一种特异性检测细胞凋亡和细胞周期的新方法
【摘要】 目的 应用流式细胞技术，建立一种特异性的同时检测细胞凋亡和细胞G 0/G 1 期、S期以及G 2 /M期各时相百分比的快速测定方法。方法 采用Annexin V-FITC/PI双标记染色凋亡细胞，再在该染色样品基础上，进一步地打孔，同时加入高剂量的DNA染色试剂进行活细胞DNA饱和染色，流式细胞仪检测分析。结果 可在同一份细胞样品上获得特异性较强的细胞凋亡、细胞坏死和细胞周期各时相的百分数变化。结论 该方法测量结果准确，检测时间短，人为影响因素少，节约细胞样品用量，为细胞生物学、肿瘤学研究，尤其是细胞动力学研究提供了一种新的、更为实用的分析方法。
关键词 流式细胞术 细胞凋亡 细胞周期 特异方法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1065-02
A new method specified for detecting apoptosis and cell cycles
, 百拇医药
Cao Yunxin，Jin Weilin，Jin Boquan，et al.
Department of Immunology，the Fourth Military Medical University，Xi′an710032.
【Abstract】 Objective To set up a flow cytometry specified for quick detection of apoptosis and percentages of G 0 /G 1 phase，S phase and G 2 /M phase.Methods Annexin V-FITC/PI was used to double-label apoptotic cells.Following that，DNA staining reagent was added to the samples in the wells for DNA saturated staining of the cells.Flow cytometry was applied to detect the changes in the samples.Results Highly specific changes in apoptosis，cytonecrosis and percentages of various cell cycles were detected on one single sample.Conclusion The method is
, 百拇医药
accurate，quick，devoid of artificial interference，and can save many cell samples as well.Thus，this is recommended as a new and more practical analytical method for cytobiology，oncology，and for cyto-kinetics in particular.
Key words flow cytometry apoptosis cell cycles specified method
细胞凋亡和细胞周期检测是近年来广泛受到重视并应用于肿瘤学研究的一项重要指标，许多肿瘤的发生、发展、转归与细胞的促凋亡活性和细胞周期的改变密切相关 [1，2] ，因此，寻找和探索一种特异性的同时检测细胞凋亡和细胞周期的新方法，对于基因转染调控肿瘤的研究，以及各种抗肿瘤药物对肿瘤的作用机理研究，均有十分重要的意义。目前用于检测细胞凋亡和细胞周期分析的方法很多，但同时检测细胞凋亡和周期的方法还停留在Gong等 [3] 1994年建立的DNA含量亚G1 期峰法上，该方法由于是通过检测DNA含量的多少来确定细胞的凋亡率，往往与死细胞峰不能分开，因此检测的特异性差，定量误差较大。我们尝试在Annexin V/PI法基础上进一步对DNA进行饱和染色，建立了比较理想的同时快速特异性地检测细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术新方法。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 Elite ESP型流式细胞仪:Annexin V/PI Reagent Kit，DNA-Prep Reagent Kit，均为美国Beckman Coulter公司产品。转染试剂Fugene6，为德国罗氏公司产品。稀释液配制:Fugene6按1∶20稀释到opti-MEM无血清培养液中。
1.2 质粒 选用某一基因家族三个成员(A、B、C分子)。该基因家族成员在预实验中观察到可以显著影响COS细 胞的生长，瞬时转染A、B或C分子都可以比对照组明显减少细胞的数目。
1.3 细胞培养和处理 COS7细胞用含10%的胎牛血清的DMEM培养，Fugene6转染COS7参照Roche公司提供的操作程序进行。转染前一天，1.2×10 5 的细胞接种于六孔培养板，转染当天至40%～50%汇合率时进行转染。将A、B、C三种基因及对照质粒各2μg分别加于100μl稀释液中，轻轻振荡、混匀，制成转染液。室温静置15min后，将转染液滴加到细胞中，置37℃孵育36h，弃转染液，胰酶消化，制成单细胞悬液，用无血清RPMI1640调整细胞浓度为1×10 9个细胞/L。
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1.4 荧光染色 将对照组和各基因转染组的细胞采用Annexin V-FITC/PI双标记染色，利用流式细胞仪进行双参数分析，测定坏死、凋亡和正常细胞的百分率，具体步骤是每份取100μl单细胞悬液，每组做3个复管，然后各加入490μl工作浓度的结合缓冲液、5μl Annexin V-FITC和5μl PI染料轻轻振荡、混匀，置4℃冷藏室中染色10min，待用。细胞周期—DNA染色具体步骤:将以上的双标染色样品加入25μl DNA-Prep LPR打孔10min，离心1000rpm×5min弃上清，加入500μl的DNA-Prep stain，室温下避光染色15min，待用。
1.5 流式细胞术分析 将Annexin V-FITC/PI和DNA-Prep stain荧光标记染色成功的细胞样品，用流式细胞仪检测，经488nm的激发光激发，被激发的细胞发射525nm绿色(FITC)荧光和610nm红色(PI)荧光，分别用不同的荧光通道接收，然后用LMD软件和Motilcycle软件对所测数据进行分析，可获得任意一群细胞的细胞凋亡率，继发性坏死率和细胞周期各时相的百分比。
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1.6 统计学方法 各组细胞凋亡率、细胞周期各时相的百分率、均取3个样本的均值，以ˉx±s表示，两个均数的比较采用SPSS11.0软件进行t检验。
2 结果
2.1 Annexin V-FITC/PI双参数分析 以对照组(未处理组)COS7对数生长期的细胞对流式细胞仪的检测条件进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测，图1结果显示:用同一家族成员中的A、B、C三种基因分别转染细胞后，细胞凋亡率为(18.6±0.8)%、(15.1±0.7)%和(17.4±1.1)%，对照组细胞凋亡率为(3.4±0.3)%。转染了三种基因的细胞凋亡率均高于对照组，差异有非常显著性(P<0.01)。说明以上三种基因对COS7细胞有促凋亡作用。
2.2 细胞周期分析 选用流式细胞仪FL3荧光单参数线性放大通道接收信号，对上述制备样品进行细胞周期检测和分析，图2分别为对照质粒(Control)和A、B、C三种基因分别转染细胞后，经流式细胞术检测分析所获的细胞周期各时相的分布图。经A、B、C三种基因分别转染细胞后，与对照组比较G 0 /G 1 期的细胞比例恒定不变，S期的细胞数均明显降低，在G 2 /M期被阻滞(图3)，提示以上三种基因可抑制细胞生长，并调控细胞周期的改变。同时我们将该结果与经典的细胞周期样品制备和检测方法 [4] 所获的结果进行了比较，结果基本相同。(图1～图3略)
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3 讨论
近年来有关凋亡信号转导、基因调控和细胞周期动力学方面的研究已取得重大进展，单一检测凋亡或细胞周期的技术已比较成熟，但将两者有机结合起来进行同时特异性地检测凋亡和周期分析的技术却进展不大，最早出现直至现在仍较为常用的凋亡与细胞周期检测技术是PI染色法 [3] ，细胞凋亡时DNA断裂成小片段，当细胞用乙醇或TriˉonX-100处理后，这些小片段从细胞内释放出来，使其DNA含量低于正常细胞，用DNA特异性结合染料PI染色后并进行检测，可在G 1 峰前出现一亚二倍体峰即凋亡峰，根据亚二倍体峰的高低可分析凋亡细胞数，但在实际的样品检测中，在细胞凋亡的同时可能还伴有细胞死亡的出现，而绝大多数细胞样品凋亡细胞与死亡细胞其DNA含量的 改变是一个渐变的过程，两者不能截然分开，因此，使凋亡定量的准确性受到极大影响。
Annexin V/PI法是目前检测细胞凋亡和区分坏死细胞特异性较强的方法 [5] ，其原理是正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸定位于细胞膜的内侧。在细胞凋亡的早期，由于细胞膜失去对称性，磷脂酰丝氨酸从胞膜内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力，可特异性的与磷脂酰丝氨酸结合。凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，碘化丙啶(PI)不能进入细胞内，而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞可同时被Annexin V-FITC和PI染色。利用流式细胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞(Annexin V + )与继发坏死的细胞(Annexin V + PI + )区分开来，并能计算出阳性细胞的百分率 [3] 。由于该方法染色时间短(仅10min即可完成)，检测速度快(半分钟即可完成一份样品的测量)，对细胞活性影响不大，用该样品进一步地打孔，再加入饱和剂量的DNA染料对细胞内的DNA进行染色，然后进行DNA含量检测和细胞周期分析，可在很短的时间(35min)内获得理想的细胞凋亡、细胞坏死和细胞周期各时相的百分数变化结果，该方法的建立，弥补了细胞凋亡和细胞周期同时检测信息获取不全的遗憾，同时简化了操作步骤，减少了人为的影响误差，节约了培养细胞的用量，为细胞生物学、肿瘤学、放射治疗和药物的细胞动力学研究提供了技术支持。
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参考文献
1 韦伟，龚建平，裘法祖.大鼠肝癌发生期间细胞增殖与凋亡关系初探.癌症杂志，1999，18(5):492-494.
2 Clurman BE，Roberts J M.Cell cycle and cancer.J Nat1Cancer Insti，1995，87:1499-1501.
3 Gong JP，Traganos F，Darzynkiewicz Z.A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cell applicable for gel electrophoresis and flow cytometry.Anal Biochem，1994，218:314-316.
4 VanDilla MA，Trujillo TT，Mullaney PF，et al.Cell microfluorometry:a method for rapid fluorescence.Science，1969，163:1213-1214.
5 郑骏年，谢叔良，陈家存，等.流式细胞术检测细胞凋亡三种方法的比较.中国免疫学杂志，1999，15(10):470-472.
作者单位:1 710032西安第四军医大学免疫教研室
2 710032西安第四军医大学神经生物研究所
3 710032西安第四军医大学口腔医院修复科
(收稿日期:2003-08-27)
(编辑 李阳), http://www.100md.com(曹云新)
关键词 流式细胞术 细胞凋亡 细胞周期 特异方法
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1065-02
A new method specified for detecting apoptosis and cell cycles
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Cao Yunxin，Jin Weilin，Jin Boquan，et al.
Department of Immunology，the Fourth Military Medical University，Xi′an710032.
【Abstract】 Objective To set up a flow cytometry specified for quick detection of apoptosis and percentages of G 0 /G 1 phase，S phase and G 2 /M phase.Methods Annexin V-FITC/PI was used to double-label apoptotic cells.Following that，DNA staining reagent was added to the samples in the wells for DNA saturated staining of the cells.Flow cytometry was applied to detect the changes in the samples.Results Highly specific changes in apoptosis，cytonecrosis and percentages of various cell cycles were detected on one single sample.Conclusion The method is
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accurate，quick，devoid of artificial interference，and can save many cell samples as well.Thus，this is recommended as a new and more practical analytical method for cytobiology，oncology，and for cyto-kinetics in particular.
Key words flow cytometry apoptosis cell cycles specified method
细胞凋亡和细胞周期检测是近年来广泛受到重视并应用于肿瘤学研究的一项重要指标，许多肿瘤的发生、发展、转归与细胞的促凋亡活性和细胞周期的改变密切相关 [1，2] ，因此，寻找和探索一种特异性的同时检测细胞凋亡和细胞周期的新方法，对于基因转染调控肿瘤的研究，以及各种抗肿瘤药物对肿瘤的作用机理研究，均有十分重要的意义。目前用于检测细胞凋亡和细胞周期分析的方法很多，但同时检测细胞凋亡和周期的方法还停留在Gong等 [3] 1994年建立的DNA含量亚G1 期峰法上，该方法由于是通过检测DNA含量的多少来确定细胞的凋亡率，往往与死细胞峰不能分开，因此检测的特异性差，定量误差较大。我们尝试在Annexin V/PI法基础上进一步对DNA进行饱和染色，建立了比较理想的同时快速特异性地检测细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术新方法。
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1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 Elite ESP型流式细胞仪:Annexin V/PI Reagent Kit，DNA-Prep Reagent Kit，均为美国Beckman Coulter公司产品。转染试剂Fugene6，为德国罗氏公司产品。稀释液配制:Fugene6按1∶20稀释到opti-MEM无血清培养液中。
1.2 质粒 选用某一基因家族三个成员(A、B、C分子)。该基因家族成员在预实验中观察到可以显著影响COS细 胞的生长，瞬时转染A、B或C分子都可以比对照组明显减少细胞的数目。
1.3 细胞培养和处理 COS7细胞用含10%的胎牛血清的DMEM培养，Fugene6转染COS7参照Roche公司提供的操作程序进行。转染前一天，1.2×10 5 的细胞接种于六孔培养板，转染当天至40%～50%汇合率时进行转染。将A、B、C三种基因及对照质粒各2μg分别加于100μl稀释液中，轻轻振荡、混匀，制成转染液。室温静置15min后，将转染液滴加到细胞中，置37℃孵育36h，弃转染液，胰酶消化，制成单细胞悬液，用无血清RPMI1640调整细胞浓度为1×10 9个细胞/L。
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1.4 荧光染色 将对照组和各基因转染组的细胞采用Annexin V-FITC/PI双标记染色，利用流式细胞仪进行双参数分析，测定坏死、凋亡和正常细胞的百分率，具体步骤是每份取100μl单细胞悬液，每组做3个复管，然后各加入490μl工作浓度的结合缓冲液、5μl Annexin V-FITC和5μl PI染料轻轻振荡、混匀，置4℃冷藏室中染色10min，待用。细胞周期—DNA染色具体步骤:将以上的双标染色样品加入25μl DNA-Prep LPR打孔10min，离心1000rpm×5min弃上清，加入500μl的DNA-Prep stain，室温下避光染色15min，待用。
1.5 流式细胞术分析 将Annexin V-FITC/PI和DNA-Prep stain荧光标记染色成功的细胞样品，用流式细胞仪检测，经488nm的激发光激发，被激发的细胞发射525nm绿色(FITC)荧光和610nm红色(PI)荧光，分别用不同的荧光通道接收，然后用LMD软件和Motilcycle软件对所测数据进行分析，可获得任意一群细胞的细胞凋亡率，继发性坏死率和细胞周期各时相的百分比。
, http://www.100md.com
1.6 统计学方法 各组细胞凋亡率、细胞周期各时相的百分率、均取3个样本的均值，以ˉx±s表示，两个均数的比较采用SPSS11.0软件进行t检验。
2 结果
2.1 Annexin V-FITC/PI双参数分析 以对照组(未处理组)COS7对数生长期的细胞对流式细胞仪的检测条件进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测，图1结果显示:用同一家族成员中的A、B、C三种基因分别转染细胞后，细胞凋亡率为(18.6±0.8)%、(15.1±0.7)%和(17.4±1.1)%，对照组细胞凋亡率为(3.4±0.3)%。转染了三种基因的细胞凋亡率均高于对照组，差异有非常显著性(P<0.01)。说明以上三种基因对COS7细胞有促凋亡作用。
2.2 细胞周期分析 选用流式细胞仪FL3荧光单参数线性放大通道接收信号，对上述制备样品进行细胞周期检测和分析，图2分别为对照质粒(Control)和A、B、C三种基因分别转染细胞后，经流式细胞术检测分析所获的细胞周期各时相的分布图。经A、B、C三种基因分别转染细胞后，与对照组比较G 0 /G 1 期的细胞比例恒定不变，S期的细胞数均明显降低，在G 2 /M期被阻滞(图3)，提示以上三种基因可抑制细胞生长，并调控细胞周期的改变。同时我们将该结果与经典的细胞周期样品制备和检测方法 [4] 所获的结果进行了比较，结果基本相同。(图1～图3略)
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3 讨论
近年来有关凋亡信号转导、基因调控和细胞周期动力学方面的研究已取得重大进展，单一检测凋亡或细胞周期的技术已比较成熟，但将两者有机结合起来进行同时特异性地检测凋亡和周期分析的技术却进展不大，最早出现直至现在仍较为常用的凋亡与细胞周期检测技术是PI染色法 [3] ，细胞凋亡时DNA断裂成小片段，当细胞用乙醇或TriˉonX-100处理后，这些小片段从细胞内释放出来，使其DNA含量低于正常细胞，用DNA特异性结合染料PI染色后并进行检测，可在G 1 峰前出现一亚二倍体峰即凋亡峰，根据亚二倍体峰的高低可分析凋亡细胞数，但在实际的样品检测中，在细胞凋亡的同时可能还伴有细胞死亡的出现，而绝大多数细胞样品凋亡细胞与死亡细胞其DNA含量的 改变是一个渐变的过程，两者不能截然分开，因此，使凋亡定量的准确性受到极大影响。
Annexin V/PI法是目前检测细胞凋亡和区分坏死细胞特异性较强的方法 [5] ，其原理是正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸定位于细胞膜的内侧。在细胞凋亡的早期，由于细胞膜失去对称性，磷脂酰丝氨酸从胞膜内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力，可特异性的与磷脂酰丝氨酸结合。凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，碘化丙啶(PI)不能进入细胞内，而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞可同时被Annexin V-FITC和PI染色。利用流式细胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞(Annexin V + )与继发坏死的细胞(Annexin V + PI + )区分开来，并能计算出阳性细胞的百分率 [3] 。由于该方法染色时间短(仅10min即可完成)，检测速度快(半分钟即可完成一份样品的测量)，对细胞活性影响不大，用该样品进一步地打孔，再加入饱和剂量的DNA染料对细胞内的DNA进行染色，然后进行DNA含量检测和细胞周期分析，可在很短的时间(35min)内获得理想的细胞凋亡、细胞坏死和细胞周期各时相的百分数变化结果，该方法的建立，弥补了细胞凋亡和细胞周期同时检测信息获取不全的遗憾，同时简化了操作步骤，减少了人为的影响误差，节约了培养细胞的用量，为细胞生物学、肿瘤学、放射治疗和药物的细胞动力学研究提供了技术支持。
, 百拇医药
参考文献
1 韦伟，龚建平，裘法祖.大鼠肝癌发生期间细胞增殖与凋亡关系初探.癌症杂志，1999，18(5):492-494.
2 Clurman BE，Roberts J M.Cell cycle and cancer.J Nat1Cancer Insti，1995，87:1499-1501.
3 Gong JP，Traganos F，Darzynkiewicz Z.A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cell applicable for gel electrophoresis and flow cytometry.Anal Biochem，1994，218:314-316.
4 VanDilla MA，Trujillo TT，Mullaney PF，et al.Cell microfluorometry:a method for rapid fluorescence.Science，1969，163:1213-1214.
5 郑骏年，谢叔良，陈家存，等.流式细胞术检测细胞凋亡三种方法的比较.中国免疫学杂志，1999，15(10):470-472.
作者单位:1 710032西安第四军医大学免疫教研室
2 710032西安第四军医大学神经生物研究所
3 710032西安第四军医大学口腔医院修复科
(收稿日期:2003-08-27)
(编辑 李阳), http://www.100md.com(曹云新)