葛根素对实验性白内障超氧化物歧化酶抑制作用的实验研究
【摘要】 目的 研究葛根素(Puerarin，Pue)对过氧化氢诱导大鼠白内障形成过程中晶体超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的抑制作用，探讨Pue对晶体氧化损伤的保护作用。方法 大鼠晶状体器官离体培养24h后观察晶体混浊情况，并用SOD测定试剂盒检测晶体SOD的含量。结果 H2O2 组晶体全部混浊，对照组、1mmol/L和10mmol/LPue组分别为14.3%，57.1%，35.7%。和对照组比较，H2O2 组SOD的含量明显升高;与H2O2 组比较Pue处理组SOD含量明显降低。结论 Pue可以有效抑制实验性白内障SOD的含量，保护晶状体免受氧化损伤。
关键词 葛根素 超氧化物歧化酶 过氧化氢 白内障 晶状体
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)12-1067-02
, 百拇医药
An experimental study on Pue inhibiting
SOD in experimental cataract
Zhao Hongwei，Tang Luosheng，Li Guodong，et al.
Department of Ophthalmology，the Xiangya Second Affiliated Hospital of CSU，
Hunan Changsha410011.
【Abstract】 Objective To study the effect of Pue on inhibiting SOD in H2O2 -induced rat cataract formaˉtion.To evaluate the effect of Pue on protecting lens against oxidative stress.Methods After vitro rat’s lens organ culture for 24 hours，We examined the level of SOD by using SOD reagent box.Results All lens in H2O2 group deˉveloped cataract;14.3%lens of control group，57.1%lens of1mmol/L Pue group and35.7%lens of10mmol/L Pue group were showed swelling，the levelof SOD was significantly increased in H2O2 group compared with that of control group;the level of SOD was significantly decreased in Pue group compared withthat of H2O2 group.Conclusion Pue could effectively inhibit the level of SOD in experimental cataract and protect lens against oxidative stress.
, 百拇医药
Key wordsPue superoxide dismutase hydrogen peroxide cataract lens
目前认为，氧化损伤是白内障形成的主要因素，如何逆转氧化损伤所致的晶体混浊仍是近年来药物治疗白内障的研究热点。SOD作为晶体抗氧化防御体系中的重要酶促成分，其活性的高低反映着晶体氧化损伤的程度。葛根素(Pue)是从豆科植物的根中提取的一种异黄酮成分，具有抗氧化损伤的作用，对冠状动脉有扩张作用，能保护心肌缺血和心肌缺血-再灌注损伤。实验表明:Pue对氧自由基有清除作用，并能预防性对抗过氧化氢引起的氧化性损伤[1]。本实验研究利用过氧化氢诱导大鼠白内障形成的动物模型，对晶体SOD的含量进行了测定，并用Pue进行干预，为药物预防和治疗白内障提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备 二氧化碳细胞培养箱，显微镜照相机，高速冷冻离心机等。
, 百拇医药
1.2 主要实验试剂与材料 SD大鼠(湘雅附二院实验动物中心提供)，1640培养基(武汉博士的公司提供)，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，Pue(中国药品生物制品检定所提供)。
1.3 晶体培养与筛选 选取体重200～300g正常成年大鼠31只，雌雄不限，0.5%托吡卡胺扩瞳，0.3%氟哌酸洗眼，颈椎脱臼处死，沿角巩膜缘全周剪开角膜，取出晶体，置入含青霉素80万U+庆大霉素8万U的生理盐水500ml中，1min后取出置入含5ml1640培养液的12孔培养板内，每孔1个晶体，于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养6h，选取透明晶体作为下一步实验对象，其中6只晶体可能有不同原因或其他原因致其混浊而被排除在外。
1.4 白内障模型的建立与检测 (1)H2O2 组:将筛选后的透明晶体14只置于12孔培养板内，每孔1个晶体，含1640培养液5ml，另加新鲜配置的3%过氧化氢51μl，使其终浓度为0.9mmol/L[2] 。每6h另加3%过氧化氢41μl以保持浓度相对恒定[3] ，每12h更换1次培养液以确保营养充足。置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养24h。(2)对照组:将筛选后的透明晶体14只置于含1640培养液5ml的12孔培养板内，每孔1个晶体，除不加入过氧化氢外，其余处理同H2O2 组。(3)Pue处理组:用1640培养液分别配置5×10-2 mol/L、5×10-3mol/L的Pue母液，将筛选后的透明晶体28只置于含1640培养液5ml的12孔培养板内，每孔1个晶体，每5个晶体为1个时限组分别加入Pue母液各100μl，使其浓度1mmol/L10mmol/L，每12h更换1次培养液以确保营养充足，同时加每种浓度的Pue母液100μl，其余处理同H2O2组。
, 百拇医药
1.5 SOD的检测 将晶体从培养液中取出后于0.9%生理盐水中漂洗，加入pH7.2的PBS液，冰浴不匀浆5min，制成10%匀浆，以10000r/min、4℃离心10min，取上清液测定各晶体SOD含量。行组间t检验统计学处理。
2 结果
2.1 晶体混浊情况 培养24h后，H2O2 组14只晶体全部呈灰白色混浊。对照组、1mmol/L和10mmol/L Pue组分别有2只、8只和5只呈雾样混浊，其余基本透明。统计学处理，H2O2组和对照组比较，差异有极显著性(P<0.001);与1mmol/L和10mmol/L Pue组比较差异也有显著性(P<0.01)，1mmol/L和10mmol/L Pue组与对照组比较，二者差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.2 SOD测定结果 H2O2 组、对照组、1mmol/L和10mmol/L Pue组晶体SOD平均含(NU/ml)分别为42.448±10.764、147.832±13.258、69.938±12.367、106.914±11.374。统计学处理，H2O2 组SOD含量明显低于对照组(P<0.001)，1mmol/L和10mmol/L Pue组SOD含量明显高于H2O2 组(P<0.01)，二者均低于对照组(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
早已证实，任何能促使自由基产生或增多或对自由基中和作用进行干预的因素都能引起白内障的形成，晶体主要是由上皮细胞和纤维细胞构成的组织，上皮细胞富含细胞器膜，它们多富含多价不饱和脂肪酸(PUFA)，由于这些多双键不饱和脂肪酸所含的是顺式结构，邻近双键的2-甲烯碳和丙烯氢之间的碳氢键间的键能小，处于部分活化状态，易于发生裂解，丙烯氢易被自由基提取，在2-甲烯碳原子上形成自由基中心，导致脂质过氧化连锁反应，对晶体中的蛋白与膜造成氧化性损害。正常晶体存在酶促与非酶促两个抗氧化防御体系，前者主要包括SOD、CAT、GSH-px等，后者包括维生素、氨基酸等。
脂质过氧化物及自由基对晶体抗氧化酶活性具有抑制作用。由于晶体内存在的酶性及非酶性抗氧化防御系统，使正常晶体中脂质过氧化反应程度较低，不能造成晶体的氧化损伤，当自由基产生的量超过晶体抗氧化能力时，晶体 内脂质过氧化物反应增强，早有作者[4]报道，白内障患者晶状体中SOD活性明显下降，且随白内障的发展进一步降低。本研究所测结果与之相符。表明随着自由基大量产生，晶体的脂质过氧化反应增强。
, 百拇医药
晶体混浊是一系列复杂过程的最后阶段，其中氧化作用为主要的激发因素。在老年核性白内障中，伴有对晶体各组成成分的氧化修饰:晶体蛋白的半胱氨酸和蛋氨酸的氧化、还原型谷胱甘肽的氧化、二硫键的形成(包括蛋白与蛋白间;蛋白与自由巯基之间)、蛋白质肽链打开伴有巯基基团暴露、不溶性蛋白质增加、形成蛋白质聚合物、膜的转运功能下降等。因此，采用抗氧化剂逆转氧化损伤导致的晶体成分异常是近年研究的热点。本实验采用中药葛根的有效成分Pue作为干预，探讨Pue抗晶体氧化损伤的作用。实验发现，1mmol/L和10mmol/L Pue组SOD的含量明显高于H2O2 组(P<0.01)。证实Pue可以有效抑制晶体的氧化损伤，减轻过氧化氢引起的晶体脂质过氧化的程度，延缓白内障的发生，为祖国医学药物预防和治疗白内障提供了新的思路。
参考文献
1 朱庆磊，何爱霞，吕欣然.葛根素对氧自由基的消除和抗氧化性损伤作用.解放军药学学报，2001，1701:1-3.
, 百拇医药
2 Spector A，Garner WH.Hydrogen peroxide and human cataract.Exp Eye Res，1981，33:673.
3 Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et al.Lens epithelial cell apotosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.J Cell Biol，1995，130(1):169-181.
4 Fecondo JV.Superoxide dismutase，catalase and glutathione peroxidase in the human cataractouslens.Exp Eye Res，1983，36:15.
作者单位:410011湖南长沙中南大学湘雅二医院眼科
(编辑罗 彬), 百拇医药(赵宏伟)
关键词 葛根素 超氧化物歧化酶 过氧化氢 白内障 晶状体
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)12-1067-02
, 百拇医药
An experimental study on Pue inhibiting
SOD in experimental cataract
Zhao Hongwei，Tang Luosheng，Li Guodong，et al.
Department of Ophthalmology，the Xiangya Second Affiliated Hospital of CSU，
Hunan Changsha410011.
【Abstract】 Objective To study the effect of Pue on inhibiting SOD in H2O2 -induced rat cataract formaˉtion.To evaluate the effect of Pue on protecting lens against oxidative stress.Methods After vitro rat’s lens organ culture for 24 hours，We examined the level of SOD by using SOD reagent box.Results All lens in H2O2 group deˉveloped cataract;14.3%lens of control group，57.1%lens of1mmol/L Pue group and35.7%lens of10mmol/L Pue group were showed swelling，the levelof SOD was significantly increased in H2O2 group compared with that of control group;the level of SOD was significantly decreased in Pue group compared withthat of H2O2 group.Conclusion Pue could effectively inhibit the level of SOD in experimental cataract and protect lens against oxidative stress.
, 百拇医药
Key wordsPue superoxide dismutase hydrogen peroxide cataract lens
目前认为，氧化损伤是白内障形成的主要因素，如何逆转氧化损伤所致的晶体混浊仍是近年来药物治疗白内障的研究热点。SOD作为晶体抗氧化防御体系中的重要酶促成分，其活性的高低反映着晶体氧化损伤的程度。葛根素(Pue)是从豆科植物的根中提取的一种异黄酮成分，具有抗氧化损伤的作用，对冠状动脉有扩张作用，能保护心肌缺血和心肌缺血-再灌注损伤。实验表明:Pue对氧自由基有清除作用，并能预防性对抗过氧化氢引起的氧化性损伤[1]。本实验研究利用过氧化氢诱导大鼠白内障形成的动物模型，对晶体SOD的含量进行了测定，并用Pue进行干预，为药物预防和治疗白内障提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备 二氧化碳细胞培养箱，显微镜照相机，高速冷冻离心机等。
, 百拇医药
1.2 主要实验试剂与材料 SD大鼠(湘雅附二院实验动物中心提供)，1640培养基(武汉博士的公司提供)，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，Pue(中国药品生物制品检定所提供)。
1.3 晶体培养与筛选 选取体重200～300g正常成年大鼠31只，雌雄不限，0.5%托吡卡胺扩瞳，0.3%氟哌酸洗眼，颈椎脱臼处死，沿角巩膜缘全周剪开角膜，取出晶体，置入含青霉素80万U+庆大霉素8万U的生理盐水500ml中，1min后取出置入含5ml1640培养液的12孔培养板内，每孔1个晶体，于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养6h，选取透明晶体作为下一步实验对象，其中6只晶体可能有不同原因或其他原因致其混浊而被排除在外。
1.4 白内障模型的建立与检测 (1)H2O2 组:将筛选后的透明晶体14只置于12孔培养板内，每孔1个晶体，含1640培养液5ml，另加新鲜配置的3%过氧化氢51μl，使其终浓度为0.9mmol/L[2] 。每6h另加3%过氧化氢41μl以保持浓度相对恒定[3] ，每12h更换1次培养液以确保营养充足。置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养24h。(2)对照组:将筛选后的透明晶体14只置于含1640培养液5ml的12孔培养板内，每孔1个晶体，除不加入过氧化氢外，其余处理同H2O2 组。(3)Pue处理组:用1640培养液分别配置5×10-2 mol/L、5×10-3mol/L的Pue母液，将筛选后的透明晶体28只置于含1640培养液5ml的12孔培养板内，每孔1个晶体，每5个晶体为1个时限组分别加入Pue母液各100μl，使其浓度1mmol/L10mmol/L，每12h更换1次培养液以确保营养充足，同时加每种浓度的Pue母液100μl，其余处理同H2O2组。
, 百拇医药
1.5 SOD的检测 将晶体从培养液中取出后于0.9%生理盐水中漂洗，加入pH7.2的PBS液，冰浴不匀浆5min，制成10%匀浆，以10000r/min、4℃离心10min，取上清液测定各晶体SOD含量。行组间t检验统计学处理。
2 结果
2.1 晶体混浊情况 培养24h后，H2O2 组14只晶体全部呈灰白色混浊。对照组、1mmol/L和10mmol/L Pue组分别有2只、8只和5只呈雾样混浊，其余基本透明。统计学处理，H2O2组和对照组比较，差异有极显著性(P<0.001);与1mmol/L和10mmol/L Pue组比较差异也有显著性(P<0.01)，1mmol/L和10mmol/L Pue组与对照组比较，二者差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.2 SOD测定结果 H2O2 组、对照组、1mmol/L和10mmol/L Pue组晶体SOD平均含(NU/ml)分别为42.448±10.764、147.832±13.258、69.938±12.367、106.914±11.374。统计学处理，H2O2 组SOD含量明显低于对照组(P<0.001)，1mmol/L和10mmol/L Pue组SOD含量明显高于H2O2 组(P<0.01)，二者均低于对照组(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
早已证实，任何能促使自由基产生或增多或对自由基中和作用进行干预的因素都能引起白内障的形成，晶体主要是由上皮细胞和纤维细胞构成的组织，上皮细胞富含细胞器膜，它们多富含多价不饱和脂肪酸(PUFA)，由于这些多双键不饱和脂肪酸所含的是顺式结构，邻近双键的2-甲烯碳和丙烯氢之间的碳氢键间的键能小，处于部分活化状态，易于发生裂解，丙烯氢易被自由基提取，在2-甲烯碳原子上形成自由基中心，导致脂质过氧化连锁反应，对晶体中的蛋白与膜造成氧化性损害。正常晶体存在酶促与非酶促两个抗氧化防御体系，前者主要包括SOD、CAT、GSH-px等，后者包括维生素、氨基酸等。
脂质过氧化物及自由基对晶体抗氧化酶活性具有抑制作用。由于晶体内存在的酶性及非酶性抗氧化防御系统，使正常晶体中脂质过氧化反应程度较低，不能造成晶体的氧化损伤，当自由基产生的量超过晶体抗氧化能力时，晶体 内脂质过氧化物反应增强，早有作者[4]报道，白内障患者晶状体中SOD活性明显下降，且随白内障的发展进一步降低。本研究所测结果与之相符。表明随着自由基大量产生，晶体的脂质过氧化反应增强。
, 百拇医药
晶体混浊是一系列复杂过程的最后阶段，其中氧化作用为主要的激发因素。在老年核性白内障中，伴有对晶体各组成成分的氧化修饰:晶体蛋白的半胱氨酸和蛋氨酸的氧化、还原型谷胱甘肽的氧化、二硫键的形成(包括蛋白与蛋白间;蛋白与自由巯基之间)、蛋白质肽链打开伴有巯基基团暴露、不溶性蛋白质增加、形成蛋白质聚合物、膜的转运功能下降等。因此，采用抗氧化剂逆转氧化损伤导致的晶体成分异常是近年研究的热点。本实验采用中药葛根的有效成分Pue作为干预，探讨Pue抗晶体氧化损伤的作用。实验发现，1mmol/L和10mmol/L Pue组SOD的含量明显高于H2O2 组(P<0.01)。证实Pue可以有效抑制晶体的氧化损伤，减轻过氧化氢引起的晶体脂质过氧化的程度，延缓白内障的发生，为祖国医学药物预防和治疗白内障提供了新的思路。
参考文献
1 朱庆磊，何爱霞，吕欣然.葛根素对氧自由基的消除和抗氧化性损伤作用.解放军药学学报，2001，1701:1-3.
, 百拇医药
2 Spector A，Garner WH.Hydrogen peroxide and human cataract.Exp Eye Res，1981，33:673.
3 Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et al.Lens epithelial cell apotosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.J Cell Biol，1995，130(1):169-181.
4 Fecondo JV.Superoxide dismutase，catalase and glutathione peroxidase in the human cataractouslens.Exp Eye Res，1983，36:15.
作者单位:410011湖南长沙中南大学湘雅二医院眼科
(编辑罗 彬), 百拇医药(赵宏伟)