血浆纤维蛋白单体及降解产物试验中临界值血清的研制 ˇ
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中华中西医杂志 2003年5月 第4卷 第10期
【摘要】 目的 为研制血浆纤维蛋白单体检查如血浆硫酸鱼精蛋白副凝固性试验(Plasma protamine paracoagulation，3P)、纤维蛋白降解产物如FDP(Fibrin degradationproduct，FDP)、D-D(D-Dimer，D-D)胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清。方法 利用血浆纤维蛋白溶解机制和正交试验的原理，选定了提取3P和FDP、D-D胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清的作用时间、稀释滴度及尿激酶的最终浓度。结果 FDP、D-D胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清的作用时间为6h，尿激酶的最终浓度为60U/ml，4℃保存半年、-20℃保存1年;3P试验弱阳性临界值血清的作用时间为8h，尿激酶的最终浓度60U/ml，-20℃稳定3个月。结论 建立了3P和FDP、D-D胶乳凝集试验室内质控用的弱阳性临界值血清的制备方法，同时为室间质评奠定了良好的基础，且操作方法简便易行，无需特殊仪器，有推广应用的前景。
关键词 3P FDP D-D 胶乳凝集 弱阳性临界值血清
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1445-03
Study on weak-positive quality control serum for plasma
fibrin monomer andfibrin degradation product
Wang Hongliang，Rao Jinxiu，Cheng Hui，et al.
Central Hospital of Huangshi，Huangshi435000.
【Abstract】 Objective To determine weak-positive quality control serum for plasma protamine paracogulaˉtion(3p)，fibrin degradation product(FDP)and D-Dimer(D-D)in plasma fibrin monomer test.Methods Using plasma fibrinolytic mechanism and orthogonal test，active time，dilution titer and end concentration of urokinase of weak-positive quality control serum in3P，FDP and D-D were obtained.Results Active time of weak-positive quality control serum in FDP and D-D was6hours，end concentration of urokinase was60copies/ml，valid of6months in4℃，12months in-20℃，similarly，active time of weak-positive quality control serum in3P was8hours，end conˉcentration of urokinase was60copies/ml，valid for3months in20℃.Conclusion The determination of weak-posiˉtive quality control serum for3P，FDP and D-D was constructed successfully for quality control.The technique was simple and easily operated，and it concluded that this method might be a valuabletool.
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Key words plasma protamine paracoagulation fibrin degradation product D-Dimer latex agglutination weak-positive quality control serum
胶乳凝集试验检测纤维蛋白降解产物(Fibrin degradaˉtion product，FDP)、D-二聚体(D-Dimer，D-D)和血浆硫酸鱼精蛋白副凝固性试验(Plasma protamine paracoagulation，3P)因操作简单、无需特殊设备，又具有重要的临床实用价值，已被许多实验室应用。但要保证其实验结果的准确性，特别是不同厂家之间、不同批号之间试剂检测结果的可比性，必须要有严格的室内质量控制措施及稳定的室内质控物 [1] 。FDP、D-D胶乳凝集试验室内质控中，除要有阴性对照、强阳性对照以外，还应有弱阳性对照，但国内尚未制备FDP、D-D弱阳性临界值血清的报道。为此，笔者根据血浆纤维蛋白溶解机制 [2] 和正交
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试验的原理 [3] 研制出同时适合FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验中的弱阳性临界值血清。
1 材料和方法
1.1 试剂 109mmol/L柠檬酸钠溶液、0.025mol/L CaCl 2 溶液(自配)。尿激酶由中美合资黑龙江迪龙制药有限公司提供，1万U/支，批号:00412，010408。10g/L硫酸鱼精蛋白由上海第一生化药业公司，上海生物化学制药厂提供，批号:001031。FDP胶乳凝集测定试剂由武汉中太生物技术有限公司提供，批号:011201，020415。D-D胶乳凝集测定试剂由武汉中太生物技术有限公司提
供，批号:011220，020410。FDP ELISA测定试剂由上海捷门生物技术合作公司提供，批号:010901。D-D ELISA测定试剂由上海捷门生物技术合作公司提供，批号:010701。以上商品试剂均在有效期内使用。
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1.2 仪器 FA1104型电子分析天平由上海天平仪器厂提供，LD24-0.8型离心机由北京医用离心机厂提供，CD1700全自动血液分析仪由美国雅培公司提供，PABER-I型血凝测试仪由北京中勤世帝公司提供，420型恒温水浴箱由江苏金坛市中大仪器厂提供，Denley Dragon MKⅡ型酶标比色计由芬兰提供。
1.3 试验用乏血小板血浆制备 用109mmol/L柠檬酸钠抗凝剂按1:9的比例，采取3～5份正常人混合血浆，以3000r/min速度离心10min，吸取上层血浆，计数血小板数低于10×10 9 /L为乏血小板血浆，并测定血浆纤维蛋白含量在2～4g/L之间，为试验用乏血小板血浆。
1.4 方法 取乏血小板血浆10.0ml，加0.025mol/L CaCl 2 4.0ml，混匀后置37℃水浴10min。血浆完全凝固后，加尿激酶试剂2.0ml。用细玻璃棒稍加捣碎并混匀，继续37℃水浴6h(水浴期间可用细玻璃棒捣碎纤维蛋白凝块数次)。取出混匀，3000r/min离心10min，吸取上层淡黄色透明液体即为FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验用阳性血清，经正交试验以出现凝集的最高稀释滴度确定为弱阳性临界值血清的最终稀释倍数，用无菌生理盐水稀释并加入适量的防腐剂后即为弱阳性临界值血清。
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2 实验结果
2.1 FDP、D-D胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清制备方法中作用时间、尿激酶的最终浓度及凝集滴度的选定 按1.4方法操作，37℃水浴时间分别为1、2、4、6、8、10h，尿激酶的加入最终浓度分别为40、60、85、125、200U/ml，取出上清液分别稀释成1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256等稀释滴度，用每个稀释滴度的样本分别作FDP、D-D胶乳凝集试验，观察其实验结果。发现反应时间6h最佳，尿激酶最终浓度为60U/ml，弱阳性临界值血清的滴度以出现凝集的最高稀释倍数为准(其实验结果见表1、表2、表3)，并利用ELISA技术确定其临界值血清中FDP、D-D的相对含量分别为10mg/L、400μg/L。
2.2 FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清的稳定性观察 按1.4方法，尿激酶最终浓度60U/ml、作用时间6h提取的FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清分别放置于-20℃、4℃、室温保存，每间隔1个月将该血清稀释成1:128后检测一次FDP、D-D的凝集滴度。结果-20℃可稳定1年以上，4℃稳定6个月，室温可保存3个月(其实验结果见表4)。
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表1 不同尿激酶最终浓度作用不同
时间后FDP、D-D的实验结果(略)
表2 不同反应时间与FDP、
D-D阳性血清稀释滴度的实验结果 (略)
表3 不同尿激酶最终浓度与FDP、
D-D阳性血清稀释滴度的实验结果 (略)
2.3 3P试验弱阳性临界值血清的研制
2.3.1 3P试验弱阳性临界值血清制备方法中作用时间、尿激酶的最终浓度选定 按1.4方法操作，37℃水浴时间分别为4、6、8、10、12、24h，尿激酶的加入最终浓度分别为40、60、85、125、200U/ml，取出上清液作3P试验，观察其实验结果。发现反应时间8h最佳，尿激酶最终浓度为60U/ml(其实验结果见表5)。
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2.3.2 3P试验弱阳性临界值血清的稳定性 按1.4方法，尿激酶最终浓度60U/ml、作用时间8h提取3P试验弱阳性临界值血清放置于-20℃保存，每间隔1个月检测一次3P试验，结果-20℃可稳定3个月。
2.4 实验室应用 按1.4方法提取FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验弱阳性临界值血清后，经过两年的临床应用，认为:FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清的应用有利于FDP、D-D胶乳凝集试验室内质量控制的开展，为该项试验提供了一个良性判断的标准。3P试验弱阳性临界值血清的应用为3P试验增添了一项阳性对照，同时为实习生、进修生实验教学提供了阳性标本。
表4 FDP、D-D弱阳性临界值血清稳定性的实验结果 (略)
表5 不同尿激酶最终浓度作用不同时间后3P试验结果 (略)
3 讨论
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血浆纤维蛋白溶解的基本过程是纤溶酶原在各种活化素(如尿激酶、链激酶等)的作用下转变成纤溶酶，然后纤溶酶使纤维蛋白原和纤维蛋白溶解，产生FDP，使凝胶状态的纤维蛋白溶解 [2] 。而血浆D-D是交联纤维蛋白水解的一种特异性降解产物，能准确反映体内纤溶系统的功能状态 [4] 。FDP、D-D的检测不仅对肾移植排斥反应、肾小球肾炎等疾病有重要的实验诊断价值，同时在DIC时，D-D明显升高，可作为DIC的重要早期诊断依据之一。并对自发性纤溶、继发性纤溶以及原发性纤溶有鉴别诊断的作用 [5，6] 。为此，FDP、D-D的检测已逐步成为检验医学的常规项目。
本课题研究表明:提取FDP、D-D胶乳凝集试验用的阳性血清最佳作用时间为6h，其稀释滴度为1:128时仍可出现凝集反应，并利用ELISA技术确定该临界值血清中FDP、D-D的相对含量分别为10mg/L、400μg/L;同时，将提取的阳性血清用无菌生理盐水按1:128稀释加入适量的防 腐剂后，可作为FDP、D-D胶乳凝集试验室内质控中弱阳性临界值血清，也为该试验建立和规范了判断标准。提取FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清的制备方法中加入尿激酶的最终浓度以60U/ml为宜，且该弱阳性临界值血清在4℃存放可稳定半年，-20℃存放稳定1年。
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本课题研究表明:提取3P试验用的阳性血清最佳作用时间为8h，加入尿激酶的最终浓度为60U/ml，-20℃存放可稳定3个月，这样可在相同的操作方法下，延长2h作用时间同时获取FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验的弱阳性临界值血清。
由于抽血不顺利、抗凝不匀、贫血等因素均会导致假阳性结果，而水浴温度低、纤维蛋白原含量过低会造成假阴性结果 [7] 。本课题的研究结果不但提出了FDP、D-D胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清的制备方法，而且为各级临床检验中心组织室间质评活动奠定了良好的基础，由于该方法简便易行，无需特殊仪器和试剂，适合于各级各类实验室应用，有推广应用和开发的前景。
参考文献
1 郑怀竟.临床免疫学检验质量保证.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995，49-50.
2 张绍林.临床检验.第二版.成都:四川科学技术出版社，1994，116.
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3 杨树勤.卫生统计学.第三版.北京:人民卫生出版社，1996，153-154.
4 高勇，唐振华.Ⅱ型糖尿病患者血浆D-二聚体的测定.上海医学检验杂志，2000，15(2):76.
5 周新.医学检验项目临床意义.武汉:湖北科学技术出版社，1997，26.
6 吴健民.实用医学检验参考值和异常结果分析.北京:人民卫生出版社，1998，45-48.
7 李影林.中华医学检验全书.北京:人民卫生出版社，1996，394.
* 基金项目:湖北省科技攻关计划项目(2001AA301C01)作者单位:435000湖北省黄石市中心医院检验科( △ 血液内科)
(编辑 李年令), 百拇医药(汪宏良)
关键词 3P FDP D-D 胶乳凝集 弱阳性临界值血清
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1445-03
Study on weak-positive quality control serum for plasma
fibrin monomer andfibrin degradation product
Wang Hongliang，Rao Jinxiu，Cheng Hui，et al.
Central Hospital of Huangshi，Huangshi435000.
【Abstract】 Objective To determine weak-positive quality control serum for plasma protamine paracogulaˉtion(3p)，fibrin degradation product(FDP)and D-Dimer(D-D)in plasma fibrin monomer test.Methods Using plasma fibrinolytic mechanism and orthogonal test，active time，dilution titer and end concentration of urokinase of weak-positive quality control serum in3P，FDP and D-D were obtained.Results Active time of weak-positive quality control serum in FDP and D-D was6hours，end concentration of urokinase was60copies/ml，valid of6months in4℃，12months in-20℃，similarly，active time of weak-positive quality control serum in3P was8hours，end conˉcentration of urokinase was60copies/ml，valid for3months in20℃.Conclusion The determination of weak-posiˉtive quality control serum for3P，FDP and D-D was constructed successfully for quality control.The technique was simple and easily operated，and it concluded that this method might be a valuabletool.
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Key words plasma protamine paracoagulation fibrin degradation product D-Dimer latex agglutination weak-positive quality control serum
胶乳凝集试验检测纤维蛋白降解产物(Fibrin degradaˉtion product，FDP)、D-二聚体(D-Dimer，D-D)和血浆硫酸鱼精蛋白副凝固性试验(Plasma protamine paracoagulation，3P)因操作简单、无需特殊设备，又具有重要的临床实用价值，已被许多实验室应用。但要保证其实验结果的准确性，特别是不同厂家之间、不同批号之间试剂检测结果的可比性，必须要有严格的室内质量控制措施及稳定的室内质控物 [1] 。FDP、D-D胶乳凝集试验室内质控中，除要有阴性对照、强阳性对照以外，还应有弱阳性对照，但国内尚未制备FDP、D-D弱阳性临界值血清的报道。为此，笔者根据血浆纤维蛋白溶解机制 [2] 和正交
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试验的原理 [3] 研制出同时适合FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验中的弱阳性临界值血清。
1 材料和方法
1.1 试剂 109mmol/L柠檬酸钠溶液、0.025mol/L CaCl 2 溶液(自配)。尿激酶由中美合资黑龙江迪龙制药有限公司提供，1万U/支，批号:00412，010408。10g/L硫酸鱼精蛋白由上海第一生化药业公司，上海生物化学制药厂提供，批号:001031。FDP胶乳凝集测定试剂由武汉中太生物技术有限公司提供，批号:011201，020415。D-D胶乳凝集测定试剂由武汉中太生物技术有限公司提
供，批号:011220，020410。FDP ELISA测定试剂由上海捷门生物技术合作公司提供，批号:010901。D-D ELISA测定试剂由上海捷门生物技术合作公司提供，批号:010701。以上商品试剂均在有效期内使用。
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1.2 仪器 FA1104型电子分析天平由上海天平仪器厂提供，LD24-0.8型离心机由北京医用离心机厂提供，CD1700全自动血液分析仪由美国雅培公司提供，PABER-I型血凝测试仪由北京中勤世帝公司提供，420型恒温水浴箱由江苏金坛市中大仪器厂提供，Denley Dragon MKⅡ型酶标比色计由芬兰提供。
1.3 试验用乏血小板血浆制备 用109mmol/L柠檬酸钠抗凝剂按1:9的比例，采取3～5份正常人混合血浆，以3000r/min速度离心10min，吸取上层血浆，计数血小板数低于10×10 9 /L为乏血小板血浆，并测定血浆纤维蛋白含量在2～4g/L之间，为试验用乏血小板血浆。
1.4 方法 取乏血小板血浆10.0ml，加0.025mol/L CaCl 2 4.0ml，混匀后置37℃水浴10min。血浆完全凝固后，加尿激酶试剂2.0ml。用细玻璃棒稍加捣碎并混匀，继续37℃水浴6h(水浴期间可用细玻璃棒捣碎纤维蛋白凝块数次)。取出混匀，3000r/min离心10min，吸取上层淡黄色透明液体即为FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验用阳性血清，经正交试验以出现凝集的最高稀释滴度确定为弱阳性临界值血清的最终稀释倍数，用无菌生理盐水稀释并加入适量的防腐剂后即为弱阳性临界值血清。
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2 实验结果
2.1 FDP、D-D胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清制备方法中作用时间、尿激酶的最终浓度及凝集滴度的选定 按1.4方法操作，37℃水浴时间分别为1、2、4、6、8、10h，尿激酶的加入最终浓度分别为40、60、85、125、200U/ml，取出上清液分别稀释成1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256等稀释滴度，用每个稀释滴度的样本分别作FDP、D-D胶乳凝集试验，观察其实验结果。发现反应时间6h最佳，尿激酶最终浓度为60U/ml，弱阳性临界值血清的滴度以出现凝集的最高稀释倍数为准(其实验结果见表1、表2、表3)，并利用ELISA技术确定其临界值血清中FDP、D-D的相对含量分别为10mg/L、400μg/L。
2.2 FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清的稳定性观察 按1.4方法，尿激酶最终浓度60U/ml、作用时间6h提取的FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清分别放置于-20℃、4℃、室温保存，每间隔1个月将该血清稀释成1:128后检测一次FDP、D-D的凝集滴度。结果-20℃可稳定1年以上，4℃稳定6个月，室温可保存3个月(其实验结果见表4)。
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表1 不同尿激酶最终浓度作用不同
时间后FDP、D-D的实验结果(略)
表2 不同反应时间与FDP、
D-D阳性血清稀释滴度的实验结果 (略)
表3 不同尿激酶最终浓度与FDP、
D-D阳性血清稀释滴度的实验结果 (略)
2.3 3P试验弱阳性临界值血清的研制
2.3.1 3P试验弱阳性临界值血清制备方法中作用时间、尿激酶的最终浓度选定 按1.4方法操作，37℃水浴时间分别为4、6、8、10、12、24h，尿激酶的加入最终浓度分别为40、60、85、125、200U/ml，取出上清液作3P试验，观察其实验结果。发现反应时间8h最佳，尿激酶最终浓度为60U/ml(其实验结果见表5)。
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2.3.2 3P试验弱阳性临界值血清的稳定性 按1.4方法，尿激酶最终浓度60U/ml、作用时间8h提取3P试验弱阳性临界值血清放置于-20℃保存，每间隔1个月检测一次3P试验，结果-20℃可稳定3个月。
2.4 实验室应用 按1.4方法提取FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验弱阳性临界值血清后，经过两年的临床应用，认为:FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清的应用有利于FDP、D-D胶乳凝集试验室内质量控制的开展，为该项试验提供了一个良性判断的标准。3P试验弱阳性临界值血清的应用为3P试验增添了一项阳性对照，同时为实习生、进修生实验教学提供了阳性标本。
表4 FDP、D-D弱阳性临界值血清稳定性的实验结果 (略)
表5 不同尿激酶最终浓度作用不同时间后3P试验结果 (略)
3 讨论
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血浆纤维蛋白溶解的基本过程是纤溶酶原在各种活化素(如尿激酶、链激酶等)的作用下转变成纤溶酶，然后纤溶酶使纤维蛋白原和纤维蛋白溶解，产生FDP，使凝胶状态的纤维蛋白溶解 [2] 。而血浆D-D是交联纤维蛋白水解的一种特异性降解产物，能准确反映体内纤溶系统的功能状态 [4] 。FDP、D-D的检测不仅对肾移植排斥反应、肾小球肾炎等疾病有重要的实验诊断价值，同时在DIC时，D-D明显升高，可作为DIC的重要早期诊断依据之一。并对自发性纤溶、继发性纤溶以及原发性纤溶有鉴别诊断的作用 [5，6] 。为此，FDP、D-D的检测已逐步成为检验医学的常规项目。
本课题研究表明:提取FDP、D-D胶乳凝集试验用的阳性血清最佳作用时间为6h，其稀释滴度为1:128时仍可出现凝集反应，并利用ELISA技术确定该临界值血清中FDP、D-D的相对含量分别为10mg/L、400μg/L;同时，将提取的阳性血清用无菌生理盐水按1:128稀释加入适量的防 腐剂后，可作为FDP、D-D胶乳凝集试验室内质控中弱阳性临界值血清，也为该试验建立和规范了判断标准。提取FDP、D-D胶乳凝集试验弱阳性临界值血清的制备方法中加入尿激酶的最终浓度以60U/ml为宜，且该弱阳性临界值血清在4℃存放可稳定半年，-20℃存放稳定1年。
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本课题研究表明:提取3P试验用的阳性血清最佳作用时间为8h，加入尿激酶的最终浓度为60U/ml，-20℃存放可稳定3个月，这样可在相同的操作方法下，延长2h作用时间同时获取FDP、D-D胶乳凝集试验和3P试验的弱阳性临界值血清。
由于抽血不顺利、抗凝不匀、贫血等因素均会导致假阳性结果，而水浴温度低、纤维蛋白原含量过低会造成假阴性结果 [7] 。本课题的研究结果不但提出了FDP、D-D胶乳凝集试验中弱阳性临界值血清的制备方法，而且为各级临床检验中心组织室间质评活动奠定了良好的基础，由于该方法简便易行，无需特殊仪器和试剂，适合于各级各类实验室应用，有推广应用和开发的前景。
参考文献
1 郑怀竟.临床免疫学检验质量保证.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995，49-50.
2 张绍林.临床检验.第二版.成都:四川科学技术出版社，1994，116.
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3 杨树勤.卫生统计学.第三版.北京:人民卫生出版社，1996，153-154.
4 高勇，唐振华.Ⅱ型糖尿病患者血浆D-二聚体的测定.上海医学检验杂志，2000，15(2):76.
5 周新.医学检验项目临床意义.武汉:湖北科学技术出版社，1997，26.
6 吴健民.实用医学检验参考值和异常结果分析.北京:人民卫生出版社，1998，45-48.
7 李影林.中华医学检验全书.北京:人民卫生出版社，1996，394.
* 基金项目:湖北省科技攻关计划项目(2001AA301C01)作者单位:435000湖北省黄石市中心医院检验科( △ 血液内科)
(编辑 李年令), 百拇医药(汪宏良)