见，尿绒毛膜酶在尿中的变化可以早期反映肾小管的损害，然而，由于目前对尿绒毛膜酶的结构、存在形式等问题尚未研究清楚，所以限制了它的临床应用，本文旨在通过免疫沉淀的方法将尿绒毛膜酶沉淀下来，进行电镜研究，明确其存在形式，为尿绒毛膜酶应用于临床奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 药品、试剂与仪器 JEM-1200EX透射电镜，日本Olympus公司;2%glutardialdehyde;0.1M sodium cacodylate-HCl(pH7.4)，1%蔗糖，2%glutardialdehyde。2%osmiumtetroxide:2%osmium tetroxide，0.1M sodium cacodylate缓冲液。2%wranyl acetate:2%wranyl acetate溶在水中。
1.1.2 对象 正常对照组10例与急性肾小管坏死患者15例。
1.2 方法
1.2.1 分离纯化尿中肾小管上皮细胞包囊 (1)尿液的收集与处理:分别把上述实验对象的尿标本按19∶1的比例加入防腐剂，然后用PEG8000浓缩50倍备用。(2)琼脂糖4B层析柱的制备:选用长1m的层析柱，用琼脂糖4B凝胶装满(16cm×95cm)，用2倍体积的层析缓冲液冲洗平衡，流速为16ml/h。(3)层析:将浓缩的尿样品加到平衡好的层析柱上，用层析缓冲液冲洗，速度为6ml/h，同时收集洗脱的样品，2ml/管，保存所收集的样品。(4)收集液中尿ALP、LAP活性的测定:从每个收集管中取50μl层析收集液，加到96孔酶标板中，再于每孔中加200μl底物缓冲液，加好后，将板置于37℃震荡培养箱中30min，最后酶标板置于酶标仪上测405nm处的光吸收，并以标准曲线来计算酶的活性。
, 百拇医药
1.2.2 细胞包囊的电镜研究
1.2.2.1 免疫沉淀浓缩纯化的细胞膜包囊 经层析分离的细胞膜包囊与抗细胞膜包囊单抗混匀，80μg/ml，37℃培养1h，然后再加入兔抗IgG400μg/ml，37℃再培养1h，用台式微型离心机最大速度离心30min，沉淀抗原抗体复合物，沉淀物用pH8.0培养缓冲液冲洗3次备用,(每次洗后均应离心弃上清)。
1.2.2.2 电镜分析 免疫沉淀得到的抗原抗体复合物用2%glutardialdehyde液在室温下固定2h后用洗液冲洗。复合物再进一步用2%osmium tetroxide液固定2h，然后用2%wranylace tate液处理1h，最后固定的复合物用EPDN包埋，切成Fonm超薄片，用电镜检查。
2 结果
2.1 正常的尿绒毛膜包囊结构 将正常人尿液免疫沉淀后所得到的尿绒毛膜包囊如图1所示。
, http://www.100md.com
2.2 肾小管坏死患者的尿绒毛膜包囊结构 如图2所示。从图中可以看出，破坏的尿绒毛膜包囊膜中磷脂溢出，与胆固醇在水溶液中又组成双脂分子层膜样结构，即磷脂分子厌水端彼此相接，亲水端向外，出现嗜锇性很强的髓鞘图像结构。即图中所示的多层同心圆样膜性结构。
图1 正常的尿绒毛膜包囊结构 (略)
图2 肾小管坏死患者的尿绒毛膜包囊结构(略)
3 讨论
目前关于尿大分子绒毛膜酶国内尚无报道，经文献检索，仅发现了极少的2篇国外文献，而且所用的测定方法是电泳、层析，敏感性较差，费时又不特异。为了研制出具有较高特异性与敏感性的尿绒毛膜酶试剂盒，本文对尿绒毛膜酶在尿中的存在形式进行了研究。
我们首先测定了正常人尿中几种酶的活性，如碱性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、γˉ谷氨酰转肽酶(GGT)等，发现这些酶均存在于正常人尿液中，经凝胶过滤层析后，这些酶均被分成两种形式，即一种大分子的形式，分子量大于100万;另一种为小分子形式，分子量在15～20万之间。根据其分子量大小推测，小分子量的酶可能为游离形式的ALP或LAP，LAP为15万，ALP为20万，而大分子量的酶可能为膜结合形式的酶，即肾小管上皮细胞的碎片或包囊，这种大分子形式的酶即为本文所提到的尿绒毛膜酶。
, 百拇医药
为了证实大分子形式酶的结构，我们利用免疫沉淀的手段将其沉淀下来，并进行了电镜分析，结果显示，被免疫沉淀下来的大分子酶，在电镜下显示出许许多多大小不等的包囊，这些包囊具有典型的脂质双层结构，说明我们分离出的大分子酶是上皮细胞脱落到尿液中的细胞碎片或者是 细胞分泌到尿液中的一个包囊(vesicle)，在这个膜片上带有多种膜结合的酶(ALP、LAP、GGT等)，目前这种包囊的形成机制尚不清楚，可能是上皮细胞正常代谢的过程。肾病病人这种功能降低的原因，可能是肾组织纤维化所致，但游离酶在病人尿中明显升高，这又很难用单纯组织坏死纤维化来解释，很可能，包囊化形成是上皮细胞的一个正常功能，而这个功能在受到损伤的肾上皮细胞中明显降低，与此相反，游离酶的分泌明显增加，其机制尚待研究。
参考文献
1 Idasiak-Piechockal，Krzymanski M.The role of tubulointerstitial changes in progression of kidney function failure in patients with chronˉicglomerulonephritis(GN).Przegl Lek，1996，53(5):443-453.
, 百拇医药
2 Pfaller W，Gstraunthaler G，Willinger CC:Morphology of renal tubular damagefrom nephrotoxins.Toxicol Lett，1990，53:39-43.
3 Etienne J，Nouwen，Marc E，De Broe.Human intestinal versus tissue-nonspecific alkaline phosphatase as complementary urinary markers for the proximal tubule.Kidney Int，1994，46， Supp l47:S-43-47.
4 Bedir A，Ozener IC，Emerk K.Urinary leucine aminopeptidase is a more sensitive indicator!of early renal damage in non-insulin-dependent diabetics than microalbuminuria.Nephron， 1996，74(1):110-113.
基金项目:山东省科技厅计划资助课题(编号为2000BB1CAAA2)
作者单位:1 250033山东大学第二医院
2山东大学医学院(研究生，现在北京朝阳医院)
3山东大学医学院生化教研室
(编辑使 臻), 百拇医药(关广聚)
关键词 尿绒毛膜酶 包囊
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)12-1065-02
Research on urinary brush border bundle using electron microscope
Guan Guangju，Cao Yali，Hu Xiaoyan，et al.
Department of Nephrology，The Second Affiliated Hospital，Shan Dong University，Jinan250033.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective Research of urinary brush border bundle using electron microscope.Methods Sepaˉrated and purificated brush border bundle in the urine，immunoprecipitated the bundle using monoclonal antibody，then studied the existence form of the enzyme using electron microscope.Results There were many vesicle of different size under electron microscope，which had typicaldouble-cell-membrane of liposome.Conclusion The existence of brush-border enzyme in urine is vesicle.
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Key words urinary brush border enzyme vesicle
近年来，尿酶的检测越来越引起临床的重视。正常人尿中有多种酶排出，其中包括尿绒毛膜酶，又称刷状缘酶，主要包括碱性磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶，位于肾小管刷状缘，刷状缘是肾小管重吸收和物质代谢很活跃的部位，对缺血、缺氧和氧自由基等有害刺激十分敏[1]。当存在肾脏损害的因素时，首先对外界刺激进行迅速生物反应的是肾小管刷状缘，导致尿绒毛膜酶在尿中排出增多[2～4] 。可见，尿绒毛膜酶在尿中的变化可以早期反映肾小管的损害，然而，由于目前对尿绒毛膜酶的结构、存在形式等问题尚未研究清楚，所以限制了它的临床应用，本文旨在通过免疫沉淀的方法将尿绒毛膜酶沉淀下来，进行电镜研究，明确其存在形式，为尿绒毛膜酶应用于临床奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 药品、试剂与仪器 JEM-1200EX透射电镜，日本Olympus公司;2%glutardialdehyde;0.1M sodium cacodylate-HCl(pH7.4)，1%蔗糖，2%glutardialdehyde。2%osmiumtetroxide:2%osmium tetroxide，0.1M sodium cacodylate缓冲液。2%wranyl acetate:2%wranyl acetate溶在水中。
1.1.2 对象 正常对照组10例与急性肾小管坏死患者15例。
1.2 方法
1.2.1 分离纯化尿中肾小管上皮细胞包囊 (1)尿液的收集与处理:分别把上述实验对象的尿标本按19∶1的比例加入防腐剂，然后用PEG8000浓缩50倍备用。(2)琼脂糖4B层析柱的制备:选用长1m的层析柱，用琼脂糖4B凝胶装满(16cm×95cm)，用2倍体积的层析缓冲液冲洗平衡，流速为16ml/h。(3)层析:将浓缩的尿样品加到平衡好的层析柱上，用层析缓冲液冲洗，速度为6ml/h，同时收集洗脱的样品，2ml/管，保存所收集的样品。(4)收集液中尿ALP、LAP活性的测定:从每个收集管中取50μl层析收集液，加到96孔酶标板中，再于每孔中加200μl底物缓冲液，加好后，将板置于37℃震荡培养箱中30min，最后酶标板置于酶标仪上测405nm处的光吸收，并以标准曲线来计算酶的活性。
, 百拇医药
1.2.2 细胞包囊的电镜研究
1.2.2.1 免疫沉淀浓缩纯化的细胞膜包囊 经层析分离的细胞膜包囊与抗细胞膜包囊单抗混匀，80μg/ml，37℃培养1h，然后再加入兔抗IgG400μg/ml，37℃再培养1h，用台式微型离心机最大速度离心30min，沉淀抗原抗体复合物，沉淀物用pH8.0培养缓冲液冲洗3次备用,(每次洗后均应离心弃上清)。
1.2.2.2 电镜分析 免疫沉淀得到的抗原抗体复合物用2%glutardialdehyde液在室温下固定2h后用洗液冲洗。复合物再进一步用2%osmium tetroxide液固定2h，然后用2%wranylace tate液处理1h，最后固定的复合物用EPDN包埋，切成Fonm超薄片，用电镜检查。
2 结果
2.1 正常的尿绒毛膜包囊结构 将正常人尿液免疫沉淀后所得到的尿绒毛膜包囊如图1所示。
, http://www.100md.com
2.2 肾小管坏死患者的尿绒毛膜包囊结构 如图2所示。从图中可以看出，破坏的尿绒毛膜包囊膜中磷脂溢出，与胆固醇在水溶液中又组成双脂分子层膜样结构，即磷脂分子厌水端彼此相接，亲水端向外，出现嗜锇性很强的髓鞘图像结构。即图中所示的多层同心圆样膜性结构。
图1 正常的尿绒毛膜包囊结构 (略)
图2 肾小管坏死患者的尿绒毛膜包囊结构(略)
3 讨论
目前关于尿大分子绒毛膜酶国内尚无报道，经文献检索，仅发现了极少的2篇国外文献，而且所用的测定方法是电泳、层析，敏感性较差，费时又不特异。为了研制出具有较高特异性与敏感性的尿绒毛膜酶试剂盒，本文对尿绒毛膜酶在尿中的存在形式进行了研究。
我们首先测定了正常人尿中几种酶的活性，如碱性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、γˉ谷氨酰转肽酶(GGT)等，发现这些酶均存在于正常人尿液中，经凝胶过滤层析后，这些酶均被分成两种形式，即一种大分子的形式，分子量大于100万;另一种为小分子形式，分子量在15～20万之间。根据其分子量大小推测，小分子量的酶可能为游离形式的ALP或LAP，LAP为15万，ALP为20万，而大分子量的酶可能为膜结合形式的酶，即肾小管上皮细胞的碎片或包囊，这种大分子形式的酶即为本文所提到的尿绒毛膜酶。
, 百拇医药
为了证实大分子形式酶的结构，我们利用免疫沉淀的手段将其沉淀下来，并进行了电镜分析，结果显示，被免疫沉淀下来的大分子酶，在电镜下显示出许许多多大小不等的包囊，这些包囊具有典型的脂质双层结构，说明我们分离出的大分子酶是上皮细胞脱落到尿液中的细胞碎片或者是 细胞分泌到尿液中的一个包囊(vesicle)，在这个膜片上带有多种膜结合的酶(ALP、LAP、GGT等)，目前这种包囊的形成机制尚不清楚，可能是上皮细胞正常代谢的过程。肾病病人这种功能降低的原因，可能是肾组织纤维化所致，但游离酶在病人尿中明显升高，这又很难用单纯组织坏死纤维化来解释，很可能，包囊化形成是上皮细胞的一个正常功能，而这个功能在受到损伤的肾上皮细胞中明显降低，与此相反，游离酶的分泌明显增加，其机制尚待研究。
参考文献
1 Idasiak-Piechockal，Krzymanski M.The role of tubulointerstitial changes in progression of kidney function failure in patients with chronˉicglomerulonephritis(GN).Przegl Lek，1996，53(5):443-453.
, 百拇医药
2 Pfaller W，Gstraunthaler G，Willinger CC:Morphology of renal tubular damagefrom nephrotoxins.Toxicol Lett，1990，53:39-43.
3 Etienne J，Nouwen，Marc E，De Broe.Human intestinal versus tissue-nonspecific alkaline phosphatase as complementary urinary markers for the proximal tubule.Kidney Int，1994，46， Supp l47:S-43-47.
4 Bedir A，Ozener IC，Emerk K.Urinary leucine aminopeptidase is a more sensitive indicator!of early renal damage in non-insulin-dependent diabetics than microalbuminuria.Nephron， 1996，74(1):110-113.
基金项目:山东省科技厅计划资助课题(编号为2000BB1CAAA2)
作者单位:1 250033山东大学第二医院
2山东大学医学院(研究生，现在北京朝阳医院)
3山东大学医学院生化教研室
(编辑使 臻), 百拇医药(关广聚)