复发喉鳞状细胞癌相关基因表达谱研究
【摘要】 目的 筛选复发喉鳞状细胞癌相关基因。方法 用包含18000个cDNA的基因芯片法检测2例复发喉鳞状细胞癌标本的癌组织及喉正常粘膜组织mRNA表达谱，通过对比分析寻找与复发喉鳞状细胞癌相关基因。结果 (1)重复且相差3倍以上差异表达基因共218个，其中喉癌组织表达上调的基因137个，表达下调基因81个;(2)表达相差10倍以上的基因4个，分别为U02570、AW863712、AA523939和NM_014381。结论 复发喉鳞状细胞癌的发生是一个多基因表达失调的过程，其中可能主要与GTP酶活化蛋白及DNA错配修复有关。
关键词 喉鳞状细胞癌 复发 cDNA矩阵芯片 基因表达
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)07-0577-05
Investigation on recurrent-associated gene expression pattern of
, 百拇医药
recurrent-laryngeal squamous cell carcinoma
Wang Binquan，Chen Yanqiu，Wen Shuxin，et al.
Department of Otorhinolaryngology，First Clinical Hospital of Shanxi
Medical University，Taiyuan030001.
【Abstract】 Objective To screen out recurrent-associated gene in expressi on pattern of laryngeal squamous cell cacinoma(LSCC).Methods By cDNA array chip containing18000genes，the gene expression pattern，of which cancer and normal mucosal tissues in2cases of LSCC，were compared and analyzed.Results 218genes expressed reˉpeatedly and differentially in LSCC were discovery.Among these genes，up-and down-regulated were137and81;The genes whose expression difference was over10times were U02570、AW863712、AA523939and NM_014381.Conˉclusion The episode of recurrent LSCC was a process of disturbance of numerous gene expression.GTPase activating protein(U02570)and DNA mismatch repair gene(NM_014381)probably played a leading role in the episode.
, http://www.100md.com
Key words laryngeal squamous cell carcinoma recurrence cDNA array chip gene expression
喉癌以鳞状上皮细胞癌多见，占90%以上。目前的治疗方法以手术为主，辅以放疗、化疗等其他方法，但尚不能取得满意结果，时常出现复发。因而有必要进行喉癌发病及复发等机理的研究。基因芯片是近年来发展起来、应用生物信号平行分析原理的一项技术，它将成千上万的靶基因生长或部分片段有序地、高密度地集中于一固相载体上(玻璃、尼龙膜等)构成cDNA矩阵(cDNA array)，用以检测各种细胞、组织的mRNA表达谱[1，2]。从而实现表达谱的高效分析，我们应用基因芯片技术对复发喉鳞状细胞癌进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 cDNA矩阵芯片构建 cDNA库是中科院上海生化细胞所构建的由18000个基因组成。cDNA片段平均长度为～1kb。首先将-80℃保存的单克隆菌种板，用排枪吸5μl克隆至96孔板培养过夜，然后在96孔板上抽提质粒DNA备用。另取一新96孔板分别加入T3、T7引物及1μl模板进行PCR扩增，PCR参数为:94℃变性40s，57℃退火40s、72℃延伸40s，循环37次。将PCR产物离心后取5μl产物跑琼脂糖凝胶电泳，确认合格，再用异丙醇沉淀吹干，最后加8μl变性液并移至384孔板保存用以点膜。
, http://www.100md.com
芯片最后是由BioRobotics公司的自动点膜仪将18000余个基因点于8cm×12cm尼龙膜上而成，芯片同时以RPS9、β-actin等看家基因作对照。
1.2 临床资料 本实验中所用材料为我科2例声门上型喉癌复发全喉切除后液氮冻存标本。2例患者均为男性，年龄分别为56岁，68岁。临床分型均属T4N1M0。抽提RNA的喉鳞癌及正常喉粘膜组织首先经病理切片、HE染色确认，如图1所示。
1.3 总RNA抽提及mRNA纯化 取喉癌组织及正常喉粘膜各0.2g，分别加入Trizol2ml，按Life Technologies公司总RNA提取试剂盒操作。用紫外分光光度计测定其含量和纯度。将所得总RNA用QIAGEN公司Oligotex mRNA试剂盒分离纯化polyA + mRNA。
1.4 探针标记和杂交 分别取喉癌组织及正常喉粘膜组织的各1.7μg mRNA为模板，用8bp随机引物在M-MLV作用下逆转录合成cDNA，在此合成过程中加入200μCi[α 33 -P]-dATP(Dupont NEN，Boston，USA)作标记。将芯片置于40ml预杂交液(6×SSC，0.5%SDS，5×Dehardt’s和100μg/ml变性鲑精DNA)68℃3h，然后倒出预杂液。于杂交管中加入6ml杂交液(6×SSC，0.5%SDS和100μg/ml变性鲑精DNA)和cDNA探针于68℃杂交20h，然后洗膜，干燥，用磷屏压片。
, http://www.100md.com
1.5 图像处理及分析 尼龙膜经磷屏暴光后用FLA-3000A图像扫描仪(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)进行扫描记录，每个点的强度均用直径50μm大小像素的灰度表示，以看家基因作参照对原始数据进行标化，用Array Gauge软件(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)进行对比分析。基因显著性表达的判定标准为:每个基因的喉癌组织和正常组织的平均灰度值相差3倍或3倍以上则认为差异有显著性[3]。
2 结果
2.1 总RNA抽提结果 组织中总RNA经抽提后，分别测定其OD 260 /OD 280 ，喉鳞癌组织和正常喉粘膜组织的OD 260 /OD 280 分别为1.96，1.98，再经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2。
2.2 复发喉癌相关基因差异表达 用含18000基因的芯片检测喉部鳞癌组织及正常粘膜组mRNA表达谱，结果见 图3、4，其中C1、C2为喉鳞癌组织mRNA表达谱，N1、N2为正常粘膜组织表达谱。通过对比分析筛选与复发喉鳞癌相关的基因。
, http://www.100md.com
在2例样本中重复表达且相差3倍以上的基因共178个，相差5倍以上的基因36个，相差10倍以上的基因4个，共计218个。在所有表达差异的基因中表达上调的137个，表达下调81个，见表1、表2。另外本实验还发现新基因51个，这些基因序列已被测出，但其功能却未知。
在以上差异表达的基因中，根据其功能，将部分基因进行初步分类。它们有些与转录调控、剪接或翻译有关，有些与机体免疫相关，有些与信号识别或信息传递相关，如表3所示。
表1 复发喉癌表达上调的相关基因(略)
表2 复发喉癌表达下调的相关基因(略)
表3 部分差异表达基因分类(略)
3 讨论
肿瘤的发病是一个多因素、多阶段的复杂病理过程，它与癌基因、抑癌基因、信号转导、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡及机体免疫等均存在一定的联系，但归根结底还是与基因有关[4]。随着人类基因组计划的即将完成，致病基因尤其是与肿瘤发病相关基因的筛选、克隆与鉴定已越来越被人们所关注。
, http://www.100md.com
众所周知，高等生物细胞内约含有10 5 个不同的基因，而对于每一特定细胞的mRNA则仅仅表达其中的15%左右，即约15000种mRNA。以往有人用mRNA差别显示法研究与喉癌发病相关基因[5，6]。本文应用的芯片包含18000个基因，其中包括一些序列已知而未知其功能的新基 因或序列标签。以求能更全面了解复发喉鳞癌的表达谱。
本实验通过对比2例喉鳞癌和正常喉粘膜组织的mRˉNA表达图谱发现癌组织和正常组织存在差异表达，2例标本重复出现且差异表达的基因共218个，其中喉癌组织表达上调的基因137种，表达下调的有81种。可见复发喉鳞癌的发生与多种基因表达失调相关，在这些基因中差异表达相差10倍以上的基因有4个，它们分别为U02570(ARHGAP1)、AW863712(HAAF000381)、NM_014381(MLH3)、AA523939(ESTs)。其中U02570基因与GTP酶活化蛋白有关[7]，AW863712与无功能叶酸结合蛋白相关，NM_014381与DNA错配修复有关[8]，AA523939则为未知功能的新基因。
, 百拇医药
从本文实验结果来看，复发喉癌与许多基因表达改变相关。一部分基因表达上调，如喉癌细胞的氧化磷酸化相关基因表达上调，这与喉癌细胞无限制生长而需要大量物质和能量代谢相关。在喉癌细胞中，信号识别及信息传递的相关基因表达增加，致使信号传递通路处于异常活化状态，导致细胞增殖失控。本实验喉癌细胞中表达上调最多的基因是U02570，即GTP酶活化蛋白，它在生长因子携带的信息向细胞内部传递中发挥重要作用[9]。GTP酶活化蛋白异常增高，可能导致生长因子受体的酪氨酸激酶活性增高，从而导致细胞异常增生。
在喉癌细胞中，另一部分基因表达下调，如L38969，它的产物能识别凋亡细胞，如X15187，它的产物与肿瘤排斥有关，可见喉鳞癌细胞通过这些基因表达下调，逃避体内的细胞凋亡及肿瘤排斥反应监视而得以在体内生长。
有些基因既属于信号转导又同时与细胞周期有关，如在喉鳞癌表达上调基因D45887(CALM2)，它可通过三磷酸肌醇(IP 3 )-Ca 2+ -钙调素(CaM)信号通路而参与细胞的增殖与分化。
, 百拇医药
有些基因按其功能分类似乎可归为一类，但在表达中却完全不一致。如L15309(ZNF141)和X92715(ZNF74)两者均为锌指蛋白，参与构成锌指结构域，后者为真核基因表达调控中反式作用因子的DNA结合结构域[10]，ZNF141在喉癌细胞中表达上调，而ZNF74则在喉癌细胞中表达下调。又如AF03116(SRP46)和AF083384(SPF45)，两者均在hnRNA的剪接为mRNA相关，但在喉癌细胞中，SRP46上调，SPF45下调。另外在与DNA修复的基因中，与DNA错配修复相关基因NM-014381(MLH3)在喉鳞癌中表达上调，而与DNA错配修复相关基因MB194(ERCC1)则上调。对于此类基因尚需进一步研究。
本实验中共发现51个基因，目前对于其功能知之甚少，但其核酸序列已全部清楚。这51个基因在喉鳞癌组织中，37个基因表达上调，14个基因下调，本实验对于此类基因功能的确定有一定的帮助。(本文图片见附页1，2)。
, 百拇医药 参考文献
1 Schena M，Shalon D，Dais RW，et al.Quantitative monitoring of gene exˉpression patterns with a complementary DNA microarray.Science，1995，270(20):467-470.
2 Schena M，Shalon D，Haller R，et al.Parallel human genome analysis:microar ray-based expression montoring of100genes.Pro Natl Acacl Sci USA，1996，93(20):10614-10619.
3 Liang Xu，Lijian Hui，Shaohui Wang，et al.Expression profilins Suggestˉeda regulatory role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellul ar carcinoma.Cancer Research，2001，61:3176-3181.
, 百拇医药
4 曾益新.肿瘤学.北京:人民卫生出版社，1999，10-219.
5 李友军，田芳，陈至初，等.喉癌差异表达cDNA序列的分离与初步鉴定.生物化学与生物物理学报，2000，32(2):153-157.
6 Rathcke IO，Weber EH，Goeroegh T，et al.mRNA differential display of human laryngeal carcinoma cells and corresponding benign kerˉatinocytes:cloningversus PCR-amplification.Otolaryngol Pol，2000，54(3):285-290.
7 Barfod ET，Zheng Y，Kuang WJ，et al.Cloning and expression of a huˉman CDC42GTPase-activating protein reveals a functional SH3- binding domain.J Biol Chem，1993，268:26059-26062.
, 百拇医药
8 Lipkin SM，Wang V，Jacoby R，et al.MLH3:a DNA mismatch repair gene associa ted with mammalian microsatellite instability.Nat Genet，2000，24(1):27-35.
9 汪仁，薛绍白，柳惠图.细胞生物学.北京:北京师范大学出版社，1998，491-516.
10 陈淳，徐沁译.高级分子生物要义.北京:科学出版社，2000，220-225.
基金项目:卫生部科学研究基金(98-2-262)
作者单位:1 030001山西医科大学第一医院耳鼻喉科
2 200031中国科学院上海生化细胞所
(收稿日期:2003-08-10) (编辑刘 娜), 百拇医药(王斌全)
关键词 喉鳞状细胞癌 复发 cDNA矩阵芯片 基因表达
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)07-0577-05
Investigation on recurrent-associated gene expression pattern of
, 百拇医药
recurrent-laryngeal squamous cell carcinoma
Wang Binquan，Chen Yanqiu，Wen Shuxin，et al.
Department of Otorhinolaryngology，First Clinical Hospital of Shanxi
Medical University，Taiyuan030001.
【Abstract】 Objective To screen out recurrent-associated gene in expressi on pattern of laryngeal squamous cell cacinoma(LSCC).Methods By cDNA array chip containing18000genes，the gene expression pattern，of which cancer and normal mucosal tissues in2cases of LSCC，were compared and analyzed.Results 218genes expressed reˉpeatedly and differentially in LSCC were discovery.Among these genes，up-and down-regulated were137and81;The genes whose expression difference was over10times were U02570、AW863712、AA523939and NM_014381.Conˉclusion The episode of recurrent LSCC was a process of disturbance of numerous gene expression.GTPase activating protein(U02570)and DNA mismatch repair gene(NM_014381)probably played a leading role in the episode.
, http://www.100md.com
Key words laryngeal squamous cell carcinoma recurrence cDNA array chip gene expression
喉癌以鳞状上皮细胞癌多见，占90%以上。目前的治疗方法以手术为主，辅以放疗、化疗等其他方法，但尚不能取得满意结果，时常出现复发。因而有必要进行喉癌发病及复发等机理的研究。基因芯片是近年来发展起来、应用生物信号平行分析原理的一项技术，它将成千上万的靶基因生长或部分片段有序地、高密度地集中于一固相载体上(玻璃、尼龙膜等)构成cDNA矩阵(cDNA array)，用以检测各种细胞、组织的mRNA表达谱[1，2]。从而实现表达谱的高效分析，我们应用基因芯片技术对复发喉鳞状细胞癌进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 cDNA矩阵芯片构建 cDNA库是中科院上海生化细胞所构建的由18000个基因组成。cDNA片段平均长度为～1kb。首先将-80℃保存的单克隆菌种板，用排枪吸5μl克隆至96孔板培养过夜，然后在96孔板上抽提质粒DNA备用。另取一新96孔板分别加入T3、T7引物及1μl模板进行PCR扩增，PCR参数为:94℃变性40s，57℃退火40s、72℃延伸40s，循环37次。将PCR产物离心后取5μl产物跑琼脂糖凝胶电泳，确认合格，再用异丙醇沉淀吹干，最后加8μl变性液并移至384孔板保存用以点膜。
, http://www.100md.com
芯片最后是由BioRobotics公司的自动点膜仪将18000余个基因点于8cm×12cm尼龙膜上而成，芯片同时以RPS9、β-actin等看家基因作对照。
1.2 临床资料 本实验中所用材料为我科2例声门上型喉癌复发全喉切除后液氮冻存标本。2例患者均为男性，年龄分别为56岁，68岁。临床分型均属T4N1M0。抽提RNA的喉鳞癌及正常喉粘膜组织首先经病理切片、HE染色确认，如图1所示。
1.3 总RNA抽提及mRNA纯化 取喉癌组织及正常喉粘膜各0.2g，分别加入Trizol2ml，按Life Technologies公司总RNA提取试剂盒操作。用紫外分光光度计测定其含量和纯度。将所得总RNA用QIAGEN公司Oligotex mRNA试剂盒分离纯化polyA + mRNA。
1.4 探针标记和杂交 分别取喉癌组织及正常喉粘膜组织的各1.7μg mRNA为模板，用8bp随机引物在M-MLV作用下逆转录合成cDNA，在此合成过程中加入200μCi[α 33 -P]-dATP(Dupont NEN，Boston，USA)作标记。将芯片置于40ml预杂交液(6×SSC，0.5%SDS，5×Dehardt’s和100μg/ml变性鲑精DNA)68℃3h，然后倒出预杂液。于杂交管中加入6ml杂交液(6×SSC，0.5%SDS和100μg/ml变性鲑精DNA)和cDNA探针于68℃杂交20h，然后洗膜，干燥，用磷屏压片。
, http://www.100md.com
1.5 图像处理及分析 尼龙膜经磷屏暴光后用FLA-3000A图像扫描仪(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)进行扫描记录，每个点的强度均用直径50μm大小像素的灰度表示，以看家基因作参照对原始数据进行标化，用Array Gauge软件(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)进行对比分析。基因显著性表达的判定标准为:每个基因的喉癌组织和正常组织的平均灰度值相差3倍或3倍以上则认为差异有显著性[3]。
2 结果
2.1 总RNA抽提结果 组织中总RNA经抽提后，分别测定其OD 260 /OD 280 ，喉鳞癌组织和正常喉粘膜组织的OD 260 /OD 280 分别为1.96，1.98，再经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2。
2.2 复发喉癌相关基因差异表达 用含18000基因的芯片检测喉部鳞癌组织及正常粘膜组mRNA表达谱，结果见 图3、4，其中C1、C2为喉鳞癌组织mRNA表达谱，N1、N2为正常粘膜组织表达谱。通过对比分析筛选与复发喉鳞癌相关的基因。
, http://www.100md.com
在2例样本中重复表达且相差3倍以上的基因共178个，相差5倍以上的基因36个，相差10倍以上的基因4个，共计218个。在所有表达差异的基因中表达上调的137个，表达下调81个，见表1、表2。另外本实验还发现新基因51个，这些基因序列已被测出，但其功能却未知。
在以上差异表达的基因中，根据其功能，将部分基因进行初步分类。它们有些与转录调控、剪接或翻译有关，有些与机体免疫相关，有些与信号识别或信息传递相关，如表3所示。
表1 复发喉癌表达上调的相关基因(略)
表2 复发喉癌表达下调的相关基因(略)
表3 部分差异表达基因分类(略)
3 讨论
肿瘤的发病是一个多因素、多阶段的复杂病理过程，它与癌基因、抑癌基因、信号转导、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡及机体免疫等均存在一定的联系，但归根结底还是与基因有关[4]。随着人类基因组计划的即将完成，致病基因尤其是与肿瘤发病相关基因的筛选、克隆与鉴定已越来越被人们所关注。
, http://www.100md.com
众所周知，高等生物细胞内约含有10 5 个不同的基因，而对于每一特定细胞的mRNA则仅仅表达其中的15%左右，即约15000种mRNA。以往有人用mRNA差别显示法研究与喉癌发病相关基因[5，6]。本文应用的芯片包含18000个基因，其中包括一些序列已知而未知其功能的新基 因或序列标签。以求能更全面了解复发喉鳞癌的表达谱。
本实验通过对比2例喉鳞癌和正常喉粘膜组织的mRˉNA表达图谱发现癌组织和正常组织存在差异表达，2例标本重复出现且差异表达的基因共218个，其中喉癌组织表达上调的基因137种，表达下调的有81种。可见复发喉鳞癌的发生与多种基因表达失调相关，在这些基因中差异表达相差10倍以上的基因有4个，它们分别为U02570(ARHGAP1)、AW863712(HAAF000381)、NM_014381(MLH3)、AA523939(ESTs)。其中U02570基因与GTP酶活化蛋白有关[7]，AW863712与无功能叶酸结合蛋白相关，NM_014381与DNA错配修复有关[8]，AA523939则为未知功能的新基因。
, 百拇医药
从本文实验结果来看，复发喉癌与许多基因表达改变相关。一部分基因表达上调，如喉癌细胞的氧化磷酸化相关基因表达上调，这与喉癌细胞无限制生长而需要大量物质和能量代谢相关。在喉癌细胞中，信号识别及信息传递的相关基因表达增加，致使信号传递通路处于异常活化状态，导致细胞增殖失控。本实验喉癌细胞中表达上调最多的基因是U02570，即GTP酶活化蛋白，它在生长因子携带的信息向细胞内部传递中发挥重要作用[9]。GTP酶活化蛋白异常增高，可能导致生长因子受体的酪氨酸激酶活性增高，从而导致细胞异常增生。
在喉癌细胞中，另一部分基因表达下调，如L38969，它的产物能识别凋亡细胞，如X15187，它的产物与肿瘤排斥有关，可见喉鳞癌细胞通过这些基因表达下调，逃避体内的细胞凋亡及肿瘤排斥反应监视而得以在体内生长。
有些基因既属于信号转导又同时与细胞周期有关，如在喉鳞癌表达上调基因D45887(CALM2)，它可通过三磷酸肌醇(IP 3 )-Ca 2+ -钙调素(CaM)信号通路而参与细胞的增殖与分化。
, 百拇医药
有些基因按其功能分类似乎可归为一类，但在表达中却完全不一致。如L15309(ZNF141)和X92715(ZNF74)两者均为锌指蛋白，参与构成锌指结构域，后者为真核基因表达调控中反式作用因子的DNA结合结构域[10]，ZNF141在喉癌细胞中表达上调，而ZNF74则在喉癌细胞中表达下调。又如AF03116(SRP46)和AF083384(SPF45)，两者均在hnRNA的剪接为mRNA相关，但在喉癌细胞中，SRP46上调，SPF45下调。另外在与DNA修复的基因中，与DNA错配修复相关基因NM-014381(MLH3)在喉鳞癌中表达上调，而与DNA错配修复相关基因MB194(ERCC1)则上调。对于此类基因尚需进一步研究。
本实验中共发现51个基因，目前对于其功能知之甚少，但其核酸序列已全部清楚。这51个基因在喉鳞癌组织中，37个基因表达上调，14个基因下调，本实验对于此类基因功能的确定有一定的帮助。(本文图片见附页1，2)。
, 百拇医药 参考文献
1 Schena M，Shalon D，Dais RW，et al.Quantitative monitoring of gene exˉpression patterns with a complementary DNA microarray.Science，1995，270(20):467-470.
2 Schena M，Shalon D，Haller R，et al.Parallel human genome analysis:microar ray-based expression montoring of100genes.Pro Natl Acacl Sci USA，1996，93(20):10614-10619.
3 Liang Xu，Lijian Hui，Shaohui Wang，et al.Expression profilins Suggestˉeda regulatory role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellul ar carcinoma.Cancer Research，2001，61:3176-3181.
, 百拇医药
4 曾益新.肿瘤学.北京:人民卫生出版社，1999，10-219.
5 李友军，田芳，陈至初，等.喉癌差异表达cDNA序列的分离与初步鉴定.生物化学与生物物理学报，2000，32(2):153-157.
6 Rathcke IO，Weber EH，Goeroegh T，et al.mRNA differential display of human laryngeal carcinoma cells and corresponding benign kerˉatinocytes:cloningversus PCR-amplification.Otolaryngol Pol，2000，54(3):285-290.
7 Barfod ET，Zheng Y，Kuang WJ，et al.Cloning and expression of a huˉman CDC42GTPase-activating protein reveals a functional SH3- binding domain.J Biol Chem，1993，268:26059-26062.
, 百拇医药
8 Lipkin SM，Wang V，Jacoby R，et al.MLH3:a DNA mismatch repair gene associa ted with mammalian microsatellite instability.Nat Genet，2000，24(1):27-35.
9 汪仁，薛绍白，柳惠图.细胞生物学.北京:北京师范大学出版社，1998，491-516.
10 陈淳，徐沁译.高级分子生物要义.北京:科学出版社，2000，220-225.
基金项目:卫生部科学研究基金(98-2-262)
作者单位:1 030001山西医科大学第一医院耳鼻喉科
2 200031中国科学院上海生化细胞所
(收稿日期:2003-08-10) (编辑刘 娜), 百拇医药(王斌全)