低温灌注、深低温冷冻对同种异体肢体移植排斥反应的影响
【摘要】 目的 建立合适的同种异体肢体移植动物模型，研究低温灌注、深低温冷冻供肢对异体肢体移植的影响。方法 Wistar大鼠为供者，SD大鼠为受者。按供肢是否进行一次性深低温冷冻处理将受者分为非冷冻组和冷冻组。切除SD大鼠的相应肢体，将Wistar大鼠的肢体移植给SD大鼠。术后长效青霉素抗炎治疗，观察宿主及移植物的变化情况。结果 共进行大鼠异体肢体移植20例(非冷冻组和冷冻组各10例)非冷冻组成功8例，移植肢体存活时间为(8.0±2.2)天;冷冻组成功8例，移植肢体存活时间为(14.0±4.2)天;两组移植物的存活时间差异有显著性(P<0.05)。结论 深低温冷冻供体可明显延长移植组织的存活时间，对急性排斥反应有显著的防治作用。
关键词 同种异体肢体移植 冷冻深低温保存 排斥反应 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)11-0968-03
Effect of deep cryopreservation on limb allograft rejection in adult rats Mo Jiadong，Li Jiandong，Song Jianrong，et al.
, http://www.100md.com
Department of Orthopedics，Xiehe Hospital Affiliated Fujian Medical University，Fuzhou350001.
【Abstract】 Objective To establish appropriate animal models for observing the effects of deep cryopreservaˉtion on limb allograft rejection.Methods Wistarrats were used as donators and SD rats as recipients，the latter dividˉed into2groups，namely deep cryopreservation group and non-deep cryopreservation group according to pretransplant treatment with or without deep cryopreservation on thedonor limbs.The donor limbs were transplanted into SD rats who had their own limbs cut off，and the sciatic nerve，femoral nerve，and femoral artery and femoral vein were anastomosed in operation.After the operation，all the recipients were given benzathine berzylpenicillin，and their vital signs，together with changes of the allografts，were observed.Results A total of20rats received transplantation that was successful，in8rats of non-deep cryopreservation group and8of deepcryopreservation group.The graft survival averaged8.0±2.2d in non-deep cryopreservation group and14.0±4.2d in deep cryopreservation group，showing significant differˉence in the lengths of survival between the2groups(P<0.05).Conclusion The graft survival time in rats can be significantly prolonged by pretransplant deep cryopreservation of the allograft，which also help control acute rejection of the allograft.
, 百拇医药
Key words limb allograft deep cryopreservation rejection rat
肢体内大块组织乃至整个肢体缺失属于复合组织缺失，对其治疗是医学界的难题之一。随着临床异体手移植取得初步成功，有关肢体移植的动物实验及基础研究也需相应地得到发展 [1，2] 。本实验利用深低温冷冻保存供肢的同种异体肢体移植，建立合适的同种异体肢体移植动物模型，研究深低温冷冻供肢对异体肢体移植排斥反应的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康清洁级雄性大鼠30只，包括10只Wistar大鼠和20只SD大鼠，体重200～250g。10只Wistar大鼠作为供者，20只SD大鼠作受体，其中非冷冻组:10只，将5只Wistar:10只，将5只Wistar大鼠肢体离断后经深低温冷藏处理后行同种异体肢体移植并观察。10只供体鼠截取移植肢体后即处死。
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1.2 同种异体移植肢体的制备
1.2.1 麻醉与切口 每次手术需Wistar大鼠1只(供者)和SD大鼠2只(受者)。以1%的戊巴比妥钠腹腔注射(40～50mg/kg·b·w)麻醉，然后置大鼠于仰卧位，将其四肢牵向 两侧固定于手术台上，用8%硫化钠脱毛剂去掉供体供肢及受体相应肢体手术部位区域的体毛，在双目手术显微镜下进行手术。供体以腹股沟韧带下1.2cm、膝关节上2.0cm、耻骨下1.2cm三点连成的环形线为供肢的切口;受体相应肢体以腹股沟韧带下2.0cm、膝关节上1.4cm、耻骨下2.0cm三点连成的环形线为截肢部位的切口。
1.2.2 供肢的截取及处理 从Wistar大鼠股内侧开始切开皮肤及皮下脂肪组织，暴露股动、静脉，腹壁浅动、静脉，保护股动、静脉，结扎腹壁浅动、静脉。首先切断股内侧肌群，暴露坐骨神经，向上游离，切取较长的坐骨神经以减少移植时的张力;然后切断外侧肌群及后侧肌群，手术中注意保护股动、静脉及坐骨神经;再尽量向上游离股动、静脉，断离股动、静脉，从股骨中段锯断股骨。4℃UW液经股动脉冲洗供肢内的残血，至股静脉流出的液体色泽变淡为止。再用4℃15%二甲亚砜(DMSO)灌注血管床，冲洗和灌注血管床的时间<10min，压力<8kPa(1kPa=7.5mmHg)。湿盐水纱布保护供肢待用。供体大鼠截取肢体后即处死。然后将离断肢体无菌敷料包裹、塑料袋封装，放入4℃冰箱20min后取出，再放入-20℃、-40℃冰箱各20min，最后放入-86℃深低温冰箱，冷存1天后备用。复温用37℃恒温水浴箱快速复温。非冷冻组的同种异体肢体移植在供肢切取、灌注血管床后，直接移植到受体上，不需冷存。
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1.2.3 受体大鼠手术区的准备 过程同上，但不结扎腹壁浅动、静脉。切断肌肉的平面比供肢切取的平面向下。血管夹阻断股动、静脉，尽量留下较多的可以利用的股动静脉及坐骨神经，以减轻移植时因为血管及神经的回缩造成的张力，从股骨中段锯断股骨，丢弃从受体上离断的肢体。
1.2.4 同种异体肢体移植的手术过程与技术操作 用1.0 mm克氏针将供肢与受体残端的股骨断端作髓腔内固定牢固。先缝合移植肢体后外侧的肌肉及皮肤，再在手术显微镜下用9-0缝合线缝合神经外膜，吻合坐骨神经;缝合外侧及内侧的肌群，用11-0缝合线于10倍显微镜下吻合相应的股动脉4～6针、股静脉6～8针。吻合股神经，去掉血管夹，待移植的肢体血运良好，关闭伤口。
1.3 术后处理 受体大鼠术后立即肌肉注射长效青霉素12万U，大鼠清醒后即喂葡萄糖盐水2ml。单独笼养，保暖，使室温保持在20～25℃。按异体肢体移植术后常规护理、饲养，观察记录。
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1.4 观察方法 宿主情况包括精神状况、饮食、大小便、生命体征、皮肤体毛。移植物的观察包括移植物的热缺血时间，手术后移植物的血运、肿胀、颜色、温度、体毛的变化、皮肤水疱、渗出、溃疡、糜烂、焦痂、足趾变黑坏死等。
1.5 统计学处理 应用SPSS统计软件，采用独立样本的t检验。
2 结果
共行大鼠的异体肢体移植20例，成功16例，成功率80%，其中非冷冻组8例，冷冻组8例。失败4例，其中1例因手术损伤大、出血多，死于DIC;2例因出血性休克死亡;1例发生移植肢体静脉危象致移植物坏死。
宿主及移植物情况:大鼠手术后一般于15～25min清醒，可以饮水、行走、舔移植肢体或伤口，40～55min恢复大小便，3～5h基本上可以饮食，但精神状况较差;1天后宿主的精神状况、饮食、大小便、生命体征、皮毛与手术前相比均无明显差异。手术后1～3天移植肢体皮温较健侧肢体稍高，移植肢体肿胀较轻，血运良好。4～5天移植肢体开始肿胀，出现皮肤红斑和皮下水肿，先是移植肢体的上端和足背部，并迅速加重和扩展，移植肢体的体毛于术后3天与宿主的体毛相比变得暗淡且无光泽，6～8天左右变湿，肢体毛发开始脱落，并有广泛的焦痂形成，皮肤糜烂以大腿的内上侧出现最早，以后是足趾，最后是膝部及大腿的外上部，8～10天移植肢体变黑坏死。冷冻组移植物的肿胀及坏死时间明显向后推迟(表1)。非冷冻组移植肢体的体毛较宿主的体毛日益变暗淡、无光泽。冷冻组移植肢体的体毛与宿主的体毛相似，尔后随着时间延伸移植物的肿胀逐渐加重，体毛没有脱落，其肿胀及坏死的过程较非冷冻组缓慢，移植物自远断端和向近端逐渐坏死。表1 大鼠同种异体肢体移植非冷冻组与冷冻组移植物生存时间及热缺血时间(略)
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3 讨论
移植肢体长期存活的关键在于选择与受者组织相容性抗原有高度一致的供者，但在临床实际中却极难达到。因此，排斥反应的发生是异体肢体移植成功的主要障碍。为使移植肢体长期成活，必须采取免疫抑制措施。目前，常用的免疫抑制措施有使用化学及生物免疫抑制剂、脾切除等，但皆不尽人意。因此，寻找新的方法势在必行。瞿玉兴等 [3，4] 报告超低温冷冻保存后同种异体动脉移植和神经移植成功，与自体移植无显著差别，并认为经冷冻处理后可降低供体的抗原性，使排斥反应减弱。张子清等 [5] 报告冷冻干燥同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损成功，术后未发现有排斥反应。解先宽等 [6] 报告深低温
冷存吻合血管异体长骨修复大块骨缺损成功，认为深低温冷存可降低带血管异体骨的抗原性，从而抑制吻合血管异体长骨移植的排斥反应。由此，人们期望通过冷冻保存大鼠异体肢体移植的供体，降低异体肢体移植的免疫排斥反应，来延长移植肢体存活时间。目前，应用于同种异体肢体移植的常见动物有大鼠、猪、狒狒及恒河猴等 [7～10] 。由于大鼠肢体移植手术简单，且大鼠在种系上与人类比较接近，对各种药物的反应与人类基本相同，因此，我们选用大鼠制成动物模型进行研究。
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深低温在一定条件下可以保存组织细胞的活性，但在一定条件下也可以对组织细胞造成严重损伤。深低温可降低异体肢体的抗原性，减轻移植后的排斥反应，并保持了一定的生物及物理学性能。同种异体移植时，引起免疫排斥反应的细胞抗原主要是MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原。其中，MHC-Ⅰ抗原主要存在于所有有核细胞的表面，而MHC-Ⅱ抗原主要存在于B淋巴细胞以及树突状细胞和巨噬细胞的表面，后两者均为骨髓起源的细胞，并常残留于移植物中，被称为“过路细胞(passenger cell，PC)”。当移植物恢复血流灌注后，PC经过直接识别途径激活T淋巴细胞，这在早期的急性排斥反应中起重要作用。同时，人类毛细血管的内皮细胞能区别于啮齿类动物而强烈表达MHC-Ⅱ抗原，并经间接识别途径在急性排斥反应的晚期和慢性排斥反应中起更为重要的作用。深低温降低异体组织的抗原性的机制可能是冷冻破坏了细胞表面的抗原结构，使血管内皮细胞坏死脱落与再生保持相对的平衡状态，有利于血管内皮的修复，保持血管的通畅，以保障供肢的血供。胡汝麒等 [11] 将带血管蒂的骨瓣用二甲亚砜(DMSO)作低温保护剂，经二步降温法通畅率较好。本实验用分段降温法，先降温至4℃，再降至-20℃、-40℃、-86℃冷冻，使用时用37℃恒温水浴箱快速复温，效果较好。
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同种异体移植急性排斥的时间多在术后1～2周左右。本实验中非冷冻组移植物的存活时间为(8.0±2.0)天，移植肢体的水肿、皮肤溃烂、焦痂、脱毛、坏死等急性排斥反应的症状相继再现，证实建立的大鼠异体肢体移植模型成立。而冷冻组移植的肢体成活时间延长至(14.0±4.2)天;同时移植肢体出现水肿、皮肤溃烂、焦痂、坏死时间明显向后推迟，并且较非冷冻组进展缓慢，统计学处理显示冷冻组移植物的生存时间与非冷冻组相比有明显差异(P<0.05)。因此，手术前对供肢进行深低温冷冻保存可以降低移植肢体的免疫原性，延迟移植排斥反应的发生，延长移植肢体的存活时间。此实验研究结果说明，大鼠同种异体肢体移植前对供肢进行深低温冷冻1天处理，对移植的急性排斥反应有显著的预防和治疗作用。
实验中的难点及存在的问题是:大鼠的血容量少，失血量较多时无法进行输血;移植肢体的股动脉细、短、分支多，静脉壁特别薄，可供吻合的动、静脉均仅有1根;股骨细、不规则，壁薄，易碎，因此熟悉大鼠的肢体解剖是进行异体肢体移植的基础，熟练的显微外科操作是成功的保证。
, 百拇医药
移植肢体的存活质量与多种因素有关。如主要组织相容性配型因素、移植时操作时间的长短、供肢受深低温冷冻保存时间的长短等有关。同种异体复合组织的冷冻保存技术还有待于进一步研究;寻找合适的方法，将对组织(尤其是毛细血管床)的损伤减小至最低限度，同时适当地调整抗原的表达，以及冷冻保存对急性排斥反应的防治机制等，是我们正在和将要研究的课题。
参考文献
1 Jones JW，Gruber SA，Barker JH，et al.Successful hand transplantation:one-year follow-up.N Engl J Med，2000，343:468-473.
2 裴国献，顾立强，于立新，等.异体手移植二例报道.中华医学杂志，2000，80:417-421.
3 瞿玉兴，董天华，张志霖，等.超低温冷冻保存后同种异体动脉移植的实验研究.中华手外科杂志，2002，18:122-124.
, 百拇医药
4 瞿玉兴，董天华，张志霖，等.超低温冷冻保存后同种异体神经移植的实验研究.中华手外科杂志，2002，18:59-62.
5 张子清，李文翠，杨延军，等.冷冻干燥同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的疗效观察.中华手外科杂志，2001，17:131-132.
6 解先宽，顾洁夫，蔡林，等.深低温冷存的吻合血管同种异体长骨移植的实验研究.中国矫形外科杂志，2002，9:678-681.
7 Fealy MJ，Umansky WS，Bickel KD，et al.Efficacy of rapamycin and FK506in prolonging rat hind limballograft survival Ann Surg，1994，219(1):88-93.
8 Uestuener ET，Zdichavsky M，Ren X，et al.Long term composite tissue allograft survival in porcine model with cyclosporine/my-cophenolate mofetil therapy.Transplantation，1998，66:1581-1587.
, 百拇医药
9 Daniel PK，Egerszegi EP，Sumulack DD，et al.Tissue transplants in priˉmates for upper extremity reconstruction:A preliminary report J Hand Surg，1986，11(1):1-7.
10 Rebellato L，Gross U，CarverM，et al.Treatment of rhesus monkey alloˉgraft recipients.Transplant Proc，1993，25(1Pt1):589-598.
11 胡汝麒，周健生，沈跃良，等.冷冻保存异体活骨移植实验研究与临床应用.中华显微外科杂志，1994，17:120-123.
(收稿日期:2003-06-23)
(编辑纪永健)
作者单位:350001福建医科大学附属协和医院骨科, 百拇医药(莫家栋)
关键词 同种异体肢体移植 冷冻深低温保存 排斥反应 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)11-0968-03
Effect of deep cryopreservation on limb allograft rejection in adult rats Mo Jiadong，Li Jiandong，Song Jianrong，et al.
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Department of Orthopedics，Xiehe Hospital Affiliated Fujian Medical University，Fuzhou350001.
【Abstract】 Objective To establish appropriate animal models for observing the effects of deep cryopreservaˉtion on limb allograft rejection.Methods Wistarrats were used as donators and SD rats as recipients，the latter dividˉed into2groups，namely deep cryopreservation group and non-deep cryopreservation group according to pretransplant treatment with or without deep cryopreservation on thedonor limbs.The donor limbs were transplanted into SD rats who had their own limbs cut off，and the sciatic nerve，femoral nerve，and femoral artery and femoral vein were anastomosed in operation.After the operation，all the recipients were given benzathine berzylpenicillin，and their vital signs，together with changes of the allografts，were observed.Results A total of20rats received transplantation that was successful，in8rats of non-deep cryopreservation group and8of deepcryopreservation group.The graft survival averaged8.0±2.2d in non-deep cryopreservation group and14.0±4.2d in deep cryopreservation group，showing significant differˉence in the lengths of survival between the2groups(P<0.05).Conclusion The graft survival time in rats can be significantly prolonged by pretransplant deep cryopreservation of the allograft，which also help control acute rejection of the allograft.
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Key words limb allograft deep cryopreservation rejection rat
肢体内大块组织乃至整个肢体缺失属于复合组织缺失，对其治疗是医学界的难题之一。随着临床异体手移植取得初步成功，有关肢体移植的动物实验及基础研究也需相应地得到发展 [1，2] 。本实验利用深低温冷冻保存供肢的同种异体肢体移植，建立合适的同种异体肢体移植动物模型，研究深低温冷冻供肢对异体肢体移植排斥反应的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康清洁级雄性大鼠30只，包括10只Wistar大鼠和20只SD大鼠，体重200～250g。10只Wistar大鼠作为供者，20只SD大鼠作受体，其中非冷冻组:10只，将5只Wistar:10只，将5只Wistar大鼠肢体离断后经深低温冷藏处理后行同种异体肢体移植并观察。10只供体鼠截取移植肢体后即处死。
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1.2 同种异体移植肢体的制备
1.2.1 麻醉与切口 每次手术需Wistar大鼠1只(供者)和SD大鼠2只(受者)。以1%的戊巴比妥钠腹腔注射(40～50mg/kg·b·w)麻醉，然后置大鼠于仰卧位，将其四肢牵向 两侧固定于手术台上，用8%硫化钠脱毛剂去掉供体供肢及受体相应肢体手术部位区域的体毛，在双目手术显微镜下进行手术。供体以腹股沟韧带下1.2cm、膝关节上2.0cm、耻骨下1.2cm三点连成的环形线为供肢的切口;受体相应肢体以腹股沟韧带下2.0cm、膝关节上1.4cm、耻骨下2.0cm三点连成的环形线为截肢部位的切口。
1.2.2 供肢的截取及处理 从Wistar大鼠股内侧开始切开皮肤及皮下脂肪组织，暴露股动、静脉，腹壁浅动、静脉，保护股动、静脉，结扎腹壁浅动、静脉。首先切断股内侧肌群，暴露坐骨神经，向上游离，切取较长的坐骨神经以减少移植时的张力;然后切断外侧肌群及后侧肌群，手术中注意保护股动、静脉及坐骨神经;再尽量向上游离股动、静脉，断离股动、静脉，从股骨中段锯断股骨。4℃UW液经股动脉冲洗供肢内的残血，至股静脉流出的液体色泽变淡为止。再用4℃15%二甲亚砜(DMSO)灌注血管床，冲洗和灌注血管床的时间<10min，压力<8kPa(1kPa=7.5mmHg)。湿盐水纱布保护供肢待用。供体大鼠截取肢体后即处死。然后将离断肢体无菌敷料包裹、塑料袋封装，放入4℃冰箱20min后取出，再放入-20℃、-40℃冰箱各20min，最后放入-86℃深低温冰箱，冷存1天后备用。复温用37℃恒温水浴箱快速复温。非冷冻组的同种异体肢体移植在供肢切取、灌注血管床后，直接移植到受体上，不需冷存。
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1.2.3 受体大鼠手术区的准备 过程同上，但不结扎腹壁浅动、静脉。切断肌肉的平面比供肢切取的平面向下。血管夹阻断股动、静脉，尽量留下较多的可以利用的股动静脉及坐骨神经，以减轻移植时因为血管及神经的回缩造成的张力，从股骨中段锯断股骨，丢弃从受体上离断的肢体。
1.2.4 同种异体肢体移植的手术过程与技术操作 用1.0 mm克氏针将供肢与受体残端的股骨断端作髓腔内固定牢固。先缝合移植肢体后外侧的肌肉及皮肤，再在手术显微镜下用9-0缝合线缝合神经外膜，吻合坐骨神经;缝合外侧及内侧的肌群，用11-0缝合线于10倍显微镜下吻合相应的股动脉4～6针、股静脉6～8针。吻合股神经，去掉血管夹，待移植的肢体血运良好，关闭伤口。
1.3 术后处理 受体大鼠术后立即肌肉注射长效青霉素12万U，大鼠清醒后即喂葡萄糖盐水2ml。单独笼养，保暖，使室温保持在20～25℃。按异体肢体移植术后常规护理、饲养，观察记录。
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1.4 观察方法 宿主情况包括精神状况、饮食、大小便、生命体征、皮肤体毛。移植物的观察包括移植物的热缺血时间，手术后移植物的血运、肿胀、颜色、温度、体毛的变化、皮肤水疱、渗出、溃疡、糜烂、焦痂、足趾变黑坏死等。
1.5 统计学处理 应用SPSS统计软件，采用独立样本的t检验。
2 结果
共行大鼠的异体肢体移植20例，成功16例，成功率80%，其中非冷冻组8例，冷冻组8例。失败4例，其中1例因手术损伤大、出血多，死于DIC;2例因出血性休克死亡;1例发生移植肢体静脉危象致移植物坏死。
宿主及移植物情况:大鼠手术后一般于15～25min清醒，可以饮水、行走、舔移植肢体或伤口，40～55min恢复大小便，3～5h基本上可以饮食，但精神状况较差;1天后宿主的精神状况、饮食、大小便、生命体征、皮毛与手术前相比均无明显差异。手术后1～3天移植肢体皮温较健侧肢体稍高，移植肢体肿胀较轻，血运良好。4～5天移植肢体开始肿胀，出现皮肤红斑和皮下水肿，先是移植肢体的上端和足背部，并迅速加重和扩展，移植肢体的体毛于术后3天与宿主的体毛相比变得暗淡且无光泽，6～8天左右变湿，肢体毛发开始脱落，并有广泛的焦痂形成，皮肤糜烂以大腿的内上侧出现最早，以后是足趾，最后是膝部及大腿的外上部，8～10天移植肢体变黑坏死。冷冻组移植物的肿胀及坏死时间明显向后推迟(表1)。非冷冻组移植肢体的体毛较宿主的体毛日益变暗淡、无光泽。冷冻组移植肢体的体毛与宿主的体毛相似，尔后随着时间延伸移植物的肿胀逐渐加重，体毛没有脱落，其肿胀及坏死的过程较非冷冻组缓慢，移植物自远断端和向近端逐渐坏死。表1 大鼠同种异体肢体移植非冷冻组与冷冻组移植物生存时间及热缺血时间(略)
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3 讨论
移植肢体长期存活的关键在于选择与受者组织相容性抗原有高度一致的供者，但在临床实际中却极难达到。因此，排斥反应的发生是异体肢体移植成功的主要障碍。为使移植肢体长期成活，必须采取免疫抑制措施。目前，常用的免疫抑制措施有使用化学及生物免疫抑制剂、脾切除等，但皆不尽人意。因此，寻找新的方法势在必行。瞿玉兴等 [3，4] 报告超低温冷冻保存后同种异体动脉移植和神经移植成功，与自体移植无显著差别，并认为经冷冻处理后可降低供体的抗原性，使排斥反应减弱。张子清等 [5] 报告冷冻干燥同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损成功，术后未发现有排斥反应。解先宽等 [6] 报告深低温
冷存吻合血管异体长骨修复大块骨缺损成功，认为深低温冷存可降低带血管异体骨的抗原性，从而抑制吻合血管异体长骨移植的排斥反应。由此，人们期望通过冷冻保存大鼠异体肢体移植的供体，降低异体肢体移植的免疫排斥反应，来延长移植肢体存活时间。目前，应用于同种异体肢体移植的常见动物有大鼠、猪、狒狒及恒河猴等 [7～10] 。由于大鼠肢体移植手术简单，且大鼠在种系上与人类比较接近，对各种药物的反应与人类基本相同，因此，我们选用大鼠制成动物模型进行研究。
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深低温在一定条件下可以保存组织细胞的活性，但在一定条件下也可以对组织细胞造成严重损伤。深低温可降低异体肢体的抗原性，减轻移植后的排斥反应，并保持了一定的生物及物理学性能。同种异体移植时，引起免疫排斥反应的细胞抗原主要是MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原。其中，MHC-Ⅰ抗原主要存在于所有有核细胞的表面，而MHC-Ⅱ抗原主要存在于B淋巴细胞以及树突状细胞和巨噬细胞的表面，后两者均为骨髓起源的细胞，并常残留于移植物中，被称为“过路细胞(passenger cell，PC)”。当移植物恢复血流灌注后，PC经过直接识别途径激活T淋巴细胞，这在早期的急性排斥反应中起重要作用。同时，人类毛细血管的内皮细胞能区别于啮齿类动物而强烈表达MHC-Ⅱ抗原，并经间接识别途径在急性排斥反应的晚期和慢性排斥反应中起更为重要的作用。深低温降低异体组织的抗原性的机制可能是冷冻破坏了细胞表面的抗原结构，使血管内皮细胞坏死脱落与再生保持相对的平衡状态，有利于血管内皮的修复，保持血管的通畅，以保障供肢的血供。胡汝麒等 [11] 将带血管蒂的骨瓣用二甲亚砜(DMSO)作低温保护剂，经二步降温法通畅率较好。本实验用分段降温法，先降温至4℃，再降至-20℃、-40℃、-86℃冷冻，使用时用37℃恒温水浴箱快速复温，效果较好。
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同种异体移植急性排斥的时间多在术后1～2周左右。本实验中非冷冻组移植物的存活时间为(8.0±2.0)天，移植肢体的水肿、皮肤溃烂、焦痂、脱毛、坏死等急性排斥反应的症状相继再现，证实建立的大鼠异体肢体移植模型成立。而冷冻组移植的肢体成活时间延长至(14.0±4.2)天;同时移植肢体出现水肿、皮肤溃烂、焦痂、坏死时间明显向后推迟，并且较非冷冻组进展缓慢，统计学处理显示冷冻组移植物的生存时间与非冷冻组相比有明显差异(P<0.05)。因此，手术前对供肢进行深低温冷冻保存可以降低移植肢体的免疫原性，延迟移植排斥反应的发生，延长移植肢体的存活时间。此实验研究结果说明，大鼠同种异体肢体移植前对供肢进行深低温冷冻1天处理，对移植的急性排斥反应有显著的预防和治疗作用。
实验中的难点及存在的问题是:大鼠的血容量少，失血量较多时无法进行输血;移植肢体的股动脉细、短、分支多，静脉壁特别薄，可供吻合的动、静脉均仅有1根;股骨细、不规则，壁薄，易碎，因此熟悉大鼠的肢体解剖是进行异体肢体移植的基础，熟练的显微外科操作是成功的保证。
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移植肢体的存活质量与多种因素有关。如主要组织相容性配型因素、移植时操作时间的长短、供肢受深低温冷冻保存时间的长短等有关。同种异体复合组织的冷冻保存技术还有待于进一步研究;寻找合适的方法，将对组织(尤其是毛细血管床)的损伤减小至最低限度，同时适当地调整抗原的表达，以及冷冻保存对急性排斥反应的防治机制等，是我们正在和将要研究的课题。
参考文献
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(收稿日期:2003-06-23)
(编辑纪永健)
作者单位:350001福建医科大学附属协和医院骨科, 百拇医药(莫家栋)