血管性痴呆大鼠海马碱性成纤维细胞生长因子的表达
【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在血管性痴呆的发病机制中的作用。方法 采用永久性双侧颈总动脉结扎法致老龄大鼠慢性前脑血流灌注不足，建立老龄大鼠血管性痴呆(VD)模型，用免疫组化染色和图像分析大鼠脑碱性成纤维细胞生长因子的表达。结果 结扎1个月后大鼠建成血管性痴呆模型，此时大鼠海马结构bFGF表达较对照组有明显升高，而两个月后两组大鼠海马均有少量bFGF表达，但两者差异无显著性。结论 血管性痴呆大鼠有学习记忆障碍，早期bFGF表达明显增高。
关键词 痴呆 血管性 海马 碱性成纤维细胞生长因子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0769-02
Expression of basic fibroblast growth factor in hippocampus
tissue of vascular dementia rats
, http://www.100md.com
Huang Yan，Wang Wei，Zhang Geng，et al.
Division of Anatomy，Histology and Embryology，Fujian Medical University，Fuzhou 350004.
【Abstract】 Objective To investigate the role of basic fibroblast growth factor(bFGF)in the mechanism of vascular dementia.Methods Aged rats were treated with a permanent bilateral occlusion of both common carotid arˉteries(2-VO)for establishing vascular dementia model.Basic fibroblast growth factor expression was investigated by immunohistochemical staining and images analysis.Results Immunohistochemical staining showed that few bFGF proˉtein were expressed in the cells of hippocampus.The expression is significant difference between the vascular dementia group and the control group.Conclusion The rats with vascular dementia may be in learnig and memory disorder，one month later，the basic fibroblast growth factor expression in hippocampus has increased.But two months later，the exˉpression in hippocampus has decreased to be closed to the normal level.
, 百拇医药
Key words dementia vascular hippocampus basic fibroblast growth factor
血管性痴呆(vascular dementia，VD)是最常见的老年期痴呆之一，主要是由于脑血管因素引起的脑组织血液循环障碍，脑部机能减退而致的一种认知功能缺损的综合征。在中枢神经系统内，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在保护神经元免受各种因素所致的神经元变性和死亡中发挥着重要作用。本实验通过免疫组化染色观察血管性痴呆大鼠脑bFGF的表达，探讨bFGF在血管性痴呆的发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选用本校实验动物中心提供的老龄健康雄性SD大鼠，体重300～400g。以Morris水迷宫实验筛选学习记忆良好的大鼠40只，随机分为假手术组和手术组(n=20)。
, 百拇医药
1.2 模型制作方法 参照Ohta等 [1] 制作慢性脑灌注不足动物模型。大鼠术前12h禁食，4h禁水。用2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈前正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，缝合切口，手术后动物送至有通风和空调设备的动物房饲养。对照组动物仅行颈前正中切开，不结扎颈总动脉，缝合。
1.3 行为检测 术后30天用Morris水迷宫进行定向航行 实验 [2] ，观察大鼠逃避潜伏期。
1.4 免疫组化染色 行为检测完，再随机将手术组和对照组分为两组，其中一组术后35天，用2%戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔麻醉动物，掀开颅盖，向颅腔内注入预冷的中性福尔马林，取含海马结构的脑组织，固定于中性福尔马林，置4℃冰箱过夜，脱水、透明、常规石蜡包埋，冠状连续切片(4μm)，海马组织每10张取1张进行免疫化学染色。另一组再饲养1个月，再行上述实验。bFGF试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，抗体稀释度为1:30，染色步骤按试剂盒说明书进行，经DAB显色，阳性细胞呈棕色颗粒，用PBS代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
1.5 图像分析 用Motic Images Advanced3.0系统对大鼠海马区灰度进行分析。所有测量在相同光学条件下进行。
1.6 统计学处理 实验数据用均数±标准差表示，各组均数之间的比较采用配对t检验。
2 结果
2.1 行为学检查结果 双侧颈总动脉完全阻断后出现短暂惊厥，体温降低，呼吸减慢，翻正反射消失;术后早期观察动物运动减少，后肢呈“八”字，走路共济失调，或爬行和转圈;手术组术后死亡2只，假手术组无死亡。术后2周已基本恢复，无明显的运动障碍。
2.2 术后1个月和2个月各组大鼠平均逃避潜伏期比较 见表1。
表1 各组大鼠平均逃避潜伏期比较(略)
2.3 免疫组织化学及图像分析结果 见表2。术后1个月与假手术组比较，手术组大鼠海马结构bFGF免疫反应阳性细胞较多，经图像分析结果表明，与假手术组比较灰度值差异有显著性。术后2个月两组灰度值差异无显著性。
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表2 大鼠海马免疫反应产物灰度值比较(略)
3 讨论
建立可复制的可靠动物模型是研究血管性痴呆发生发展机制及防治措施、疗效评价的关键。范文辉 [3] 等证实持久性双侧颈总动脉结扎可造成稳定的不完全性前脑缺血模型，该法造成前脑供血大幅度下降，更接近慢性脑灌注不足时脑组织病理生理演变过程。本研究采用持久性双侧颈总动脉结扎，30天后，用Morris水迷宫试验，发现大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长，出现了明显的学习记忆功能障碍，空间定位、识别能力有所损伤。拟“血管性痴呆”的动物模型的制作是成功的。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是中枢神经系统内介导生长和修复因子之一，脑内bFGF的含量高低依次为海马、大脑皮层、嗅球、基底前脑、小脑及纹状体 [4] 。虽然其含量甚微，但对中枢神经系统神经细胞的发育、成熟和存活有着极为重要的影响。它具有多种生物活性，能促进神经元存活及突起生长，是神经元胶质细胞、毛细血管内皮细胞的促有丝分裂原，并且能抵抗兴奋性氨基酸等多种有害物质对神经原的毒性作用而保护神经元。正常情况下，脑内只有轻微的bFGF免疫反应，而脑损伤后的局部bFGF免疫反应明显增强 [5] 。如前脑缺血20min后，在海马CA1亚区和尾状核、颞叶皮层、胼胝体及海马CA4亚区均可见bFGF免疫反应增强，同时在这些脑区的神经元明显变性，提示bFGF与缺血脑组织的修复可能有关。Kumon [6] 等利用一侧 大脑中动脉(MCA)闭塞模型，观察1～21天神经元及星形胶质细胞内的bFGF免疫反应，结果发现:缺血后1～14天，缺血侧皮层锥体细胞中有较强的bFGF免疫反应，至缺血21天上述反应逐渐下降至正常水平，而该区域的星形胶质细胞内bFGF免疫反应仍较强。总之，目前大量的研究表明脑缺血后短期内源性bFGF表达有一个高峰。本研究发现，大鼠脑缺血后35天，大鼠有明显的学习记忆功能障碍，海马结构bFGF表达与假手术组对照显著增高，2个月后bFGF表达降低，接近正常水平。因此推测内源性bFGF表达增高是一个对损伤早期的保护性反应，长期慢性的缺血后此反应下降。
, http://www.100md.com
有研究认为 [7] ，脑梗塞后早期给予外源性bFGF，可缩小梗死灶大小，但晚期给予则对梗死灶大小无影响，却可促进神经功能恢复，这种增强神经功能恢复的机制可能包括防止迟发的远隔神经元的逆行性死亡或促进新的神经元发芽和突触形成。
综上所述，拟“血管性痴呆”的大鼠模型早期海马bFGF表达明显增高，2个月后降低，接近正常水平，此时如果给予外源性bFGF仍有可能促进神经功能恢复，其机制尚待进一步的研究。
参考文献
1 Ohta H，Matsumoto K，Watanabe H.Progressive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occluˉsion of bilateral carotid arteries in rats.Brain Res，1994，653:231-234.
, 百拇医药
2 赵小贞，王玮，康仲涵，等.血管性痴呆大鼠学习记忆障碍与海马突触界面结构参数改变的相关性研究.现代康复，2001，6(5):54-55.
3 范文辉，刘之荣，李露斯.血管性痴呆的动物模型及其胆碱能机制研究.第三军医大学学报，2000，22(4):314-317.
4 李立新，叶诸榕，朱建辉，等.碱性成纤维细胞生长因子的自分泌与反应性星形细胞胶质化.中华病理学杂志，1997，26(1):8-11.
5 Lin TN，Jeannie Lee，Melody Lee，et al.Induction of basic fibroblast growth factor expression following focal cerebral ischemia.Brain Res Mol Res，1997，49:255-265.
, http://www.100md.com 6 Kumon Y，Sakaki S，Kadata O，et al.Transient increase in endogenous basic fibroblast growth factor in neurons of ischemic rat brains.Brain Res，1993，605(1):169-174.
7 张国瑾，赵增荣.国外脑血管病研究进展.北京:中国医药科技出版社，2000，42.
基金项目:福建医科大学校苗圃基金(编号:008054)
作者单位:350004福州福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系
(收稿日期:2003-09-23)
(编辑 刘娜), http://www.100md.com(黄焱)
关键词 痴呆 血管性 海马 碱性成纤维细胞生长因子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0769-02
Expression of basic fibroblast growth factor in hippocampus
tissue of vascular dementia rats
, http://www.100md.com
Huang Yan，Wang Wei，Zhang Geng，et al.
Division of Anatomy，Histology and Embryology，Fujian Medical University，Fuzhou 350004.
【Abstract】 Objective To investigate the role of basic fibroblast growth factor(bFGF)in the mechanism of vascular dementia.Methods Aged rats were treated with a permanent bilateral occlusion of both common carotid arˉteries(2-VO)for establishing vascular dementia model.Basic fibroblast growth factor expression was investigated by immunohistochemical staining and images analysis.Results Immunohistochemical staining showed that few bFGF proˉtein were expressed in the cells of hippocampus.The expression is significant difference between the vascular dementia group and the control group.Conclusion The rats with vascular dementia may be in learnig and memory disorder，one month later，the basic fibroblast growth factor expression in hippocampus has increased.But two months later，the exˉpression in hippocampus has decreased to be closed to the normal level.
, 百拇医药
Key words dementia vascular hippocampus basic fibroblast growth factor
血管性痴呆(vascular dementia，VD)是最常见的老年期痴呆之一，主要是由于脑血管因素引起的脑组织血液循环障碍，脑部机能减退而致的一种认知功能缺损的综合征。在中枢神经系统内，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在保护神经元免受各种因素所致的神经元变性和死亡中发挥着重要作用。本实验通过免疫组化染色观察血管性痴呆大鼠脑bFGF的表达，探讨bFGF在血管性痴呆的发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选用本校实验动物中心提供的老龄健康雄性SD大鼠，体重300～400g。以Morris水迷宫实验筛选学习记忆良好的大鼠40只，随机分为假手术组和手术组(n=20)。
, 百拇医药
1.2 模型制作方法 参照Ohta等 [1] 制作慢性脑灌注不足动物模型。大鼠术前12h禁食，4h禁水。用2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈前正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，缝合切口，手术后动物送至有通风和空调设备的动物房饲养。对照组动物仅行颈前正中切开，不结扎颈总动脉，缝合。
1.3 行为检测 术后30天用Morris水迷宫进行定向航行 实验 [2] ，观察大鼠逃避潜伏期。
1.4 免疫组化染色 行为检测完，再随机将手术组和对照组分为两组，其中一组术后35天，用2%戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔麻醉动物，掀开颅盖，向颅腔内注入预冷的中性福尔马林，取含海马结构的脑组织，固定于中性福尔马林，置4℃冰箱过夜，脱水、透明、常规石蜡包埋，冠状连续切片(4μm)，海马组织每10张取1张进行免疫化学染色。另一组再饲养1个月，再行上述实验。bFGF试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，抗体稀释度为1:30，染色步骤按试剂盒说明书进行，经DAB显色，阳性细胞呈棕色颗粒，用PBS代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
1.5 图像分析 用Motic Images Advanced3.0系统对大鼠海马区灰度进行分析。所有测量在相同光学条件下进行。
1.6 统计学处理 实验数据用均数±标准差表示，各组均数之间的比较采用配对t检验。
2 结果
2.1 行为学检查结果 双侧颈总动脉完全阻断后出现短暂惊厥，体温降低，呼吸减慢，翻正反射消失;术后早期观察动物运动减少，后肢呈“八”字，走路共济失调，或爬行和转圈;手术组术后死亡2只，假手术组无死亡。术后2周已基本恢复，无明显的运动障碍。
2.2 术后1个月和2个月各组大鼠平均逃避潜伏期比较 见表1。
表1 各组大鼠平均逃避潜伏期比较(略)
2.3 免疫组织化学及图像分析结果 见表2。术后1个月与假手术组比较，手术组大鼠海马结构bFGF免疫反应阳性细胞较多，经图像分析结果表明，与假手术组比较灰度值差异有显著性。术后2个月两组灰度值差异无显著性。
, http://www.100md.com
表2 大鼠海马免疫反应产物灰度值比较(略)
3 讨论
建立可复制的可靠动物模型是研究血管性痴呆发生发展机制及防治措施、疗效评价的关键。范文辉 [3] 等证实持久性双侧颈总动脉结扎可造成稳定的不完全性前脑缺血模型，该法造成前脑供血大幅度下降，更接近慢性脑灌注不足时脑组织病理生理演变过程。本研究采用持久性双侧颈总动脉结扎，30天后，用Morris水迷宫试验，发现大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长，出现了明显的学习记忆功能障碍，空间定位、识别能力有所损伤。拟“血管性痴呆”的动物模型的制作是成功的。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是中枢神经系统内介导生长和修复因子之一，脑内bFGF的含量高低依次为海马、大脑皮层、嗅球、基底前脑、小脑及纹状体 [4] 。虽然其含量甚微，但对中枢神经系统神经细胞的发育、成熟和存活有着极为重要的影响。它具有多种生物活性，能促进神经元存活及突起生长，是神经元胶质细胞、毛细血管内皮细胞的促有丝分裂原，并且能抵抗兴奋性氨基酸等多种有害物质对神经原的毒性作用而保护神经元。正常情况下，脑内只有轻微的bFGF免疫反应，而脑损伤后的局部bFGF免疫反应明显增强 [5] 。如前脑缺血20min后，在海马CA1亚区和尾状核、颞叶皮层、胼胝体及海马CA4亚区均可见bFGF免疫反应增强，同时在这些脑区的神经元明显变性，提示bFGF与缺血脑组织的修复可能有关。Kumon [6] 等利用一侧 大脑中动脉(MCA)闭塞模型，观察1～21天神经元及星形胶质细胞内的bFGF免疫反应，结果发现:缺血后1～14天，缺血侧皮层锥体细胞中有较强的bFGF免疫反应，至缺血21天上述反应逐渐下降至正常水平，而该区域的星形胶质细胞内bFGF免疫反应仍较强。总之，目前大量的研究表明脑缺血后短期内源性bFGF表达有一个高峰。本研究发现，大鼠脑缺血后35天，大鼠有明显的学习记忆功能障碍，海马结构bFGF表达与假手术组对照显著增高，2个月后bFGF表达降低，接近正常水平。因此推测内源性bFGF表达增高是一个对损伤早期的保护性反应，长期慢性的缺血后此反应下降。
, http://www.100md.com
有研究认为 [7] ，脑梗塞后早期给予外源性bFGF，可缩小梗死灶大小，但晚期给予则对梗死灶大小无影响，却可促进神经功能恢复，这种增强神经功能恢复的机制可能包括防止迟发的远隔神经元的逆行性死亡或促进新的神经元发芽和突触形成。
综上所述，拟“血管性痴呆”的大鼠模型早期海马bFGF表达明显增高，2个月后降低，接近正常水平，此时如果给予外源性bFGF仍有可能促进神经功能恢复，其机制尚待进一步的研究。
参考文献
1 Ohta H，Matsumoto K，Watanabe H.Progressive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occluˉsion of bilateral carotid arteries in rats.Brain Res，1994，653:231-234.
, 百拇医药
2 赵小贞，王玮，康仲涵，等.血管性痴呆大鼠学习记忆障碍与海马突触界面结构参数改变的相关性研究.现代康复，2001，6(5):54-55.
3 范文辉，刘之荣，李露斯.血管性痴呆的动物模型及其胆碱能机制研究.第三军医大学学报，2000，22(4):314-317.
4 李立新，叶诸榕，朱建辉，等.碱性成纤维细胞生长因子的自分泌与反应性星形细胞胶质化.中华病理学杂志，1997，26(1):8-11.
5 Lin TN，Jeannie Lee，Melody Lee，et al.Induction of basic fibroblast growth factor expression following focal cerebral ischemia.Brain Res Mol Res，1997，49:255-265.
, http://www.100md.com 6 Kumon Y，Sakaki S，Kadata O，et al.Transient increase in endogenous basic fibroblast growth factor in neurons of ischemic rat brains.Brain Res，1993，605(1):169-174.
7 张国瑾，赵增荣.国外脑血管病研究进展.北京:中国医药科技出版社，2000，42.
基金项目:福建医科大学校苗圃基金(编号:008054)
作者单位:350004福州福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系
(收稿日期:2003-09-23)
(编辑 刘娜), http://www.100md.com(黄焱)