基因工程药物的高度纯化方法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)14-1306-05
随着人们对生命现象认识的不断加深，在20世纪70年代建立了DNA重组和单克隆抗体两大技术后，现代生物技术的发展已使得利用基因工程改造细菌和动、植物细胞表达蛋白质成为一项常规技术。技术门槛的降低和广阔的应用前景使越来越多的公司加入到基因工程制药这一领域中来，这样势必造成市场竞争的加剧，刺激着基因工程药物成本的下降。因为基因工程制药的特殊性(生产过程中杂质的种类和数量多，性质与目的产物相似)，分离纯化，特别是高度纯化的方法和手段直接决定最终产品的质量和成本，因而其关键性不言而喻。
就目前而言，高度分离纯化方法主要分5类:离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，IEC)、疏水层析(Hyˉdrophobic Interaction Chromatography，HIC)、固定化金属离子层析Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC)、亲和层析(Affinity Chromatography，AC)和凝胶过滤层析(Gel Filtraˉtion Chromatography，GFC)。本文仅就以上5种方法作一综述。
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1 离子交换层析
1.1 原理 离子交换层析是利用离子交换剂作为固定相，以适宜的溶剂作为移动相，使溶质按它们的离子交换亲和力的不同而得到分离。由于蛋白质具有两性的性质，在不同pH条件下其分子净电荷或表面电荷分布(当净电荷相同时 [1] )不同，因此在离子交换剂上静电吸附能力不同，从而可以利用不同pH或离子强度的洗脱剂进行洗脱而达到分离纯化的目的。
1.2 离子交换剂 离子交换剂按活性基团的不同可分为阳离子交换和阴离子交换两类，由离子交换剂活性基团的强度不同又可分为强酸性和弱酸性的阳离子交换剂及强碱性和弱碱性的阴离子交换剂共4种。对于基因工程来说，由于蛋白质是高分子量化合物，具有维持活性所必须的四级结构:(1)只有在温和的条件下才能维持蛋白质四级结构。(2)均匀的大网结构以容纳大体积的蛋白质。(3)适宜的电荷密度以免导致蛋白质空间结构的变化。(4)尽可能小的粒径分布范围。常用离子交换剂的种类按基质类型分为多糖、聚乙烯醇和聚丙烯酸羟乙脂，其中多糖基质最常用。常用多糖类离子交换剂见表1。
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表1 常用多糖类离子交换剂 略
1.3 影响因素与洗脱 在洗脱方式上，阳离子交换层析主要是改变pH，它主要应用于pI>5的蛋白质;阴离子交换层析主要是改变盐浓度，它适用于大部分的蛋白质。IEC的洗脱一般分为3种:恒定溶液洗脱法、分步洗脱法和梯度洗脱法。恒定溶液洗脱法一般应用于已知性质的样品，其重现性较好，但所用的洗脱液体积较大，不利于下一步浓缩和加工。分步洗脱一般应用于在其中某一种盐浓度收集一种目标蛋白质，但有时会发生某种蛋白质出现在两个峰中或一个峰中出现两种蛋白质，因此也一般应用于已知样品。梯度洗脱是按一定的浓度梯度连续改变盐浓度进行洗脱。一般不常采用改变pH梯度的方法洗脱。这是因为:(1)这要求缓冲液具有很大的缓冲容量。(2)pH的变化会引起离子强度的变化。(3)当一种蛋白质被洗脱时，pH会突然发生较大的改变，使一些组分不能得到很好的分离。因此改变pH梯度常采用分步洗脱法。IEC还有一个特点，利用蛋白质在不同pH和盐浓度下带电性的不同，通过不同条件下应用同类型或不同类型的介质，分两步IEC使目标蛋白质达到提纯的目的。这是除了亲和层析以外，别的层析达不到的分离能力。
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1.4 应用及举例 IEC从原则上来说可以放在分离纯化工艺的任何一步，但一般放在前面。其一些实际应用见表2。
表2 应用IEC分离的蛋白质 略
2 疏水层析
2.1 原理 在层析剂基质与起吸附作用的功能基之间接上一段直链碳链(接枝手臂)，往往能显著提高分离效果。对于这样的作用，现在一般认为是接枝手臂的直链碳链本身与蛋白质表面某一对应疏水区域相互作用，增加了对蛋白质的吸附作用。在这种解释的基础上发展起来了疏水层析技术。其分离的原理就是利用不同蛋白质表面及内部疏水区域的多少、大小、强度、分布及空间位阻效应的不同造成的蛋白质与层析剂间所形成的疏水键和疏水作用的差异来分离蛋白质 [2] 。
2.2 离子交换剂 疏水层析所用的基质是将琼脂糖凝胶通过BrCN活化后，与不同的α-氨基烷烃作用，产生碳链长度逐次变化的同系列烷基琼脂糖Seph-Cn，其中n=1～6，表示碳链中的碳原子数。
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2.3 影响因素 当介质和上样量不变时，影响疏水层析作用的因素主要有6种:(1)盐类[3] 。盐可增加水相的极性，提高界面的表面张力，同时可使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团，容易形成疏水作用。所以盐浓度越高，促疏水作用越强。由于作用原理同盐析类似，对盐析作用明显的盐类，如(NH 4 ) 2 SO 4 ，对蛋白质的疏水吸附作用影响最大。同理，在高盐浓度下，疏水吸附作用会增大至大多数蛋白质 都能吸附于基质上，HIC就难以得到很好的分辨率。(2)混溶的有机溶剂，同盐的作用相反，有机溶剂能使界面张力减弱，减少疏水作用。(3)温度，当体系的温度由4℃升至15℃时，疏水作用增加20%～30%，这主要是因为水分子动能增大，提高了表面张力。(4)pH，当pH=pI时，蛋白质表面的净电荷为0，可消除距离较近的蛋白质分子间的电荷斥力，因此疏水层析一般在目标蛋白质等电点条件下进行。(5)表面活性剂，表面活性剂能降低表面张力，因此也能减少疏水作用。(6)蛋白质的性质。
2.4 洗脱 因此，在吸附时应适当增强蛋白质与层析剂之间的疏水作用力，洗脱时则应尽量减小疏水作用力。所以洗脱可采用较低浓度的盐溶液洗脱，或在洗脱剂中添加一些温和的有机溶剂如多元醇或非离子型表面活性剂。此外，降低洗脱液的温度也有利于洗脱。
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2.5 应用及举例 HIC适用范围广，处理样品量大，尤其适用于从大体积样品中提取低含量的目标蛋白，可取代传统的盐析技术。它可应用于食品工业中测定牛奶中的酪蛋白含量 [4] ，因此可能将来在转基因动物制药上有巨大的作用。除此以外，HIC还可用于蛋白质的复性 [5] 。原则上它可放在分离纯化工艺的任何位置，但一般放在前面。其某些实际应用见表3。
表3 应用HIC分离的蛋白质 略
3 固定化金属离子层析
3.1 原理 固定化金属离子层析，又称金属螯合层析，是近20年发展出的一项新技术。某些蛋白质表面的一些氨基酸，如His、Trp、Lys等具有-OH、-NH 2 、-SH基团，其中O、N、S上具有多余的孤对电子，能与过渡金属离子多余的空轨道发生特殊的电子效应，形成络合物。IMAC即是利用这些蛋白质的这种特殊性质来达到与其它蛋白质分离的目的。
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3.2 离子交换剂 利用亚氨基二乙酸(IDA)与经过环氧丙 烷活化的琼脂糖反应，可以形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。将这种琼脂糖上的双羧甲基氨基侧链与Zn 2+ 或Cu 2+ 等螯合，即形成IMAC的层析剂。在层析时，表面具有His、Trp或Lys等氨基酸残基的蛋白质即能与层析剂结合，这样便达到了除去杂质的目的。
3.3 影响因素与洗脱 影响IMAC洗脱的因素主要有pH、竞争性抑制剂(包括EDTA、铵盐甚至乙烯基咪唑-乙烯基己内酰胺共聚物 [6] )、螯合的金属离子等。除此以外，单纯的离子吸附与其它的一些因素可以通过高离子强度的缓冲液进行改善。根据IMAC吸附的原理，蛋白质与金属离子的螯合是通过蛋白质表面氨基酸残基上的孤对电子与金属离子的空轨道结合形成的，H + 同样含有空轨道，因此可与金属离子同时竞争蛋白质表面的孤对电子。pH越低，H + 浓度越高，竞争作用越强，蛋白质更易被洗脱。同样，在加入竞争性抑制剂时，其上的孤对电子也会与蛋白质产生竞争性吸附，而使蛋白质被洗脱下来。这种竞争性抑制剂可以是铵盐溶液中的NH 3 ·H 2 O分子，也可以是EDTA这种强螯合剂。但EDTA洗脱能力过强，除了无选择性洗脱所有的蛋白质外，还会将层析剂上的金属离子一同洗脱，所以除了少数情况(如分离多聚组氨酸标记的酶 [7] )外，一般用于柱的再生。在使用铵盐溶液时，pH与NH 3 ·H 2 O分子会产生反方向变化，即当pH降低，有利于洗脱时，NH 3 ·H 2 O在 溶液中的数目会减少，不利于洗脱;而当pH升高，不利于洗脱时，NH 3 ·H 2 O在溶液中的数目会增加，有利于洗脱。在这种情况下，二者相比，NH 3 ·H 2 O的作用更强 [8] ，所以提高pH会增强铵盐洗脱液的洗脱能力。在层析剂所用的金属离子不同时，层析剂对蛋白质吸附作用的强度也不同，Cu 2+ 与蛋白质的亲和能力大于Zn 2+ [8] 。
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3.4 应用及举例 一般来说，Cu 2+ 用于分离含N化合物、单核苷酸、人乳铁蛋白;Ni 2+ 用于分离含Trp、Tyr的蛋白质;Zn 2+ 用于分离含His、Cys的蛋白质。IMAC具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强、分离率和回收率高等特点，因此IMAC及其改进方法[9] 逐渐成为基因工程制药高度分离纯化最有效的手段之一。其应用见表4。
表4 运用IMAC法分离的蛋白质 略
4 亲和层析
4.1 原理 亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等 [10，11] 。
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4.2 离子交换剂 亲和层析的层析剂可分为3个部分:(1)载体，载体起支架作用，一般是偶联凝胶或多孔玻璃珠。(2)间臂，由于生物大分子的空间位阻作用，需加一间臂，其长度具有重要作用。太长则增加了非特异性疏水吸附作用，太短则起不到应有的作用。(3)配基，这是亲和层析的核心物质，在分离中起特异性吸附欲分离物的作用。配基一般分为天然配基(包括糖结合配基和蛋白质结合配基)、染料配基、氨基酸类亲和配基、核苷酸及核苷酸类似物配基和仿生配基等几类。其中利用计算机辅助设计的仿生配基 [12～15] 和膜层析 [16] 代表了亲和层析的发展方向。不仅是配基本身的结构，它们与载体的连接方法也与层析的分离能力有关 [17] 。
4.3 影响因素与洗脱 亲和层析中配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关，因此可以用分子间相互作用的平衡常数K D 来衡量亲和作用强度 [18] 。但它们的结合力仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等。所以，除了可改变配基以改变亲和层析的作用强度以外，还可以通过改变pH和离子强度的方法来改变配基与生物大分子之间的亲和力，从而达到洗脱的目的 [19] 。但由于亲和层析的多样性，洗脱的条件常常需要通过实验来获得。除此以外，还可运用其它配基、抑制剂等物质与出层析剂上的配基或生物大分子产生竞争性结合，达到洗脱的目的，这种方法被称为专一性洗脱。专一性洗脱可以获得很高的分辨能力，但洗脱剂的价格较高，所以常与普通洗脱配合使用。值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。
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4.4 应用及举例 在实际使用中，配基与欲分离蛋白质之间的亲和力要控制在一定的范围之内，这是因为若亲和力太低，则分离的效果不好;若亲和力太高，则洗脱太困难。因此配基与欲分离蛋白质之间的K D 值一般控制在10 -4 ～10 -6 之间 [15] 。运用亲和层析分离的蛋白质见表5。
表5 应用亲和层析分离的蛋白质 略
5 凝胶层析
5.1 原理 凝胶层析是在装有多孔物质填料的柱中进行的。填料含有许多不同大小的孔，体积大的溶质分子不能进入体积小的孔，而体积小的物质可进入大孔，也可进入小孔，因此在柱中保留的时间比体积大的物质长。于是整个样品按分子量的大小顺序分开，体积最大的物质最先出峰，体积最小的物质最后出峰。
5.2 离子交换剂 常用的GFC介质有纤维素(商品名Sephacel)、交联葡聚糖(商品名Sephadex)、交联琼脂糖(商品 名Sepharose)等。
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5.3 影响因素与洗脱 GFC的分离不依赖于流动相与固定相的相互作用，因此不必使用洗脱剂。但为了降低生物分子和填料之间的非特异相互作用，常适量的提高流动相的盐浓度，一般大于0.05mol/L。
5.4 应用及举例 凝胶层析是真正的层析操作，因此具有回收率高、洗脱条件温和、不发生副反应、介质使用寿命长等优点，但它同时存在处理样品体积小的缺点，因此一般放在分离纯化工艺的最后一步。其应用见表6。
表6 应用凝胶层析分离的蛋白质 略
6 应用举例
6.1 日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶及其定点诱变体的纯化 [20]
6.1.1 GSH亲和层析300ml培养液中收获的细胞悬浮于15ml磷酸盐缓冲—生理盐水中(PBS;140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa 2 HPO 4 ，1.8mM KH 2 PO 4 ，pH7.4)。超声波破碎。细胞裂解上清上GSH Sepharose4B柱，柱床体积200μl，接着用10柱床体积的PBS冲洗3次。接着用400μl的GSH洗脱液(30mM GSH，50mMTris-HCl，pH8)洗脱蛋白。为了除去GSH，洗脱下来的蛋白用PBS4倍稀释，用截止量3500的透析袋，2000体积PBS进行透析。
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6.1.2 IMAC纯化 30ml培养液中收获的细胞悬浮于1.5mlNTA上样缓冲溶液中(0.1M NaH 2PO 4 ，0.1M Tris-HCl，pH8)。超声波破碎。细胞裂解上清与100μl50%的Ni 2+ -NTA凝胶混合，室温下轻轻振摇15min，然后离心。得到的沉淀用10倍柱床体积的含20mM咪唑的NTA上样缓冲液冲洗。用100μlNTA洗脱液(250mM咪唑，0.1MNaH 2 PO 4 ，0.1MTris-HCl，pH8)洗脱蛋白。
6.2 亚油酸(13R)脂加氧酶的分离与纯化 [21]
6.2.1 疏水层析 将培养液与0.55M硫酸铵和2mM NaN 3 (pH7.2)(NaOH)混合，用微孔过滤器(0.45μm，type HA)过滤，滤液上2.6cm×20cm苯-Sepharose柱(0.01M KPB，0.6M硫酸铵)，流速5ml/min。用同样的缓冲液2～3倍柱床体积冲洗。再用0.01M KPB(pH6.8)，0.5mM GSH，2mM NaN 3 ，0.04%Tween20洗脱，即得组分Ⅰ。用5mM KPB(pH6.8)，6M urea，5mM EDTA，0.5mM GSH洗脱即得组分Ⅱ。合并组分Ⅰ与Ⅱ。
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6.2.2 阳离子交换层析 透析后，进一步进行阳离子交换层析(CMSepharose CL-4B，1.8×3cm)用0.01mMKPB(pH6.8)含2mM NaN 3 0.5mM GSH和0.04%Tween20上柱，接着该柱用含0.2MNaCl的相同缓冲液进行洗脱。
6.2.3 亲和层析 用ConA-Sepharose亲合柱(2.8ml)或更 换缓冲液(PD10，Amersham Pharmacia Biotech)用Mono S HR5/5柱层析。The Mono S柱用含0到0.1M NaCl的0.01M KPB(pH6.9)，2mMNaN 3 ，0.5mMGSH，0.04%Tween20的缓冲液进行线性洗脱，20min内洗脱结束。接着用含0.2M NaCl的该缓冲液洗脱。ConA-Sepharose柱用10mM KPB(pH7.3)，0.5M NaCl，2mM NaN 3 ，0.2mM GSH，0.04%Tween20平衡，上样并用相同缓冲液冲洗。酶牢固的结合在ConA-Sepharose上，但是可以用含0.5M甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷的10mM KFB(pH6.0)，0.3MNaCl，2mM NaN 3 ，0.2mMGSH，0.04%Tween20洗脱。纯化的最后一步为凝胶过滤层析(Superdex200HR10/30)0.1MKPB(pH7.3)，0.15M NaCl，1mM GSH，1mM EDTA，3mM NaN 3 ，0.5mMˉCHAPS或6Murea，0.05M KFB(pH7.3)，1mM GSH。出峰后分部收集(0.2ml)并用SDS-PAGE电泳分析。
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7 展望
就目前而言，利用传统的技术，分离纯化阶段的成本占总成本的50%～80% [14] 。即便如此，仍有很多生物技术药物找不到经济可行的分离纯化工艺。随着新的快速高效的高度纯化方法，如组特异性亲和配基的出现，必将有更多新的基因工程药物投入生产和应用，从而改变整个医药行业的面貌。
参考文献
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作者单位:1 250013 山东省济南市中心医院
2 山东省济南市卫生局信息化服务中心
(编 辑 罗彬), 百拇医药(俞淑文)
随着人们对生命现象认识的不断加深，在20世纪70年代建立了DNA重组和单克隆抗体两大技术后，现代生物技术的发展已使得利用基因工程改造细菌和动、植物细胞表达蛋白质成为一项常规技术。技术门槛的降低和广阔的应用前景使越来越多的公司加入到基因工程制药这一领域中来，这样势必造成市场竞争的加剧，刺激着基因工程药物成本的下降。因为基因工程制药的特殊性(生产过程中杂质的种类和数量多，性质与目的产物相似)，分离纯化，特别是高度纯化的方法和手段直接决定最终产品的质量和成本，因而其关键性不言而喻。
就目前而言，高度分离纯化方法主要分5类:离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，IEC)、疏水层析(Hyˉdrophobic Interaction Chromatography，HIC)、固定化金属离子层析Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC)、亲和层析(Affinity Chromatography，AC)和凝胶过滤层析(Gel Filtraˉtion Chromatography，GFC)。本文仅就以上5种方法作一综述。
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1 离子交换层析
1.1 原理 离子交换层析是利用离子交换剂作为固定相，以适宜的溶剂作为移动相，使溶质按它们的离子交换亲和力的不同而得到分离。由于蛋白质具有两性的性质，在不同pH条件下其分子净电荷或表面电荷分布(当净电荷相同时 [1] )不同，因此在离子交换剂上静电吸附能力不同，从而可以利用不同pH或离子强度的洗脱剂进行洗脱而达到分离纯化的目的。
1.2 离子交换剂 离子交换剂按活性基团的不同可分为阳离子交换和阴离子交换两类，由离子交换剂活性基团的强度不同又可分为强酸性和弱酸性的阳离子交换剂及强碱性和弱碱性的阴离子交换剂共4种。对于基因工程来说，由于蛋白质是高分子量化合物，具有维持活性所必须的四级结构:(1)只有在温和的条件下才能维持蛋白质四级结构。(2)均匀的大网结构以容纳大体积的蛋白质。(3)适宜的电荷密度以免导致蛋白质空间结构的变化。(4)尽可能小的粒径分布范围。常用离子交换剂的种类按基质类型分为多糖、聚乙烯醇和聚丙烯酸羟乙脂，其中多糖基质最常用。常用多糖类离子交换剂见表1。
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表1 常用多糖类离子交换剂 略
1.3 影响因素与洗脱 在洗脱方式上，阳离子交换层析主要是改变pH，它主要应用于pI>5的蛋白质;阴离子交换层析主要是改变盐浓度，它适用于大部分的蛋白质。IEC的洗脱一般分为3种:恒定溶液洗脱法、分步洗脱法和梯度洗脱法。恒定溶液洗脱法一般应用于已知性质的样品，其重现性较好，但所用的洗脱液体积较大，不利于下一步浓缩和加工。分步洗脱一般应用于在其中某一种盐浓度收集一种目标蛋白质，但有时会发生某种蛋白质出现在两个峰中或一个峰中出现两种蛋白质，因此也一般应用于已知样品。梯度洗脱是按一定的浓度梯度连续改变盐浓度进行洗脱。一般不常采用改变pH梯度的方法洗脱。这是因为:(1)这要求缓冲液具有很大的缓冲容量。(2)pH的变化会引起离子强度的变化。(3)当一种蛋白质被洗脱时，pH会突然发生较大的改变，使一些组分不能得到很好的分离。因此改变pH梯度常采用分步洗脱法。IEC还有一个特点，利用蛋白质在不同pH和盐浓度下带电性的不同，通过不同条件下应用同类型或不同类型的介质，分两步IEC使目标蛋白质达到提纯的目的。这是除了亲和层析以外，别的层析达不到的分离能力。
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1.4 应用及举例 IEC从原则上来说可以放在分离纯化工艺的任何一步，但一般放在前面。其一些实际应用见表2。
表2 应用IEC分离的蛋白质 略
2 疏水层析
2.1 原理 在层析剂基质与起吸附作用的功能基之间接上一段直链碳链(接枝手臂)，往往能显著提高分离效果。对于这样的作用，现在一般认为是接枝手臂的直链碳链本身与蛋白质表面某一对应疏水区域相互作用，增加了对蛋白质的吸附作用。在这种解释的基础上发展起来了疏水层析技术。其分离的原理就是利用不同蛋白质表面及内部疏水区域的多少、大小、强度、分布及空间位阻效应的不同造成的蛋白质与层析剂间所形成的疏水键和疏水作用的差异来分离蛋白质 [2] 。
2.2 离子交换剂 疏水层析所用的基质是将琼脂糖凝胶通过BrCN活化后，与不同的α-氨基烷烃作用，产生碳链长度逐次变化的同系列烷基琼脂糖Seph-Cn，其中n=1～6，表示碳链中的碳原子数。
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2.3 影响因素 当介质和上样量不变时，影响疏水层析作用的因素主要有6种:(1)盐类[3] 。盐可增加水相的极性，提高界面的表面张力，同时可使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团，容易形成疏水作用。所以盐浓度越高，促疏水作用越强。由于作用原理同盐析类似，对盐析作用明显的盐类，如(NH 4 ) 2 SO 4 ，对蛋白质的疏水吸附作用影响最大。同理，在高盐浓度下，疏水吸附作用会增大至大多数蛋白质 都能吸附于基质上，HIC就难以得到很好的分辨率。(2)混溶的有机溶剂，同盐的作用相反，有机溶剂能使界面张力减弱，减少疏水作用。(3)温度，当体系的温度由4℃升至15℃时，疏水作用增加20%～30%，这主要是因为水分子动能增大，提高了表面张力。(4)pH，当pH=pI时，蛋白质表面的净电荷为0，可消除距离较近的蛋白质分子间的电荷斥力，因此疏水层析一般在目标蛋白质等电点条件下进行。(5)表面活性剂，表面活性剂能降低表面张力，因此也能减少疏水作用。(6)蛋白质的性质。
2.4 洗脱 因此，在吸附时应适当增强蛋白质与层析剂之间的疏水作用力，洗脱时则应尽量减小疏水作用力。所以洗脱可采用较低浓度的盐溶液洗脱，或在洗脱剂中添加一些温和的有机溶剂如多元醇或非离子型表面活性剂。此外，降低洗脱液的温度也有利于洗脱。
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2.5 应用及举例 HIC适用范围广，处理样品量大，尤其适用于从大体积样品中提取低含量的目标蛋白，可取代传统的盐析技术。它可应用于食品工业中测定牛奶中的酪蛋白含量 [4] ，因此可能将来在转基因动物制药上有巨大的作用。除此以外，HIC还可用于蛋白质的复性 [5] 。原则上它可放在分离纯化工艺的任何位置，但一般放在前面。其某些实际应用见表3。
表3 应用HIC分离的蛋白质 略
3 固定化金属离子层析
3.1 原理 固定化金属离子层析，又称金属螯合层析，是近20年发展出的一项新技术。某些蛋白质表面的一些氨基酸，如His、Trp、Lys等具有-OH、-NH 2 、-SH基团，其中O、N、S上具有多余的孤对电子，能与过渡金属离子多余的空轨道发生特殊的电子效应，形成络合物。IMAC即是利用这些蛋白质的这种特殊性质来达到与其它蛋白质分离的目的。
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3.2 离子交换剂 利用亚氨基二乙酸(IDA)与经过环氧丙 烷活化的琼脂糖反应，可以形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。将这种琼脂糖上的双羧甲基氨基侧链与Zn 2+ 或Cu 2+ 等螯合，即形成IMAC的层析剂。在层析时，表面具有His、Trp或Lys等氨基酸残基的蛋白质即能与层析剂结合，这样便达到了除去杂质的目的。
3.3 影响因素与洗脱 影响IMAC洗脱的因素主要有pH、竞争性抑制剂(包括EDTA、铵盐甚至乙烯基咪唑-乙烯基己内酰胺共聚物 [6] )、螯合的金属离子等。除此以外，单纯的离子吸附与其它的一些因素可以通过高离子强度的缓冲液进行改善。根据IMAC吸附的原理，蛋白质与金属离子的螯合是通过蛋白质表面氨基酸残基上的孤对电子与金属离子的空轨道结合形成的，H + 同样含有空轨道，因此可与金属离子同时竞争蛋白质表面的孤对电子。pH越低，H + 浓度越高，竞争作用越强，蛋白质更易被洗脱。同样，在加入竞争性抑制剂时，其上的孤对电子也会与蛋白质产生竞争性吸附，而使蛋白质被洗脱下来。这种竞争性抑制剂可以是铵盐溶液中的NH 3 ·H 2 O分子，也可以是EDTA这种强螯合剂。但EDTA洗脱能力过强，除了无选择性洗脱所有的蛋白质外，还会将层析剂上的金属离子一同洗脱，所以除了少数情况(如分离多聚组氨酸标记的酶 [7] )外，一般用于柱的再生。在使用铵盐溶液时，pH与NH 3 ·H 2 O分子会产生反方向变化，即当pH降低，有利于洗脱时，NH 3 ·H 2 O在 溶液中的数目会减少，不利于洗脱;而当pH升高，不利于洗脱时，NH 3 ·H 2 O在溶液中的数目会增加，有利于洗脱。在这种情况下，二者相比，NH 3 ·H 2 O的作用更强 [8] ，所以提高pH会增强铵盐洗脱液的洗脱能力。在层析剂所用的金属离子不同时，层析剂对蛋白质吸附作用的强度也不同，Cu 2+ 与蛋白质的亲和能力大于Zn 2+ [8] 。
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3.4 应用及举例 一般来说，Cu 2+ 用于分离含N化合物、单核苷酸、人乳铁蛋白;Ni 2+ 用于分离含Trp、Tyr的蛋白质;Zn 2+ 用于分离含His、Cys的蛋白质。IMAC具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强、分离率和回收率高等特点，因此IMAC及其改进方法[9] 逐渐成为基因工程制药高度分离纯化最有效的手段之一。其应用见表4。
表4 运用IMAC法分离的蛋白质 略
4 亲和层析
4.1 原理 亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等 [10，11] 。
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4.2 离子交换剂 亲和层析的层析剂可分为3个部分:(1)载体，载体起支架作用，一般是偶联凝胶或多孔玻璃珠。(2)间臂，由于生物大分子的空间位阻作用，需加一间臂，其长度具有重要作用。太长则增加了非特异性疏水吸附作用，太短则起不到应有的作用。(3)配基，这是亲和层析的核心物质，在分离中起特异性吸附欲分离物的作用。配基一般分为天然配基(包括糖结合配基和蛋白质结合配基)、染料配基、氨基酸类亲和配基、核苷酸及核苷酸类似物配基和仿生配基等几类。其中利用计算机辅助设计的仿生配基 [12～15] 和膜层析 [16] 代表了亲和层析的发展方向。不仅是配基本身的结构，它们与载体的连接方法也与层析的分离能力有关 [17] 。
4.3 影响因素与洗脱 亲和层析中配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关，因此可以用分子间相互作用的平衡常数K D 来衡量亲和作用强度 [18] 。但它们的结合力仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等。所以，除了可改变配基以改变亲和层析的作用强度以外，还可以通过改变pH和离子强度的方法来改变配基与生物大分子之间的亲和力，从而达到洗脱的目的 [19] 。但由于亲和层析的多样性，洗脱的条件常常需要通过实验来获得。除此以外，还可运用其它配基、抑制剂等物质与出层析剂上的配基或生物大分子产生竞争性结合，达到洗脱的目的，这种方法被称为专一性洗脱。专一性洗脱可以获得很高的分辨能力，但洗脱剂的价格较高，所以常与普通洗脱配合使用。值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。
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4.4 应用及举例 在实际使用中，配基与欲分离蛋白质之间的亲和力要控制在一定的范围之内，这是因为若亲和力太低，则分离的效果不好;若亲和力太高，则洗脱太困难。因此配基与欲分离蛋白质之间的K D 值一般控制在10 -4 ～10 -6 之间 [15] 。运用亲和层析分离的蛋白质见表5。
表5 应用亲和层析分离的蛋白质 略
5 凝胶层析
5.1 原理 凝胶层析是在装有多孔物质填料的柱中进行的。填料含有许多不同大小的孔，体积大的溶质分子不能进入体积小的孔，而体积小的物质可进入大孔，也可进入小孔，因此在柱中保留的时间比体积大的物质长。于是整个样品按分子量的大小顺序分开，体积最大的物质最先出峰，体积最小的物质最后出峰。
5.2 离子交换剂 常用的GFC介质有纤维素(商品名Sephacel)、交联葡聚糖(商品名Sephadex)、交联琼脂糖(商品 名Sepharose)等。
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5.3 影响因素与洗脱 GFC的分离不依赖于流动相与固定相的相互作用，因此不必使用洗脱剂。但为了降低生物分子和填料之间的非特异相互作用，常适量的提高流动相的盐浓度，一般大于0.05mol/L。
5.4 应用及举例 凝胶层析是真正的层析操作，因此具有回收率高、洗脱条件温和、不发生副反应、介质使用寿命长等优点，但它同时存在处理样品体积小的缺点，因此一般放在分离纯化工艺的最后一步。其应用见表6。
表6 应用凝胶层析分离的蛋白质 略
6 应用举例
6.1 日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶及其定点诱变体的纯化 [20]
6.1.1 GSH亲和层析300ml培养液中收获的细胞悬浮于15ml磷酸盐缓冲—生理盐水中(PBS;140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa 2 HPO 4 ，1.8mM KH 2 PO 4 ，pH7.4)。超声波破碎。细胞裂解上清上GSH Sepharose4B柱，柱床体积200μl，接着用10柱床体积的PBS冲洗3次。接着用400μl的GSH洗脱液(30mM GSH，50mMTris-HCl，pH8)洗脱蛋白。为了除去GSH，洗脱下来的蛋白用PBS4倍稀释，用截止量3500的透析袋，2000体积PBS进行透析。
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6.1.2 IMAC纯化 30ml培养液中收获的细胞悬浮于1.5mlNTA上样缓冲溶液中(0.1M NaH 2PO 4 ，0.1M Tris-HCl，pH8)。超声波破碎。细胞裂解上清与100μl50%的Ni 2+ -NTA凝胶混合，室温下轻轻振摇15min，然后离心。得到的沉淀用10倍柱床体积的含20mM咪唑的NTA上样缓冲液冲洗。用100μlNTA洗脱液(250mM咪唑，0.1MNaH 2 PO 4 ，0.1MTris-HCl，pH8)洗脱蛋白。
6.2 亚油酸(13R)脂加氧酶的分离与纯化 [21]
6.2.1 疏水层析 将培养液与0.55M硫酸铵和2mM NaN 3 (pH7.2)(NaOH)混合，用微孔过滤器(0.45μm，type HA)过滤，滤液上2.6cm×20cm苯-Sepharose柱(0.01M KPB，0.6M硫酸铵)，流速5ml/min。用同样的缓冲液2～3倍柱床体积冲洗。再用0.01M KPB(pH6.8)，0.5mM GSH，2mM NaN 3 ，0.04%Tween20洗脱，即得组分Ⅰ。用5mM KPB(pH6.8)，6M urea，5mM EDTA，0.5mM GSH洗脱即得组分Ⅱ。合并组分Ⅰ与Ⅱ。
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6.2.2 阳离子交换层析 透析后，进一步进行阳离子交换层析(CMSepharose CL-4B，1.8×3cm)用0.01mMKPB(pH6.8)含2mM NaN 3 0.5mM GSH和0.04%Tween20上柱，接着该柱用含0.2MNaCl的相同缓冲液进行洗脱。
6.2.3 亲和层析 用ConA-Sepharose亲合柱(2.8ml)或更 换缓冲液(PD10，Amersham Pharmacia Biotech)用Mono S HR5/5柱层析。The Mono S柱用含0到0.1M NaCl的0.01M KPB(pH6.9)，2mMNaN 3 ，0.5mMGSH，0.04%Tween20的缓冲液进行线性洗脱，20min内洗脱结束。接着用含0.2M NaCl的该缓冲液洗脱。ConA-Sepharose柱用10mM KPB(pH7.3)，0.5M NaCl，2mM NaN 3 ，0.2mM GSH，0.04%Tween20平衡，上样并用相同缓冲液冲洗。酶牢固的结合在ConA-Sepharose上，但是可以用含0.5M甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷的10mM KFB(pH6.0)，0.3MNaCl，2mM NaN 3 ，0.2mMGSH，0.04%Tween20洗脱。纯化的最后一步为凝胶过滤层析(Superdex200HR10/30)0.1MKPB(pH7.3)，0.15M NaCl，1mM GSH，1mM EDTA，3mM NaN 3 ，0.5mMˉCHAPS或6Murea，0.05M KFB(pH7.3)，1mM GSH。出峰后分部收集(0.2ml)并用SDS-PAGE电泳分析。
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7 展望
就目前而言，利用传统的技术，分离纯化阶段的成本占总成本的50%～80% [14] 。即便如此，仍有很多生物技术药物找不到经济可行的分离纯化工艺。随着新的快速高效的高度纯化方法，如组特异性亲和配基的出现，必将有更多新的基因工程药物投入生产和应用，从而改变整个医药行业的面貌。
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作者单位:1 250013 山东省济南市中心医院
2 山东省济南市卫生局信息化服务中心
(编 辑 罗彬), 百拇医药(俞淑文)