rmuIFN-γ增强巨噬细胞抗白念珠菌活性的研究
【摘要】 目的 研究重组小鼠γ-干扰素(rmuIFN-γ)对巨噬细胞抗白念珠菌活性的调节作用。方法 分别将不同浓度的rmuIFN-γ与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养2～5天，然后测定巨噬细胞的抗白念珠菌活性。结果 rmuIFN-γ可增强巨噬细胞的抗白念珠菌活性，并呈剂量依赖性，但随着与巨噬细胞共同培养时间的延长，其增强效应渐降低。结论 rmuIFN-γ具有增强巨噬细胞的抗白念珠菌活性的作用。
关键词 γ-干扰素 巨噬细胞 白念珠菌
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1060-02
Augmentation of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma
Zhang Huali，Chen Xingpin，Chen Bing
, 百拇医药
Department of Dermatology，the Second People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518035.
【Abstract】 Objective To study the effect of recombinant murine interferon-gamma(rmuIFN-γ)on macrophage function against candida albicans.Methods Various concentrations of rmuIFN-γwere co-incubated with murine peritoneal exudated macrophages for two to five days，then growth inhibition of candida albicans by macrophages was assayed.Results rmuINF-γcould enhance the activity of macrophages against candida albicans，and the effects were dose-dependent.And when rmuIFN-γco-incubated for two to five days with macrophages，macrophage candidacidal activity progressively decreased.Conclusion rmuIFN-γcan enhance the activity of macrophage against candida albicans，but the augmentation is not persistent.
, 百拇医药
Key words interferon-gamma macrophage candida albicans
近年来有关白念珠菌感染与机体免疫状况及免疫治疗的研究表明，在系统性白念珠菌感染中，中性粒细胞(PMN)、单核-巨噬细胞(MΦ)以及T淋巴细胞介导的细胞免疫反应起着重要的防御作用。其中单核-巨噬细胞被认为是机体抗白念珠菌的主要防线，包括外周血中的单核细胞和组织中的巨噬细胞，均可被特异或非特异性激活的免疫细胞释放的细胞因子所激活，而成为效应细胞。这些细胞因子包括有γ-干扰素(IFN-γ)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。本研究将重组小鼠γ-干扰素(rmuIFN-γ)与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养不同时间后研究巨噬细胞的抗白念珠菌活性，以探讨IFN-γ对巨噬细胞抗白念珠菌活性的调节作用。
1 材料和方法
1.1 动物 昆明种小白鼠，6～8周龄，体重约25g，由同济医科大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
1.2 主要试剂 ①rmuIFN-γ(PeproTech，1×10 7 U/mg);②巯基乙醇酸钠(TG);③RPMI1640培养基粉(GIBCO公司);④小牛血清(FCS)(杭州三利生物制品厂);⑤沙氏琼脂糖培养基粉;⑥脱氧胆酸钠。
1.3 方法
1.3.1 白念珠菌的分离培养 所有白念珠菌由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠。每次实验前2天将白念珠菌转种到15ml新鲜沙氏氯霉素琼脂培养基上，28℃培养48h，取半环菌落置于PBS中以1500r/min，8min离心洗涤2次，再 用含10%FCS(已灭活)的RPMI1640悬浮并调制成1×10 5 细胞/ml的酵母细胞悬液备用。
1.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养 [1] 小鼠腹腔注射1ml无菌3%TG液，3天后夹除眼球放血，处死小鼠，酒精泡洗后剖腹，用无菌的冷PBS液冲洗腹腔，收集腹腔液6～8ml，离心洗涤(1000r/min，5～10min)2次，再用含10%FCS的RPMI1640调至1×10 6 细胞/ml，置于24孔培养板中(每孔0.2ml)，37℃、5%CO 2 环境下培养2h后用无菌的PBS液洗涤除掉未粘附细胞，重复2次，则剩下附壁细胞85%以上为巨噬细胞，可经Giemsa染色倒置相差显微镜下证实，且台盼蓝染色证实95%以上为活细胞。
, 百拇医药
1.3.3 巨噬细胞抗白念珠菌活性测定 [2] 不同浓度的rmuIFN-γ与小鼠腹腔巨噬细胞在37℃、5%CO 2 环境下共同培养后，弃去旧培养液，无菌PBS液洗涤2次，后加入新的RPMI1640培养基液0.4ml/孔，1×10 5 细胞/ml的白念珠菌0.2ml/孔，将混合液在37℃、5%CO 2环境下孵育3h，之后加入0.1ml2.5%脱氧胆酸钠液，强力吹打以溶解巨噬细胞，混匀稀释2倍后取0.1ml加入无菌培养皿中，随后加入15ml50～60℃沙氏琼脂糖培养液，迅速凝固，37℃倒置培养24h后计算菌落数。巨噬细胞对照组不加rmuIFN-γ，空白对照组不加巨噬细胞及rmuIFN-γ，其余同上。
依据下列公式计算出每孔的CFU/ml及每组的白念珠菌生长抑制率:
每毫升白念珠菌菌落形成单位(CFU/ml)=菌落数×稀释倍数(2)×10
, 百拇医药
白念珠菌生长抑制率=[空白对照组(RPMI1640+白念珠菌)平均CFU/ml-实验组平均CFU/ml]/空白对照组平均CFU/ml×100%
1.3.4 统计学分析 采用SPSS软件作F检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有非常显著性，P>0.05为差异无显著性。
2 结果
2.1 不同浓度rmuIFN-γ对巨噬细胞抗白念珠菌活性的调节作用 将不同浓度的rmuIFN-γ(25、50、100、200U/ml)与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养48h，结果显示:rmuIFN-γ可增强小鼠腹腔渗出巨噬细胞的抗白念珠菌活性，其效应 为剂量依赖性，100U/ml IFN-γ可达最大增强效应，抑菌率为37.40%，但再增加剂量其抑菌效果不再继续增强。见表1。
2.2 rmuIFN-γ增强巨噬细胞抗白念珠菌活性的时间动力学的比较 在同样实验条件下，将100U/ml IFN-γ与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养2d、3d、4d、5d(达2天后换一次液)，结果显示随着与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养时间的延长，rmuIFN-γ对小鼠腹腔巨噬细胞抗白念珠菌活性的增强效应则逐渐有所降低，说明其增强效应不持久。见表2。
, http://www.100md.com
表1 不同浓度rmuIFN-γ对巨噬细胞抗白念珠菌活性的影响略
表2 IFN-γ增强巨噬细胞抗白念珠菌活性的时间动力学的研究略
3 讨论
吞噬细胞(主要包括单核-巨噬细胞和中性粒细胞)是机体抗白念珠菌感染的主要防线，吞噬细胞摄入白念珠菌是宿主防御的第二步，芽生孢子易被消化或被中性粒细胞和巨噬细胞在细胞内杀灭 [3] 。但白念珠菌病患者常存在吞噬功能异常，经研究表明，多种细胞因子可促进巨噬细胞的抗白念珠菌活性。IFN-γ主要作用为激活单核细胞、淋巴细胞和NK细胞，调节细胞因子的生成，诱导巨噬细胞活化，增强巨噬细胞抗白念珠菌活性 [1，2，4] ，其还可直接抑制白念珠菌芽管的形成。
本实验研究结果表明，rmuIFN-γ可增强小鼠腹腔巨噬细胞的抗白念珠菌活性，且效应呈剂量依赖性，100U/ml达最大的增强效应。进一步研究结果表明，随着与小鼠巨噬细胞共同培养时间的延长(2～5d)，IFN-γ对巨噬细胞的增强效应是渐降低的，其增强效应不持久。1993年江文等 [5] 研究结果表明IFN-γ还可增强中性粒细胞的抗白念珠菌活性。综合以上研究结果推断:IFN-γ可望成为系统性白念珠菌病的一种有效辅助治疗药物，其具体疗效、给药 方法及剂量还有待进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Yoshimasa Yamamoto，Thomas M Klein，Mitsugu Tomioka，et al.Differˉential
effects of Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating factor(GM-CSF)in enhancing macrophage resistance to legionella pneuˉmophila vs Candida albicans.Cell Immunol，1997，176(1):75-81.
2 H Paul Remond，Jian Shou，Hubert J Gallagher，et al.Macrophage-deˉpendent candidacidal mechanisms in the murine system.Comparison of murine Kupffer cell and peritoneal macrophage candidacidal mechaˉnisms.J Immunol，1993，150(8Pt1):3427-3433.
, http://www.100md.com
3 王椿森，李家文，黄长征，等.皮肤性病免疫学.武汉:湖北科学技术出版社，1995，181-182.
4 Marodi L，Schreiber S，Anderson DC，et al.Enhancement of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma.Increased phagocytosis-killing，and calcium signal mediated by a decreased number of mannose receptors.J Clin Invest，1993，91(6):2596-2601.
5 江文，陈映玲，周礼义.TNF和IFN-γ对调节中性粒细胞抗白念珠菌活性的研究.中华皮肤科杂志，1994，27(5):278-280.
作者单位:1 518035广东省深圳市第二人民医院皮肤科
2 430030华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科
(收稿日期:2003-09-05)
(编辑 曲全), http://www.100md.com(张华丽)
关键词 γ-干扰素 巨噬细胞 白念珠菌
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1060-02
Augmentation of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma
Zhang Huali，Chen Xingpin，Chen Bing
, 百拇医药
Department of Dermatology，the Second People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518035.
【Abstract】 Objective To study the effect of recombinant murine interferon-gamma(rmuIFN-γ)on macrophage function against candida albicans.Methods Various concentrations of rmuIFN-γwere co-incubated with murine peritoneal exudated macrophages for two to five days，then growth inhibition of candida albicans by macrophages was assayed.Results rmuINF-γcould enhance the activity of macrophages against candida albicans，and the effects were dose-dependent.And when rmuIFN-γco-incubated for two to five days with macrophages，macrophage candidacidal activity progressively decreased.Conclusion rmuIFN-γcan enhance the activity of macrophage against candida albicans，but the augmentation is not persistent.
, 百拇医药
Key words interferon-gamma macrophage candida albicans
近年来有关白念珠菌感染与机体免疫状况及免疫治疗的研究表明，在系统性白念珠菌感染中，中性粒细胞(PMN)、单核-巨噬细胞(MΦ)以及T淋巴细胞介导的细胞免疫反应起着重要的防御作用。其中单核-巨噬细胞被认为是机体抗白念珠菌的主要防线，包括外周血中的单核细胞和组织中的巨噬细胞，均可被特异或非特异性激活的免疫细胞释放的细胞因子所激活，而成为效应细胞。这些细胞因子包括有γ-干扰素(IFN-γ)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。本研究将重组小鼠γ-干扰素(rmuIFN-γ)与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养不同时间后研究巨噬细胞的抗白念珠菌活性，以探讨IFN-γ对巨噬细胞抗白念珠菌活性的调节作用。
1 材料和方法
1.1 动物 昆明种小白鼠，6～8周龄，体重约25g，由同济医科大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
1.2 主要试剂 ①rmuIFN-γ(PeproTech，1×10 7 U/mg);②巯基乙醇酸钠(TG);③RPMI1640培养基粉(GIBCO公司);④小牛血清(FCS)(杭州三利生物制品厂);⑤沙氏琼脂糖培养基粉;⑥脱氧胆酸钠。
1.3 方法
1.3.1 白念珠菌的分离培养 所有白念珠菌由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠。每次实验前2天将白念珠菌转种到15ml新鲜沙氏氯霉素琼脂培养基上，28℃培养48h，取半环菌落置于PBS中以1500r/min，8min离心洗涤2次，再 用含10%FCS(已灭活)的RPMI1640悬浮并调制成1×10 5 细胞/ml的酵母细胞悬液备用。
1.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养 [1] 小鼠腹腔注射1ml无菌3%TG液，3天后夹除眼球放血，处死小鼠，酒精泡洗后剖腹，用无菌的冷PBS液冲洗腹腔，收集腹腔液6～8ml，离心洗涤(1000r/min，5～10min)2次，再用含10%FCS的RPMI1640调至1×10 6 细胞/ml，置于24孔培养板中(每孔0.2ml)，37℃、5%CO 2 环境下培养2h后用无菌的PBS液洗涤除掉未粘附细胞，重复2次，则剩下附壁细胞85%以上为巨噬细胞，可经Giemsa染色倒置相差显微镜下证实，且台盼蓝染色证实95%以上为活细胞。
, 百拇医药
1.3.3 巨噬细胞抗白念珠菌活性测定 [2] 不同浓度的rmuIFN-γ与小鼠腹腔巨噬细胞在37℃、5%CO 2 环境下共同培养后，弃去旧培养液，无菌PBS液洗涤2次，后加入新的RPMI1640培养基液0.4ml/孔，1×10 5 细胞/ml的白念珠菌0.2ml/孔，将混合液在37℃、5%CO 2环境下孵育3h，之后加入0.1ml2.5%脱氧胆酸钠液，强力吹打以溶解巨噬细胞，混匀稀释2倍后取0.1ml加入无菌培养皿中，随后加入15ml50～60℃沙氏琼脂糖培养液，迅速凝固，37℃倒置培养24h后计算菌落数。巨噬细胞对照组不加rmuIFN-γ，空白对照组不加巨噬细胞及rmuIFN-γ，其余同上。
依据下列公式计算出每孔的CFU/ml及每组的白念珠菌生长抑制率:
每毫升白念珠菌菌落形成单位(CFU/ml)=菌落数×稀释倍数(2)×10
, 百拇医药
白念珠菌生长抑制率=[空白对照组(RPMI1640+白念珠菌)平均CFU/ml-实验组平均CFU/ml]/空白对照组平均CFU/ml×100%
1.3.4 统计学分析 采用SPSS软件作F检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有非常显著性，P>0.05为差异无显著性。
2 结果
2.1 不同浓度rmuIFN-γ对巨噬细胞抗白念珠菌活性的调节作用 将不同浓度的rmuIFN-γ(25、50、100、200U/ml)与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养48h，结果显示:rmuIFN-γ可增强小鼠腹腔渗出巨噬细胞的抗白念珠菌活性，其效应 为剂量依赖性，100U/ml IFN-γ可达最大增强效应，抑菌率为37.40%，但再增加剂量其抑菌效果不再继续增强。见表1。
2.2 rmuIFN-γ增强巨噬细胞抗白念珠菌活性的时间动力学的比较 在同样实验条件下，将100U/ml IFN-γ与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养2d、3d、4d、5d(达2天后换一次液)，结果显示随着与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养时间的延长，rmuIFN-γ对小鼠腹腔巨噬细胞抗白念珠菌活性的增强效应则逐渐有所降低，说明其增强效应不持久。见表2。
, http://www.100md.com
表1 不同浓度rmuIFN-γ对巨噬细胞抗白念珠菌活性的影响略
表2 IFN-γ增强巨噬细胞抗白念珠菌活性的时间动力学的研究略
3 讨论
吞噬细胞(主要包括单核-巨噬细胞和中性粒细胞)是机体抗白念珠菌感染的主要防线，吞噬细胞摄入白念珠菌是宿主防御的第二步，芽生孢子易被消化或被中性粒细胞和巨噬细胞在细胞内杀灭 [3] 。但白念珠菌病患者常存在吞噬功能异常，经研究表明，多种细胞因子可促进巨噬细胞的抗白念珠菌活性。IFN-γ主要作用为激活单核细胞、淋巴细胞和NK细胞，调节细胞因子的生成，诱导巨噬细胞活化，增强巨噬细胞抗白念珠菌活性 [1，2，4] ，其还可直接抑制白念珠菌芽管的形成。
本实验研究结果表明，rmuIFN-γ可增强小鼠腹腔巨噬细胞的抗白念珠菌活性，且效应呈剂量依赖性，100U/ml达最大的增强效应。进一步研究结果表明，随着与小鼠巨噬细胞共同培养时间的延长(2～5d)，IFN-γ对巨噬细胞的增强效应是渐降低的，其增强效应不持久。1993年江文等 [5] 研究结果表明IFN-γ还可增强中性粒细胞的抗白念珠菌活性。综合以上研究结果推断:IFN-γ可望成为系统性白念珠菌病的一种有效辅助治疗药物，其具体疗效、给药 方法及剂量还有待进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Yoshimasa Yamamoto，Thomas M Klein，Mitsugu Tomioka，et al.Differˉential
effects of Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating factor(GM-CSF)in enhancing macrophage resistance to legionella pneuˉmophila vs Candida albicans.Cell Immunol，1997，176(1):75-81.
2 H Paul Remond，Jian Shou，Hubert J Gallagher，et al.Macrophage-deˉpendent candidacidal mechanisms in the murine system.Comparison of murine Kupffer cell and peritoneal macrophage candidacidal mechaˉnisms.J Immunol，1993，150(8Pt1):3427-3433.
, http://www.100md.com
3 王椿森，李家文，黄长征，等.皮肤性病免疫学.武汉:湖北科学技术出版社，1995，181-182.
4 Marodi L，Schreiber S，Anderson DC，et al.Enhancement of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma.Increased phagocytosis-killing，and calcium signal mediated by a decreased number of mannose receptors.J Clin Invest，1993，91(6):2596-2601.
5 江文，陈映玲，周礼义.TNF和IFN-γ对调节中性粒细胞抗白念珠菌活性的研究.中华皮肤科杂志，1994，27(5):278-280.
作者单位:1 518035广东省深圳市第二人民医院皮肤科
2 430030华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科
(收稿日期:2003-09-05)
(编辑 曲全), http://www.100md.com(张华丽)