肠复康抑制人结肠癌HT29裸鼠移植瘤血管发生的研究
【摘要】 目的 探讨肠复康抑制人结肠癌HT29裸鼠移植瘤血管发生的作用和机制。方法 建立人结肠癌HT29癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型，采用随机数字表法随机分成3组，模型组8只，肠复康组7只，西药组8只。免疫组化染色结合图像分析系统半定量检测移植瘤微血管密度(MVD)、血管内皮前体细胞(EPC)数及血管内皮生长因子(VEGF)的积分光密度(IOD)，并使用逐步引入剔出模型进行多元线性回归分析。结果 与模型相比，肠复康组可使移植瘤MVD和EPC数目明显减少(P<0.01～0.001)，同时能显著降低瘤细胞VEGF含量(P<0.001)，西药组可明显降低瘤细胞VEGF含量(P<0.01)，但不能使移植瘤MVD和EPC数目减少(P>0.05);回归分析结果，移植瘤MVD与EPC和瘤细胞VEGF含量呈明显正相关(前者r=0.388，P<0.05;后者r=0.705，P<0.001)。结论 肠复康能抑制人结肠癌HT29裸鼠移植瘤血管发生，其机制可能是降低瘤细胞VEGF含量，导致EPC数量减少。
关键词 结肠肿瘤 植物/药用 HT29 小鼠/裸 移植 免疫组织化学
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)08-0673-03
Effect of vasculogenesis of transplant tumor inhibited by
chang-fu-kang on the nude mice by human colon cancer HT29 cells
Wang Yi，Ling Zongyuan，Liu Biqing，et al.
Department of Pathology，Affiliated Hospital of Chengdu
University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu610072.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate effect and mechanisms of vasculogenesis of transplant tumor inhibited by chang-fu-kang on the nude mice by human colon cancer HT29cells.Methods After the model of the transˉplant tumor of subcutanheous tissues located the nude mice was established by human colon cancer HT29，HT29nude mouse were randomly divided into three groups:model group of8mouses，chang-fu-kang group of7mouses and western medicine group of8mouses，the tumor tissues were stained by immunohistochemical methods，then microvascuˉlar density(MVD)and numbers of endothelial progenitor cells(EPC)and integra optical densit(IOD)of vascular enˉdothelial growth factor(VEGF)in the tumor tissues and the cells were semi-quantified by image analysis system.Multiple linear regression was adopted to analyze the results with stepwise method.Results In comparison with the model group，the MVD in the tumor tissues were significantly reduced(P<0.01～0.001)with the numbers of the EPC and the VEGF in the tumor cells decreased in chang-fu-kang group，in the western medicine group，the conˉtents of the VEGF in the tumor tissues were significantly reduced(P<0.01)，but the MVD and the numbers of the EPC were not significantly reduced in that.The MVD in the tumor tissues was significantly correlated with the numbers of the EPC and the contents of the VEGF in the tumor cells(the former，r=0.388，P<0.05;the latter，r=0.705，P<0.001).Conclusion The vasculogenesis of the transplant tumor cells was inhibited in the nude mice by human colon cancer HT29by chang-fu-kang，the mechanisms was possible to reduce the producting of the VEGF，result in reducing of which of the EPC in the tumor cells.
, 百拇医药
Key words colonic neoplasms plants/medicinal HT29cells mice/nude transplantation immunohistoˉchemical
肿瘤的生长和扩散转移与新血管形成密切相关 [1～3] ，实体性肿瘤直径大于2mm时，其进一步的发展必须依赖于新血管形成，这些新生的血管网络系统为肿瘤的生长提供充分的氧和养料，保证了肿瘤细胞快速增殖能力，同时肿瘤实体内微血管的数量与肿瘤转移的潜能成正相关关系。新 血管形成的程度可以反映肿瘤诱导新血管形成的能力 [4～6]。目前应用抗新血管形成法抑制肿瘤的增长和转移已成为治疗恶性肿瘤，提高患者生存时间和生存质量的重要手段。但各种拮抗新血管形成的药物副作用较大，为寻找高效低副作用的抗结肠癌新血管形成作用的中药，我们采用人结肠癌细胞株HT29裸鼠皮下移植瘤模型，观察含喜树果、莪术等中药组成的肠复康口服液对移植瘤血管发生的作用及其初步机制，为临床更好地应用中药抗肿瘤增殖和转移提供实验基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 BALB/c-nu/nu裸鼠(由四川省抗生素研究所动物房提供，合格证:川实动管第90号)，4～6周龄，体重18～22g。
1.1.2 癌细胞株HT29 人结肠癌细胞株HT29(由华西医科大学移植免疫室提供)。
1.1.3 药物 肠复康(由鸦胆子、喜树果、人参、莪术等中药组成)，由我院药厂经醇提取制成，每ml含生药2.24g，于4℃冰箱保存备用;5-氟尿嘧啶(5-Fu)，(江苏南通制药厂，批号:011210)，甲酰四氢叶酸钙(CF，三西普德药业公司，批号:20020101)。
1.2 方法
1.2.1 人结肠癌细胞株HT29裸鼠移植瘤模型的制备及分组 采用人结肠癌细胞株HT29裸鼠腹背侧部皮下注射含5×10 6 癌细胞的悬液0.5ml，成瘤后用组织块套管针法皮下移植为实体瘤。将人结肠癌皮下移植的裸鼠随机分为3组，雌雄各半，(1)模型组:8只，生理盐水10mg/kg灌胃;(2)肠复康组(CFK):7只，以肠复康17.92g/kg灌胃，相当于60kg成人用量的20倍;(3)西药组(5-Fu/CF):8只，5-Fu25mg/kg、CF2mg/kg，腹腔注射液。用药组于移植后第6天开始给药，5-Fu/CF组给药1次/d，共用6天后停药，肠复康组给药1次/d，每给药6天后停1天，共7周，模型组给予生理盐水，时间与肠复康组相同。
, 百拇医药
1.2.2 检测方法
1.2.2.1 移植瘤组织切片及染色 取移植瘤组织于10% 中性甲醛溶液固定48h后，逐级酒精脱水、浸蜡，石蜡包埋，切片3张，切片厚度4μm，分别作免疫组化CD34、VEGF、VEGFR(FLK-1)染色，CD34(克隆号，H-140)、VEGF(克隆号，A-20)及VEGFR(FLK-1，克隆号，A-3)一抗购自SANˉTA公司，相应二抗与试剂盒及阳性对照片购自北京中山生物技术有限公司，操作按说明书进行，DAB显色，另设不加一抗的切片作阴性对照。
1.2.2.2 移植瘤微血管密度(MVD)测定 参照文献 [7，8] ，选用CD34显示血管内皮细胞，首先在低倍视野下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，然后在中倍(200×)视野下计算3个视野的微血管数目，取平均值作为MVD列入分析。
1.2.2.3 移植瘤血管内皮前体细胞(EPC)的计数 [9，10] 采用FLK-1染色切片，首先在200×视野下选择肿瘤间质血管外胞浆内出现棕黄色颗粒的单个核细胞最丰富的区域5个，然后在高倍视野(400×)计数其单个核细胞数目，求取每视野EPC数平均值，作为瘤组织内EPC数目。
, 百拇医药
1.2.2.4 移植瘤细胞内VEGF的检测 [11] VEGF的积分光密度(IOD):在中倍视野下(200×)，选取每张切片中细胞内VEGF着色最明显的10个视野，利用MIAS-2000型图像分析系统(四川大学图形图像研究所)半定量检测染色阳性物质的IOD，求取每视野阳性物质的IOD值，表示VEGF的含量。
1.2.3 统计学方法 所有计量资料经SPSS11.0统计软件包处理，组间比较用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)及S-N-K，并使用逐步引入剔出模型进行多元线性回归分析。
2 结果与分析
镜下可见CD34阳性物质着色于血管内皮细胞浆内， 棕黄色、颗粒状，CD34阳性血管分布不均，分布在瘤细胞巢周围，以移植瘤细胞与正常组织交界处多见。经计数微血管密度(MVD)发现，模型组微血管丰富，而肠复康组和西药组微血管数目不同程度的减少，其中以肠复康组尤为明显(见图1，2)。FLK-1阳性物质分布于移植瘤间质，主要位于血管外单个核细胞浆内，棕黄色、颗粒状，阳性细胞呈圆形、卵圆形及梭形，核呈圆形、卵圆形及梭形，部分梭形细胞处可见管腔形成，模型组阳性细胞多见，肠复康组和西药组有不同程度的减少，以肠复康组明显(见图3，4)。VEGF阳性物质位于瘤细胞浆内，浅黄色、棕黄色、棕褐色，颗粒状，模型组阳性瘤细胞数目多，染色较深，棕黄色、棕褐色，肠复康组和西药组阳性瘤细胞数目减少，染色变浅，浅黄色、棕黄色。各组MVD、EPC数目及VEGF阳性物质积分光密度(IOD)值见表1。
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表1 3组裸鼠移植瘤MVD、EPC 细胞数和瘤细胞VEGF IOD比较 (ˉx±s)略
由表1可见，与模型组相比，肠复康组和西药组均能明显减少移植瘤细胞VEGF的含量(P<0.01～0.001);同时肠复康组能极明显降低移植瘤MVD和EPC细胞数(P<0.01～0.001)，而西药组减少移植瘤MVD和EPC细胞数不明显(P>0.05)。
综合以上指标，采用逐步引入剔出模型进行MVD与EPC细胞数和VEGF IOD多元线性回归分析，结果发现，MVD与EPC细胞数和VEGF IOD呈正相关，前者r=0.388，P<0.05，后者r=0.705，P<0.001，回归方程为:MVD=36.872+2.449×10 -6 ×VEGF IOD。
3 讨论
Kimura [7] 等认为CD34为血管内皮细胞的特异标记，CD34显示血管内皮细胞时，其特异性最高，优于内皮细胞的其它标记物。本实验用CD34显示移植瘤血管内皮，结果发现内皮细胞显示清晰，计数MVD容易。结果显示，肠复康口服液能明显减少移植瘤的MVD，提示其可抗肿瘤新血管形成;而所用对照西药未发现有此效应。
, http://www.100md.com
新血管形成的机制包括两个方面，其一是血管形成，其二是血管发生 [12] 。血管发生(Vasculogenesis)，是动员骨髓源性的血管内皮前体细胞(endothelial progenitor cells，EPC)归巢到缺血组织内，分化成内皮细胞，形成新血管的过程。Asahara [13] 等在成人外周血液中发现并分离出起源于骨髓的EPC，首次证实了出生后血管发生的存在。EPC表达内皮细胞特异性抗原，包括FLK-1/KDR、CD34、CD31等 [9，10] ，而KDR被认为是EPC区别于造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的标志 [14] 。本实验采用FLK-1染色，特异性显示EPC并进行计数，结果发现模型组移植瘤间质内血管外EPC的数目较多，肠复康口服液可明显减少移植瘤间质内血管外EPC的数目，提示肠复康口服液可通过减少瘤组织内EPC数目，抑制血管内皮细胞增多，拮抗瘤组织血管发生，回归分析结果显示瘤组织MVD与EPC数目相关更进一步证实了这一作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可通过3-磷酸肌醇激酶/Akt途径增加循环中的EPC，并可使EPC游走移行活性增加，呈剂量依赖性，促使EPC动员、归巢到缺血组织内，进一步通过激活EPC的有丝分裂活性，使EPC增殖，诱导或促进新血管形成 [15，16] 。本实验最后发现，模型组移植瘤细胞内VEGF的含量高，肠复康口服液可显著降低瘤细胞内VEGF量，回归分析进一步显示移植瘤MVD与VEGF极显著相关，提示肠复康抗血管发生可能通过减少瘤细胞内VEGF量，导致EPC动员、归巢到瘤组织内减少所致。西药组虽可降低VEGF量，但降低EPC归巢的作用不明显，故所用西药无抗肿瘤血管新生的作用。
, 百拇医药
综上所述，肠复康口服液具有抗血管发生的作用，其机制可能是通过降低瘤细胞VEGF量，减少EPC归巢到瘤组织而发挥作用。(本文图片见封三)
参考文献
1 Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis depenˉdent.JNatl Cancer Inst，1990，82:4-6.
2 Hamahan D，Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angioˉgenesis swith during tumorgenesis.Cell，1997，86:354-364.
3 Folkman J.Clinical applications of research on angiogenesis.N Engl J Med，1995，333:1757-1763.
, http://www.100md.com
4 Weidner N，Semple JP，Welch WR，et al.Tumor angiogenesis and metasˉtasis-
correlation in invasive breast carcinoma.N Engl J Med，1991，324:1-8.
5 Weidner N，Folkan J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new signifiˉcant
independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl cancer Inst，1992，84:1857-1887.
6 Kong HL，Crystal RG.Gene therapy strategies for tumor antiangiogeneˉsis.J
, 百拇医药
Natl Cancer Inst，1998，90:273-286.
7 Kimura H，Nakajima T，Kagawa K，et al.Angiogenesis in hepatocellular carcinoma as evaluated by CD34immunohistochemistry.Liver，1998，18:14-19.
8 Weidner N，Folkan J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new signifiˉcant
independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl cancer Inst，1992，84:1857-1887.
9 Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bone marrow origin of enˉdothelial progenitor cells responsible for postnatal vusculogenesis in physiological and
, http://www.100md.com
pathological neovascularization.Circ Res，1999，85(3):221-228.
10 Kalka C，Musuda H，Takahashi T，et al.Transplantation of exvivo exˉpanded endothelial progenitor cell for therapeutic neovascularization.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7):3422-3427.
11 王毅，郑燕林，仝崇毅.水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变增殖膜抑制机制的探讨.中国中医眼科杂志，2002，(4):187-191.
12 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progeniˉtor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275(5302):964-967.
, 百拇医药
13 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progeniˉtor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275(5302):964-967.
14 Cines DB，Pollak ES，Buck CA，et al.Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.Blood，1998，91(10):3527-3561.
15 Dimmeler S，Aicher A，Vasa M，et al.HMG-CoA reductase inhibitors(statins)increase endothelial progenitor cells via the PI3-kinase/Akt pathway.J Clin Invest，2001，108(3):391-397.
, 百拇医药
16 Asahara T，Takahashi T，Masuda H，et al.VEGFcontributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells.EMBO J，1999，18(14):3964-3972.
基金项目:四川省科技厅自然科学基金项目资助(01SY051-35)
作者单位:1 610072成都中医药大学附属医院
2 成都中医药大学护理学院
3 成都中医药大学内科
(收稿日期:2003-09-15)
(编辑 李欣), 百拇医药
关键词 结肠肿瘤 植物/药用 HT29 小鼠/裸 移植 免疫组织化学
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)08-0673-03
Effect of vasculogenesis of transplant tumor inhibited by
chang-fu-kang on the nude mice by human colon cancer HT29 cells
Wang Yi，Ling Zongyuan，Liu Biqing，et al.
Department of Pathology，Affiliated Hospital of Chengdu
University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu610072.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate effect and mechanisms of vasculogenesis of transplant tumor inhibited by chang-fu-kang on the nude mice by human colon cancer HT29cells.Methods After the model of the transˉplant tumor of subcutanheous tissues located the nude mice was established by human colon cancer HT29，HT29nude mouse were randomly divided into three groups:model group of8mouses，chang-fu-kang group of7mouses and western medicine group of8mouses，the tumor tissues were stained by immunohistochemical methods，then microvascuˉlar density(MVD)and numbers of endothelial progenitor cells(EPC)and integra optical densit(IOD)of vascular enˉdothelial growth factor(VEGF)in the tumor tissues and the cells were semi-quantified by image analysis system.Multiple linear regression was adopted to analyze the results with stepwise method.Results In comparison with the model group，the MVD in the tumor tissues were significantly reduced(P<0.01～0.001)with the numbers of the EPC and the VEGF in the tumor cells decreased in chang-fu-kang group，in the western medicine group，the conˉtents of the VEGF in the tumor tissues were significantly reduced(P<0.01)，but the MVD and the numbers of the EPC were not significantly reduced in that.The MVD in the tumor tissues was significantly correlated with the numbers of the EPC and the contents of the VEGF in the tumor cells(the former，r=0.388，P<0.05;the latter，r=0.705，P<0.001).Conclusion The vasculogenesis of the transplant tumor cells was inhibited in the nude mice by human colon cancer HT29by chang-fu-kang，the mechanisms was possible to reduce the producting of the VEGF，result in reducing of which of the EPC in the tumor cells.
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Key words colonic neoplasms plants/medicinal HT29cells mice/nude transplantation immunohistoˉchemical
肿瘤的生长和扩散转移与新血管形成密切相关 [1～3] ，实体性肿瘤直径大于2mm时，其进一步的发展必须依赖于新血管形成，这些新生的血管网络系统为肿瘤的生长提供充分的氧和养料，保证了肿瘤细胞快速增殖能力，同时肿瘤实体内微血管的数量与肿瘤转移的潜能成正相关关系。新 血管形成的程度可以反映肿瘤诱导新血管形成的能力 [4～6]。目前应用抗新血管形成法抑制肿瘤的增长和转移已成为治疗恶性肿瘤，提高患者生存时间和生存质量的重要手段。但各种拮抗新血管形成的药物副作用较大，为寻找高效低副作用的抗结肠癌新血管形成作用的中药，我们采用人结肠癌细胞株HT29裸鼠皮下移植瘤模型，观察含喜树果、莪术等中药组成的肠复康口服液对移植瘤血管发生的作用及其初步机制，为临床更好地应用中药抗肿瘤增殖和转移提供实验基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 BALB/c-nu/nu裸鼠(由四川省抗生素研究所动物房提供，合格证:川实动管第90号)，4～6周龄，体重18～22g。
1.1.2 癌细胞株HT29 人结肠癌细胞株HT29(由华西医科大学移植免疫室提供)。
1.1.3 药物 肠复康(由鸦胆子、喜树果、人参、莪术等中药组成)，由我院药厂经醇提取制成，每ml含生药2.24g，于4℃冰箱保存备用;5-氟尿嘧啶(5-Fu)，(江苏南通制药厂，批号:011210)，甲酰四氢叶酸钙(CF，三西普德药业公司，批号:20020101)。
1.2 方法
1.2.1 人结肠癌细胞株HT29裸鼠移植瘤模型的制备及分组 采用人结肠癌细胞株HT29裸鼠腹背侧部皮下注射含5×10 6 癌细胞的悬液0.5ml，成瘤后用组织块套管针法皮下移植为实体瘤。将人结肠癌皮下移植的裸鼠随机分为3组，雌雄各半，(1)模型组:8只，生理盐水10mg/kg灌胃;(2)肠复康组(CFK):7只，以肠复康17.92g/kg灌胃，相当于60kg成人用量的20倍;(3)西药组(5-Fu/CF):8只，5-Fu25mg/kg、CF2mg/kg，腹腔注射液。用药组于移植后第6天开始给药，5-Fu/CF组给药1次/d，共用6天后停药，肠复康组给药1次/d，每给药6天后停1天，共7周，模型组给予生理盐水，时间与肠复康组相同。
, 百拇医药
1.2.2 检测方法
1.2.2.1 移植瘤组织切片及染色 取移植瘤组织于10% 中性甲醛溶液固定48h后，逐级酒精脱水、浸蜡，石蜡包埋，切片3张，切片厚度4μm，分别作免疫组化CD34、VEGF、VEGFR(FLK-1)染色，CD34(克隆号，H-140)、VEGF(克隆号，A-20)及VEGFR(FLK-1，克隆号，A-3)一抗购自SANˉTA公司，相应二抗与试剂盒及阳性对照片购自北京中山生物技术有限公司，操作按说明书进行，DAB显色，另设不加一抗的切片作阴性对照。
1.2.2.2 移植瘤微血管密度(MVD)测定 参照文献 [7，8] ，选用CD34显示血管内皮细胞，首先在低倍视野下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，然后在中倍(200×)视野下计算3个视野的微血管数目，取平均值作为MVD列入分析。
1.2.2.3 移植瘤血管内皮前体细胞(EPC)的计数 [9，10] 采用FLK-1染色切片，首先在200×视野下选择肿瘤间质血管外胞浆内出现棕黄色颗粒的单个核细胞最丰富的区域5个，然后在高倍视野(400×)计数其单个核细胞数目，求取每视野EPC数平均值，作为瘤组织内EPC数目。
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1.2.2.4 移植瘤细胞内VEGF的检测 [11] VEGF的积分光密度(IOD):在中倍视野下(200×)，选取每张切片中细胞内VEGF着色最明显的10个视野，利用MIAS-2000型图像分析系统(四川大学图形图像研究所)半定量检测染色阳性物质的IOD，求取每视野阳性物质的IOD值，表示VEGF的含量。
1.2.3 统计学方法 所有计量资料经SPSS11.0统计软件包处理，组间比较用LSD(方差齐)或Tamhane(方差不齐)及S-N-K，并使用逐步引入剔出模型进行多元线性回归分析。
2 结果与分析
镜下可见CD34阳性物质着色于血管内皮细胞浆内， 棕黄色、颗粒状，CD34阳性血管分布不均，分布在瘤细胞巢周围，以移植瘤细胞与正常组织交界处多见。经计数微血管密度(MVD)发现，模型组微血管丰富，而肠复康组和西药组微血管数目不同程度的减少，其中以肠复康组尤为明显(见图1，2)。FLK-1阳性物质分布于移植瘤间质，主要位于血管外单个核细胞浆内，棕黄色、颗粒状，阳性细胞呈圆形、卵圆形及梭形，核呈圆形、卵圆形及梭形，部分梭形细胞处可见管腔形成，模型组阳性细胞多见，肠复康组和西药组有不同程度的减少，以肠复康组明显(见图3，4)。VEGF阳性物质位于瘤细胞浆内，浅黄色、棕黄色、棕褐色，颗粒状，模型组阳性瘤细胞数目多，染色较深，棕黄色、棕褐色，肠复康组和西药组阳性瘤细胞数目减少，染色变浅，浅黄色、棕黄色。各组MVD、EPC数目及VEGF阳性物质积分光密度(IOD)值见表1。
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表1 3组裸鼠移植瘤MVD、EPC 细胞数和瘤细胞VEGF IOD比较 (ˉx±s)略
由表1可见，与模型组相比，肠复康组和西药组均能明显减少移植瘤细胞VEGF的含量(P<0.01～0.001);同时肠复康组能极明显降低移植瘤MVD和EPC细胞数(P<0.01～0.001)，而西药组减少移植瘤MVD和EPC细胞数不明显(P>0.05)。
综合以上指标，采用逐步引入剔出模型进行MVD与EPC细胞数和VEGF IOD多元线性回归分析，结果发现，MVD与EPC细胞数和VEGF IOD呈正相关，前者r=0.388，P<0.05，后者r=0.705，P<0.001，回归方程为:MVD=36.872+2.449×10 -6 ×VEGF IOD。
3 讨论
Kimura [7] 等认为CD34为血管内皮细胞的特异标记，CD34显示血管内皮细胞时，其特异性最高，优于内皮细胞的其它标记物。本实验用CD34显示移植瘤血管内皮，结果发现内皮细胞显示清晰，计数MVD容易。结果显示，肠复康口服液能明显减少移植瘤的MVD，提示其可抗肿瘤新血管形成;而所用对照西药未发现有此效应。
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新血管形成的机制包括两个方面，其一是血管形成，其二是血管发生 [12] 。血管发生(Vasculogenesis)，是动员骨髓源性的血管内皮前体细胞(endothelial progenitor cells，EPC)归巢到缺血组织内，分化成内皮细胞，形成新血管的过程。Asahara [13] 等在成人外周血液中发现并分离出起源于骨髓的EPC，首次证实了出生后血管发生的存在。EPC表达内皮细胞特异性抗原，包括FLK-1/KDR、CD34、CD31等 [9，10] ，而KDR被认为是EPC区别于造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的标志 [14] 。本实验采用FLK-1染色，特异性显示EPC并进行计数，结果发现模型组移植瘤间质内血管外EPC的数目较多，肠复康口服液可明显减少移植瘤间质内血管外EPC的数目，提示肠复康口服液可通过减少瘤组织内EPC数目，抑制血管内皮细胞增多，拮抗瘤组织血管发生，回归分析结果显示瘤组织MVD与EPC数目相关更进一步证实了这一作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可通过3-磷酸肌醇激酶/Akt途径增加循环中的EPC，并可使EPC游走移行活性增加，呈剂量依赖性，促使EPC动员、归巢到缺血组织内，进一步通过激活EPC的有丝分裂活性，使EPC增殖，诱导或促进新血管形成 [15，16] 。本实验最后发现，模型组移植瘤细胞内VEGF的含量高，肠复康口服液可显著降低瘤细胞内VEGF量，回归分析进一步显示移植瘤MVD与VEGF极显著相关，提示肠复康抗血管发生可能通过减少瘤细胞内VEGF量，导致EPC动员、归巢到瘤组织内减少所致。西药组虽可降低VEGF量，但降低EPC归巢的作用不明显，故所用西药无抗肿瘤血管新生的作用。
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综上所述，肠复康口服液具有抗血管发生的作用，其机制可能是通过降低瘤细胞VEGF量，减少EPC归巢到瘤组织而发挥作用。(本文图片见封三)
参考文献
1 Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis depenˉdent.JNatl Cancer Inst，1990，82:4-6.
2 Hamahan D，Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angioˉgenesis swith during tumorgenesis.Cell，1997，86:354-364.
3 Folkman J.Clinical applications of research on angiogenesis.N Engl J Med，1995，333:1757-1763.
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4 Weidner N，Semple JP，Welch WR，et al.Tumor angiogenesis and metasˉtasis-
correlation in invasive breast carcinoma.N Engl J Med，1991，324:1-8.
5 Weidner N，Folkan J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new signifiˉcant
independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl cancer Inst，1992，84:1857-1887.
6 Kong HL，Crystal RG.Gene therapy strategies for tumor antiangiogeneˉsis.J
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7 Kimura H，Nakajima T，Kagawa K，et al.Angiogenesis in hepatocellular carcinoma as evaluated by CD34immunohistochemistry.Liver，1998，18:14-19.
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independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl cancer Inst，1992，84:1857-1887.
9 Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bone marrow origin of enˉdothelial progenitor cells responsible for postnatal vusculogenesis in physiological and
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基金项目:四川省科技厅自然科学基金项目资助(01SY051-35)
作者单位:1 610072成都中医药大学附属医院
2 成都中医药大学护理学院
3 成都中医药大学内科
(收稿日期:2003-09-15)
(编辑 李欣), 百拇医药