银杏内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
【摘要】 目的 观察银杏内酯(ginkgolide，GL)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 采用大脑中动脉栓塞法制作大鼠急性脑缺血再灌注损伤的模型。缺血1h后灌胃给药或生理盐水，继续缺血1h后再灌注24h，观察再灌注后大鼠的神经功能损害改变及评分，取大脑测定脑含水量，2%TTC染色以测量脑梗塞体积。结果 大鼠急性脑缺血再灌注后神经功能损害评分在银杏内酯各剂量组评分均明显低于对照组;GL中剂量(49.5mg/kg)和高剂量(148.5mg/kg)组可显著降低缺血再灌注损伤脑组织含水量，减轻缺血侧脑半球水肿程度;GL各剂量组均显著缩小缺血再灌注侧脑组织梗塞体积。结论 GL对脑缺血再灌注引起的脑损伤具有明显的保护作用。
关键词 银杏内酯 神经行为学评分 脑缺血再灌注损伤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)08-0676-03
Protective effects of ginkgolide on cerebral
, http://www.100md.com
ischemia/reperfusion injury in rats
Sun Lisha，Xu Jiangping，Yang Xuemei.
Department of Pharmacology，First Military Medical University，Guangzhou510515.
【Abstract】 Objective To study the cerebral protective effects of ginkgolide on cerebral ischemia-reperfuˉsion injury in rats.Methods The model of acute
reperfusion injury after cerebral ischemia in rats was made by middle cerebral artery occlusion.One hour after the ischemia occurred，the ginkgolide and Saline were ig to the rats respectiveˉly and the ischemic condition lasted for another hour with a following24hour reperfusion.The neurological grades the neurological grades and cerebral water were measured.The volume of the cerebral infarction by2%TTC stained was estimated.Results The neurological grades with acute reperfusion injury after cerebral ischemia in any of the ginkgolide groups were significantly lower than that in the control group.In ginkalide middle dose(49.5mg/kg)and high dose(148.5mg/kg)groups，ginkgolide could significantly decrease the cerebral water content.Ginkgolide could relieve edema and reduce the volume of cerebral infarction of the impaired brain hemisphere in a dose-dependent manner.Conclusion The ginkgolide has great cerebral protective effects against ischemia/reperfusion injury.
, 百拇医药
Key words ginkgolide neurological grades ischemia/reperfusion injury
急性脑缺血-再灌注损伤可引起严重的神经功能障碍，甚至危及生命。寻找有效的治疗药物及措施，以促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复一直是相关学科研究的重点之一。近年来中药脑保护作用研究也越来越受到重视。既往研究 [1，2] 发现，银杏提取物Egb761对小鼠和大鼠脑缺血损伤均具有保护作用，为进一步研究银杏提取物中各有效成分对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制，本实验中采用大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)，观察银杏内酯(ginkgolide，GL)在急性脑缺血再灌注损伤中的保护作用，并初步探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 银杏内酯(ginkgolide，GL)粉针，白色粉末，总内酯含量经测试达76%，青海巴颜喀拉生物技术有限公司提供，用氧化钠注射液配成所需浓度;杏灵颗粒(银杏叶制剂，批号:010707-4)，上海杏灵科技药业有限公司生产。
, http://www.100md.com
1.2 动物 SD雄性大鼠，体重250±30g，由本校实验动物中心提供。
1.3 模型 参照文献 [3～6] 改进如下，将大鼠用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分支。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4-0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血1h后灌胃给药或灌胃给溶剂对照生理盐水。继续缺血1h后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。存活鼠再灌注24h后，观察大鼠行为变化，进行行为评分。参考Zea Longa的5分制评分标准:0分，正常，无神经损伤症状;1分，不能完全伸展对侧前爪;2分，向外侧转圈;3分，向对侧倾倒;4分，不能自发行走，意识丧失。然后快速断头取鼠大脑。一部分(每组8只)分别称左右脑半球湿重，置160℃烤箱内24h后称干重，按以下公式计算脑组织含水量:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%;一部分(每组8只)在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2%TTC溶液中，37℃孵育30min。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。用求积仪(C63图像分析系统)测出各区面积，并计算梗塞区占全脑的百分比(%)。
, 百拇医药
1.4 分组 动物随机分成5组，模型成功后:(1)假手术组(6只);(2)溶剂对照组:生理盐水按1ml/100g灌胃给药(9只);(3)杏灵颗粒740mg/kg组(6只);(4)GL16.5mg/kg组(7只);(5)GL49.5mg/kg组(6只);(6)GL148.5mg/kg(6只)。在完全缺血前，缺血过程中及再灌注过程中分别静推给药1次。
1.5 数据及统计学处理 实用数据用ˉx±s表示，用SPSS10.0软件ANOVA法进行显著性检验。
2 结果
2.1 GL对行为的影响 假手术组大鼠均无异常症状，神经行为学评分为0。溶剂对照组即栓塞大鼠大脑中动脉制备大鼠局灶性脑缺血2h再灌注24h损伤模型组(脑缺血1h灌胃溶剂)，出现不能完全伸展对侧前爪或向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状，行为评分为1.7±0.8。脑缺血1h即灌胃GL低、中、高3个剂量组均可显著降低神经行为学评分，分别为0.8±0.5、0.5±0.5及0.3±0.4，同溶剂对照组比较差异有显著性(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，降低程度有剂量依赖关系。阳性对照杏灵颗粒组行为评分为0.2±0.3，显著低于溶剂对照组(P<0.05)。表明GL灌胃可显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经损伤症状，见表1。
, 百拇医药
表1 GL对大鼠缺血再灌注的神经病学评分影响 (ˉx±s，n=10)略
2.2 GL对脑组织含水量的影响 溶剂对照组缺血再灌注侧(大脑右半球)的脑组织含水量非常显著高于假手术组(P<0.01)，GL低剂量组的脑组织含水量显著高于假手术组(P<0.05)，低于溶剂对照组，但同溶剂对照组相比差异无显著性(P>0.05);GL中、高两个剂量组和阳性对照组的脑组织含水量显著低于溶剂对照组，见表2。表明GL中剂量(49.5mg/kg)和高剂量(148.5mg/kg)组可显著降低缺血再灌注损伤脑组织含水量，减轻缺血侧脑半球水肿程度。
表2 GL对大鼠缺血再灌注脑组织含水量的影响 (ˉx±s，n=8)略
2.3 GL对脑梗塞体积的影响 假手术组脑组织无梗塞，溶剂对照组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞体积占全脑的36.24%;GL低、中、高3个剂量组和阳性对照杏灵颗粒组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积，与溶剂对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)，分别降低了44.92%，63.25%，86.07%及90.59%;并且高剂量组缩小缺血侧脑组织梗塞体积作用与阳性对照杏灵颗粒组相当，见表3。表明GL对大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用。
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表3 GL对大鼠脑缺血再灌注的脑梗塞体积的影响 (ˉx±s，n=8)略
3 讨论
实验结果表明银杏内酯(GL)能显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的行为症状，减轻损伤侧脑水肿，缩小脑梗塞体积，作用强度有剂量依赖关系，剂量为148.5mg/kg时作用最强。提示GL对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用。
既往研究显示GL是钙通道和血小板活化因子(PAF)的拮抗药 [7，8] ，可降低脑钙含量，拮抗PAF受体，减轻脑水肿，改善局部脑微循环，减少脂质过氧化，改善脑电图，缓解锥体细胞的损伤坏死情况。本研究也从多个方面显示GL对脑缺血再灌注损伤的保护作用，表明银杏内酯作为银杏叶提取物的主要成分可能在急性脑缺血再灌注损伤中起较为重要的作用，为银杏内酯在临床应用中从心血管病的防治 [9，10] 走向脑血管病的防治提供了一定的实验依据。
, http://www.100md.com
参考文献
1 徐江平，李铁军，芮耀诚.银杏叶提取物抑制牛脑微血管内皮细胞表达E-选择素.中草药，1998，29(增刊):59-61.
2 徐江平，芮耀诚.银杏提取物治疗脑血管疾病的基础与临床研究进展.国外医学·老年医学分册，1999，(5):200-203.
3 Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occluˉsion:valuation of the model and development of a neurological examinaˉtion.Stroke，1986，17(3):472-476.
4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery
, http://www.100md.com
occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20(10):84-89.
5 Yanamoto H，Hasbimoto N，Nagato I，et al.Infarct tolerance anainst temˉporary focal ischemia following spreading depression in rat brain.Brain Res，1998，784:239-249.
6 王文安，蔡定芳，吕传真，等.黄芩苷对糖尿病大鼠脑再灌流损伤的影响.中国中西医结合急救杂志，2002，9(2):111-113.
7 邓娟，周华东，陈曼娥，等.局灶性脑缺血-再灌注大鼠神经元DNA氧化损伤的研究.中国危重急救医学，2001，13(8):478-480.
, http://www.100md.com 8 Chung KF，Dent G，McCusker M，et al.Effect of a ginkgolide mixture(BN52063)in antagonising shin and platelet response to platelet actiˉvating factor in man.Lancet，1987，1:248-251.
9 李菲，芮耀诚，陈维洲.银杏叶提取物对溶血磷脂酰胆碱引起的脑微血管损伤的保护作用.中国新药与临床杂志，1998，17(3): 149-151.
10 Smith PF，Maclennan K，Darlington CL.The neuroprotective properties the Ginkgo biloba leaf:a review of the possible relationship to platelet-activating factor(PAF).JEthnopharmacol，1996，50(3):131-139.
作者单位:510515广州第一军医大学药理学教研室
(收稿日期:2003-09-18)
(编辑 梅子), http://www.100md.com(孙莉莎)
关键词 银杏内酯 神经行为学评分 脑缺血再灌注损伤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)08-0676-03
Protective effects of ginkgolide on cerebral
, http://www.100md.com
ischemia/reperfusion injury in rats
Sun Lisha，Xu Jiangping，Yang Xuemei.
Department of Pharmacology，First Military Medical University，Guangzhou510515.
【Abstract】 Objective To study the cerebral protective effects of ginkgolide on cerebral ischemia-reperfuˉsion injury in rats.Methods The model of acute
reperfusion injury after cerebral ischemia in rats was made by middle cerebral artery occlusion.One hour after the ischemia occurred，the ginkgolide and Saline were ig to the rats respectiveˉly and the ischemic condition lasted for another hour with a following24hour reperfusion.The neurological grades the neurological grades and cerebral water were measured.The volume of the cerebral infarction by2%TTC stained was estimated.Results The neurological grades with acute reperfusion injury after cerebral ischemia in any of the ginkgolide groups were significantly lower than that in the control group.In ginkalide middle dose(49.5mg/kg)and high dose(148.5mg/kg)groups，ginkgolide could significantly decrease the cerebral water content.Ginkgolide could relieve edema and reduce the volume of cerebral infarction of the impaired brain hemisphere in a dose-dependent manner.Conclusion The ginkgolide has great cerebral protective effects against ischemia/reperfusion injury.
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Key words ginkgolide neurological grades ischemia/reperfusion injury
急性脑缺血-再灌注损伤可引起严重的神经功能障碍，甚至危及生命。寻找有效的治疗药物及措施，以促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复一直是相关学科研究的重点之一。近年来中药脑保护作用研究也越来越受到重视。既往研究 [1，2] 发现，银杏提取物Egb761对小鼠和大鼠脑缺血损伤均具有保护作用，为进一步研究银杏提取物中各有效成分对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制，本实验中采用大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)，观察银杏内酯(ginkgolide，GL)在急性脑缺血再灌注损伤中的保护作用，并初步探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 银杏内酯(ginkgolide，GL)粉针，白色粉末，总内酯含量经测试达76%，青海巴颜喀拉生物技术有限公司提供，用氧化钠注射液配成所需浓度;杏灵颗粒(银杏叶制剂，批号:010707-4)，上海杏灵科技药业有限公司生产。
, http://www.100md.com
1.2 动物 SD雄性大鼠，体重250±30g，由本校实验动物中心提供。
1.3 模型 参照文献 [3～6] 改进如下，将大鼠用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分支。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4-0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血1h后灌胃给药或灌胃给溶剂对照生理盐水。继续缺血1h后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。存活鼠再灌注24h后，观察大鼠行为变化，进行行为评分。参考Zea Longa的5分制评分标准:0分，正常，无神经损伤症状;1分，不能完全伸展对侧前爪;2分，向外侧转圈;3分，向对侧倾倒;4分，不能自发行走，意识丧失。然后快速断头取鼠大脑。一部分(每组8只)分别称左右脑半球湿重，置160℃烤箱内24h后称干重，按以下公式计算脑组织含水量:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%;一部分(每组8只)在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2%TTC溶液中，37℃孵育30min。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。用求积仪(C63图像分析系统)测出各区面积，并计算梗塞区占全脑的百分比(%)。
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1.4 分组 动物随机分成5组，模型成功后:(1)假手术组(6只);(2)溶剂对照组:生理盐水按1ml/100g灌胃给药(9只);(3)杏灵颗粒740mg/kg组(6只);(4)GL16.5mg/kg组(7只);(5)GL49.5mg/kg组(6只);(6)GL148.5mg/kg(6只)。在完全缺血前，缺血过程中及再灌注过程中分别静推给药1次。
1.5 数据及统计学处理 实用数据用ˉx±s表示，用SPSS10.0软件ANOVA法进行显著性检验。
2 结果
2.1 GL对行为的影响 假手术组大鼠均无异常症状，神经行为学评分为0。溶剂对照组即栓塞大鼠大脑中动脉制备大鼠局灶性脑缺血2h再灌注24h损伤模型组(脑缺血1h灌胃溶剂)，出现不能完全伸展对侧前爪或向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状，行为评分为1.7±0.8。脑缺血1h即灌胃GL低、中、高3个剂量组均可显著降低神经行为学评分，分别为0.8±0.5、0.5±0.5及0.3±0.4，同溶剂对照组比较差异有显著性(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，降低程度有剂量依赖关系。阳性对照杏灵颗粒组行为评分为0.2±0.3，显著低于溶剂对照组(P<0.05)。表明GL灌胃可显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经损伤症状，见表1。
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表1 GL对大鼠缺血再灌注的神经病学评分影响 (ˉx±s，n=10)略
2.2 GL对脑组织含水量的影响 溶剂对照组缺血再灌注侧(大脑右半球)的脑组织含水量非常显著高于假手术组(P<0.01)，GL低剂量组的脑组织含水量显著高于假手术组(P<0.05)，低于溶剂对照组，但同溶剂对照组相比差异无显著性(P>0.05);GL中、高两个剂量组和阳性对照组的脑组织含水量显著低于溶剂对照组，见表2。表明GL中剂量(49.5mg/kg)和高剂量(148.5mg/kg)组可显著降低缺血再灌注损伤脑组织含水量，减轻缺血侧脑半球水肿程度。
表2 GL对大鼠缺血再灌注脑组织含水量的影响 (ˉx±s，n=8)略
2.3 GL对脑梗塞体积的影响 假手术组脑组织无梗塞，溶剂对照组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞体积占全脑的36.24%;GL低、中、高3个剂量组和阳性对照杏灵颗粒组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积，与溶剂对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)，分别降低了44.92%，63.25%，86.07%及90.59%;并且高剂量组缩小缺血侧脑组织梗塞体积作用与阳性对照杏灵颗粒组相当，见表3。表明GL对大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用。
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表3 GL对大鼠脑缺血再灌注的脑梗塞体积的影响 (ˉx±s，n=8)略
3 讨论
实验结果表明银杏内酯(GL)能显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的行为症状，减轻损伤侧脑水肿，缩小脑梗塞体积，作用强度有剂量依赖关系，剂量为148.5mg/kg时作用最强。提示GL对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用。
既往研究显示GL是钙通道和血小板活化因子(PAF)的拮抗药 [7，8] ，可降低脑钙含量，拮抗PAF受体，减轻脑水肿，改善局部脑微循环，减少脂质过氧化，改善脑电图，缓解锥体细胞的损伤坏死情况。本研究也从多个方面显示GL对脑缺血再灌注损伤的保护作用，表明银杏内酯作为银杏叶提取物的主要成分可能在急性脑缺血再灌注损伤中起较为重要的作用，为银杏内酯在临床应用中从心血管病的防治 [9，10] 走向脑血管病的防治提供了一定的实验依据。
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参考文献
1 徐江平，李铁军，芮耀诚.银杏叶提取物抑制牛脑微血管内皮细胞表达E-选择素.中草药，1998，29(增刊):59-61.
2 徐江平，芮耀诚.银杏提取物治疗脑血管疾病的基础与临床研究进展.国外医学·老年医学分册，1999，(5):200-203.
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4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery
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7 邓娟，周华东，陈曼娥，等.局灶性脑缺血-再灌注大鼠神经元DNA氧化损伤的研究.中国危重急救医学，2001，13(8):478-480.
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9 李菲，芮耀诚，陈维洲.银杏叶提取物对溶血磷脂酰胆碱引起的脑微血管损伤的保护作用.中国新药与临床杂志，1998，17(3): 149-151.
10 Smith PF，Maclennan K，Darlington CL.The neuroprotective properties the Ginkgo biloba leaf:a review of the possible relationship to platelet-activating factor(PAF).JEthnopharmacol，1996，50(3):131-139.
作者单位:510515广州第一军医大学药理学教研室
(收稿日期:2003-09-18)
(编辑 梅子), http://www.100md.com(孙莉莎)