大鼠克隆病模型制备及针药结合治疗作用的形态学研究
【摘要】 目的 制备大鼠克隆病模型并观察针药结合治疗对其形态学的影响。方法 采用Morris方法，应用三硝基苯磺酸制备克隆病大鼠模型，运用光镜和电镜观察针药结合对模型大鼠结肠粘膜组织学和超微结构的影响。结果 模型组大鼠有克隆病肠道典型病理改变;针药结合治疗组对克隆病大鼠结肠粘膜组织学和超微病理结构的改善作用优于单纯电针组与单纯SASP灌胃组(P<0.01)。结论 三硝基苯磺酸克隆病大鼠模型是较为理想的研究克隆病的实验动物模型;针药结合能抑制或减轻克隆病大鼠肠道炎症，纠正结肠粘膜病变。
关键词 克隆病 动物模型 针药结合 形态学研究
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)11-0961-04
The rat model of Crohn’s disease and acupuncture integrated
, http://www.100md.com
with drug treatment on its morphology
Liu Huirong，Qin Xiudi，Shi Yin，et al.
Shanghai Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai200030.
【Abstract】 Objective To make a rat model of Crohn’s disease and observe the effect of acupuncture inteˉgrated with drug treatment on its morphology.Methods The rat model of Crohn’s disease was made with trinitrobenˉzene sulfonic acid，which is an international generally accepted method.Then the histological and ultrastructural structure of colonic mucous membrane in model rats were observed with light microscope and electron microscope.Reˉsults There were typical pathological change of Crohn’s disease in the intestines of model rats.The therapeutic efˉfect of acupuncture integrated with drug treatment group on the histological and ultrastructural structure of colonic muˉcous membrane for Crohn’s disease rats was better than that of simple acupuncture group or drug perfusion group(P<0.01).Conclusion The rat model of Crohn’s disease which was made with trinitrobenzene sulfonic acid is a proper animal model for experimental research.Acupuncture integrated with drug treatment may inhibit or relieve the intestiˉnal inflammation of model rats and redress the pathological change in its colonicmucous membrane.
, 百拇医药
Key words Crohn’s disease animal model acupuncture integrated with drug treatment morphology
克隆病(Crohn Disease，CD)是一种病因未明的胃肠道慢性炎症性肉芽肿性疾病，它与溃疡性结肠炎同属炎症性肠病 [1] 。其临床主要表现为腹痛、慢性腹泻、便血、发热、乏力、消瘦等。根据其主要症状，本病可归属于中医学的“久痢”、“久泄”等范畴。本病病情缠绵，久治不愈，属难治性疾病之一，迄今现代医学尚未找到良好的防治对策。近年来，我们运用针灸疗法治疗轻型克隆病(结肠型)，取得一定的疗效，本研究通过制备大鼠克隆病模型，并观察针药结合对大鼠克隆病形态学的影响，以期为临床上应用针药结合治疗克隆病提供实验依据。
1 实验方法
1.1 模型制备 参照Morris方法，应用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)制备大鼠克隆病模型 [1，2] 。
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1.1.1 实验材料 主要试剂:三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司生产;无水乙醇(分析纯)，华东试剂公司生产。实验动物由上海中医药大学实验动物中心提供，雄性SD大鼠50只，体重200g左右。
1.1.2 造模方法 各组大鼠，前一日禁食，不禁水。大鼠称重后，盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉，0.4ml/只。TNBS灌肠溶液制备:将无水乙醇加双蒸水，配成50%乙醇，然后将TNBS与50%乙醇以TNBS0.5ml、50%乙醇0.25ml(2∶1)比例混合成TNBS灌肠液。灌肠:模型组大鼠以TNBS溶液0.5ml灌肠;正常对照组大鼠用生理盐水0.5ml灌肠。用12cm长的输液器导管插入直肠约8cm，2ml注射器注入。动物体位为头朝下，且拔出导管后再倒立1min左右，以防药液溢出。每隔10天重复灌肠1次，共4次。造模结束时，随机抽样8只模型组大鼠与2只正常组大鼠，处死，剖取结肠标本，并以10%福尔马林固定作形态学观察。
1.2 实验分组及治疗方法 在肯定实验性克隆病模型已成功建立的基础上，将模型组大鼠随机分成针药结合组、电针组、西药组、模型对照组，每组8只;正常对照组为正常SD大鼠。
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1.2.1 针药结合组(简称针药组N=8) (1)取穴:足三里(双)、上巨虚(双)。穴位定位参照文献 [2] 毫针针刺，深度0.3～0.5cm，接G6805-II型电针仪，频率3～5Hz，电流强度3档，以大鼠下肢轻微抖动为度。每次持续时间20min，每日1次，共针10次。(2)西药柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃:每日投药量按成人(70kg体重)与大鼠(200g体重)1∶0.018比例(据《药理学实验方法》)配制SASP溶液，每日2次，每次3ml，连续使用10天。
1.2.2 电针组(N=8) 取穴:足三里(双)、上巨虚(双)。穴位定位参照《实验针灸学》，毫针针刺，深度0.3～0.5cm，接G6805-II型电针仪，频率3～5Hz，电流强度3档，以大鼠下肢轻微抖动为度。每次持续时间20min，每日1次，共针10次。
1.2.3 西药组(N=8) 西药柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃。每日投药量按成人(70kg体重)与大鼠(200g体重)1∶0.018比例(据《药理学实验方法》)配制SASP溶液，每日2次，每次3ml，连续使用10天。
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1.2.4 模型对照组(简称模型组N=8) 按同样剂量用生理盐水灌胃，做与治疗组相同的捆绑固定，不作针灸治疗。
1.2.5 正常对照组(简称正常组N=8) 按同样剂量用生理盐水灌胃，做与治疗组相同的捆绑固定，不作针灸治疗。
1.3 观察指标
1.3.1 结肠粘膜组织病理学变化 将剖取的结肠用10% 福尔马林液固定，标本取自病变最明显部位，与肠径垂直，常规石蜡包埋、切片、HE染色，对肠道病变(充血、水肿、淋巴滤泡形成、炎细胞浸润)程度进行光镜下评价与比较。
1.3.2 超微结构观察 快速处死动物，迅速取下病变部位 周围的结肠粘膜，切成1mm 3的小块，在4℃下，用2%戊二醛-1%多聚甲醛固定，1%锇酸后固定，乙醇、丙酮逐级脱水，EPON812树脂包埋，超薄切片，铅、铀双重染，H-600透射电镜观察。
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1.4 统计学方法 治疗后组间组织病理学观察比较采用Ridit分析。
2 结果
2.1 大鼠克隆病模型制备结果 光镜下观察:模型大鼠肠道炎症明显，炎细胞浸润，粘膜上皮受损，粘膜下明显充血，有溃疡形成，纤维细胞增生，伴有陈旧性出血，血管壁不规则增厚。肠壁增厚，肌层破坏，并有成团巨细胞反应与类上皮反应，肉芽肿形成，出现克隆病肠道典型病理改变。提示:大鼠肠道克隆病发生，模型制备成功。(见图1～5略)
2.2 形态学观察结果 光镜观察结果(见表1、表2)。正常组:粘膜完好。模型组:粘膜表面有溃疡形成，偶见溃疡表面有单层柱状上皮延伸，粘膜下充血、水肿、炎细胞浸润、粘膜下淋巴滤泡增生较明显。针药组:可见愈合性溃疡，轻度充血水肿、少量炎细胞浸润，粘膜下淋巴滤泡增生情况明显轻于模型组。电针组:见愈合性溃疡形成，充血水肿、炎细胞浸润与淋巴滤泡增生，部分动物较明显。西药组:亦见愈合性溃疡形成，粘膜下充血、水肿、粘膜下淋巴滤泡增生较针药组明显，与电针组类似。
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表1 大鼠克隆病组织病理学变化比较略
表2 大鼠克隆病组织病理学变化比较略
从表1、表2可知:模型组大鼠结肠粘膜充血水肿、炎细胞浸润、淋巴滤泡增生情况均与正常组比较差异有非常显著性(P均<0.01)，针药组显著好转(P<0.05)，电针组与西药组有一定程度改善，但差异多无显著性。
2.3 超微结构观察 正常组:结肠粘膜由单层柱状上皮组成，上皮内有大量杯状细胞，柱状上皮表面有少量短而粗的微绒毛，细胞顶部细胞质中有较致密的小颗粒。杯状细胞细胞质内有内质网、线粒体、细胞核等，杯状细胞细胞核位于基底部，核的上方有高尔基体及粘液颗粒(见图6略)。模型组:肠腺杯状细胞数量减少，部分杯状细胞有不同程度的改变，有的细胞胞浆内粘液滴稀少，甚至完全缺乏。退变上皮表面微绒毛减少、变短、扭曲;柱状细胞排列紊乱、坏死，细胞质变浅，细胞器消失，细胞核固缩，线粒体肿胀，内质网轻度扩张。部分胞浆内可见絮状和块状密度较深的退变物质。细胞间隙不规则增宽。上皮细胞间及腺体周围见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，毛细血管扩张，充满红细胞(见图7略)。针药组:结肠粘膜组织基本正常，杯状细胞增多，肠腺几乎全由杯状细胞组成，排列大致整齐，胞浆内富含粘液滴，并向腺腔排出。上皮表面的微绒毛排列整齐，大小一致。上皮细胞连接紧密，细胞间隙未见增宽(见图8略)。电针组:杯状细胞较模型组增多，部分杯状细胞富含粘液滴，排列不整齐，仍可见到坏死上皮细胞。微绒毛断裂，粘膜下层水肿(见图9略)。西药组:肠腺杯状细胞增多，细胞内粘液滴较少，细胞排列紊乱，上皮细胞微绒毛减少、断裂，细胞肿胀(见图10略)。
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3 讨论
3.1 克隆病动物模型制备原理 克隆病的确切病因及病机迄今尚未完全明确，这给临床有效治疗带来一定的困难。从20世纪60年代以来，国内外的研究者开始尝试制作克隆病动物模型，但迄今尚无一种模型能阐明其全部的发病机理。在不同条件下制作实验模型，为从不同的角度探讨克隆病的病因、发病机制、病理变化、生物学行为以及全身的病理生理变化，更有利于人类对该病深入地研究，从而为有效地预防和治疗克隆病提供了可能。
研究发现，免疫异常是导致克隆病发病过程中的一个重要环节，从免疫学角度探讨克隆病的主要发病机制，具有十分重要的意义。其中由Morris等 [3] 在1989年制造的三硝基苯磺酸克隆病动物模型，是由免疫系统介导形成的肠道克隆病，与人类克隆病的发病比较接近，具有重复性好，模型可靠等优点，是目前研究中最为常用的模型之一。
三硝基苯磺酸模型的制备原理是:三硝基苯磺酸是一种有机弱酸，属半抗原，单独在体内不能诱导免疫应答，在与组织蛋白等高分子物质结合后，即可诱发机体的免疫反应。首先通过乙醇破坏肠粘膜屏障，TNBS渗入结肠组织与大分子物质结合，形成全抗原，引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应，从而导致克隆病的发生 [1] 。在此过程中，TNBS和乙醇共同作用于肠道，才能造成炎症的发生和发展，作为半抗原的TNBS只有通过有缺陷的肠粘膜屏障致敏机体激发免疫反应，而对于有完整肠粘膜屏障的肠道则无作用。这也表明克隆病的发生可能与肠粘膜屏障受损，肠道通透 性增加，造成致病抗原激发机体产生免疫损伤有关 [4] 。
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3.2 克隆病的组织病理学特征 克隆病特异性的组织病理学改变包括肉芽肿、裂隙溃疡以及肠壁各层炎症病变等。(1)结节病样肉芽肿发生于约60%的CD患者，该肉芽肿又称非干酪样结核样肉芽肿，可发生于肠壁各层和局部淋巴结。(2)裂隙溃疡可见于约30%的患者。(3)肠壁各层炎症病变是CD的普遍的组织学改变，以粘膜下层和浆膜层更明显 [5] 。
克隆病在病理学上与其它肠道炎症性肠病(溃疡性结肠炎)的主要区别在于肉芽肿。非干酪性肉芽肿为本病的特征之一，由上皮样细胞和巨细胞组成，中心无干酪性坏死，虽只见于50%～70%的病例，但其存在具有确诊价值。非干酪性肉芽肿是巨噬细胞疏松积聚，貌似上皮样，有单个核细胞特别是淋巴细胞围绕这些结构，其中可有Langerhan多核巨细胞。本研究造模后模型组大鼠有炎细胞浸润，粘膜上皮受损，粘膜下明显充血，有溃疡形成，纤维细胞增生等，并有成团巨细胞反应与类上皮反应，肉芽肿形成等克隆病肠道典型病理改变(图1～4略)，显示模型制备成功。
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3.3 针药结合治疗对大鼠克隆病病理学改变的影响 组织病理学观察显示:模型组大鼠治疗后较治疗前虽有轻度自愈倾向，肠道炎症程度仍较重，针药结合组则对肠道充血水肿、淋巴滤泡形成及炎细胞浸润的改善状况均比较显著(P均<0.05)，接近正常，与正常组比较无明显差别(P均>0.05);电针组与西药组改善情况不如针药结合组，且此二组间无明显差异(P>0.05)，治疗后三治疗组均未见典型肌层破坏、肠道狭窄、成团巨细胞反应与类上皮反应及肉芽肿形成等克隆病病变表现，仅表现为不同程度的肠道炎症，且以针药结合组程度最轻。
有关克隆病的肠道粘膜超微结构相关研究的报道甚少，而有关杯状细胞及粘液数量改变的报道结果不尽一致 [6～9] 。人类正常结肠粘膜表面由单层柱状吸收细胞及杯状细胞构成。细胞排列整齐。粘膜内肠腺腺窝上部为成熟的吸收细胞、杯状细胞及耗竭杯状细胞;中、下部出现未成熟及未分化细胞;腺窝底部有内分泌细胞。本研究对克隆病模型大鼠的超微结构观察发现，克隆病肠道病变中最显著的特征是杯状细胞减少，杯状细胞有不同程度的改变，有的细胞胞浆内粘液滴稀少，甚至完全缺乏。退变上皮表面微绒毛减少、变短、扭曲;柱状细胞排列紊乱、坏死，细胞质变浅，细胞器消失，细胞核固缩，线粒体肿胀，内质网轻度扩张。部分胞浆内可见絮状和块状密度较深的退变物质。细胞间隙不规则增宽。上皮细胞间及腺体周围见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，毛细血管扩张，充满红细胞。其超微结构改变与以往部分有关超微结构改变的报道相类似。针药结合治疗组大鼠结肠粘膜杯状细胞数及杯状细胞粘液含量明显较模型组增多，结构改善。电针组、西药组与模型组相比有一定程度改善，但不及针药结合组。
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本研究的结果表明针刺(电针)上巨虚、足三里与西药SASP灌胃结合治疗大鼠克隆病治疗效果显著优于单纯电针或单纯SASP治疗，能抑制或减轻克隆病大鼠肠道炎症，纠正结肠粘膜异常的组织病理改变。但有关针药结合的具体起效的途径、相关的影响因素以及针刺能否减少药物的毒副作用等问题本研究尚未涉及。从以往的经验来看，临床上采用针灸疗法治疗结肠型克隆病取得了一定疗效 [10] ，而针药结合治疗作用的确切机制还有待于今后的进一步深入研究。
参考文献
1 邓长生.炎症性肠病.北京:人民卫生出版社，1998，12.
2 林文注，等.实验针灸学.上海:上海科学技术出版社，1994，88.
3 Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology，1989，96:95-811.
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4 朱峰，钱家鸣，潘国宗.细胞免疫反应炎症性肠病动物模型的建立.中国医学科学院学报，1998，20(4):271-278.
5 甄承恩，张曼利，吕晓萍.炎症性肠病的进展.临床荟萃，2001，16(2):88-90.
6 Levine J.Exogenous factors in Crohn’s disease.A critical review.J Clin Gastroenterol，1992，14(3):216-26.
7 Sommers SC，KorelitzMD.Mucosal cell counts in ulcerative and granuˉlomatous coliltis.Gastroenteral，1981，81:66.
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9 Surawicz CM，Meisel JL，YlvisakerT，et al.Rectal biopsy in the diagˉnosis
of Crohn’s disease:Value of multiple biop sies and serial sectionˉing.Gastroe
nteral，1981，81:66.
10 吴焕淦，张琳珊.隔药饼灸治疗克隆病的临床研究.现代康复，2000，4(3):397.
基金项目:上海市教委资助项目(编号:02CK19)
国家自然科学基金资助项目(编号:30271638)
作者单位:200030上海市针灸经络研究所
(收稿日期:2003-11-24)
(编辑 小川), 百拇医药(刘慧荣)
关键词 克隆病 动物模型 针药结合 形态学研究
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)11-0961-04
The rat model of Crohn’s disease and acupuncture integrated
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with drug treatment on its morphology
Liu Huirong，Qin Xiudi，Shi Yin，et al.
Shanghai Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai200030.
【Abstract】 Objective To make a rat model of Crohn’s disease and observe the effect of acupuncture inteˉgrated with drug treatment on its morphology.Methods The rat model of Crohn’s disease was made with trinitrobenˉzene sulfonic acid，which is an international generally accepted method.Then the histological and ultrastructural structure of colonic mucous membrane in model rats were observed with light microscope and electron microscope.Reˉsults There were typical pathological change of Crohn’s disease in the intestines of model rats.The therapeutic efˉfect of acupuncture integrated with drug treatment group on the histological and ultrastructural structure of colonic muˉcous membrane for Crohn’s disease rats was better than that of simple acupuncture group or drug perfusion group(P<0.01).Conclusion The rat model of Crohn’s disease which was made with trinitrobenzene sulfonic acid is a proper animal model for experimental research.Acupuncture integrated with drug treatment may inhibit or relieve the intestiˉnal inflammation of model rats and redress the pathological change in its colonicmucous membrane.
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Key words Crohn’s disease animal model acupuncture integrated with drug treatment morphology
克隆病(Crohn Disease，CD)是一种病因未明的胃肠道慢性炎症性肉芽肿性疾病，它与溃疡性结肠炎同属炎症性肠病 [1] 。其临床主要表现为腹痛、慢性腹泻、便血、发热、乏力、消瘦等。根据其主要症状，本病可归属于中医学的“久痢”、“久泄”等范畴。本病病情缠绵，久治不愈，属难治性疾病之一，迄今现代医学尚未找到良好的防治对策。近年来，我们运用针灸疗法治疗轻型克隆病(结肠型)，取得一定的疗效，本研究通过制备大鼠克隆病模型，并观察针药结合对大鼠克隆病形态学的影响，以期为临床上应用针药结合治疗克隆病提供实验依据。
1 实验方法
1.1 模型制备 参照Morris方法，应用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)制备大鼠克隆病模型 [1，2] 。
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1.1.1 实验材料 主要试剂:三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司生产;无水乙醇(分析纯)，华东试剂公司生产。实验动物由上海中医药大学实验动物中心提供，雄性SD大鼠50只，体重200g左右。
1.1.2 造模方法 各组大鼠，前一日禁食，不禁水。大鼠称重后，盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉，0.4ml/只。TNBS灌肠溶液制备:将无水乙醇加双蒸水，配成50%乙醇，然后将TNBS与50%乙醇以TNBS0.5ml、50%乙醇0.25ml(2∶1)比例混合成TNBS灌肠液。灌肠:模型组大鼠以TNBS溶液0.5ml灌肠;正常对照组大鼠用生理盐水0.5ml灌肠。用12cm长的输液器导管插入直肠约8cm，2ml注射器注入。动物体位为头朝下，且拔出导管后再倒立1min左右，以防药液溢出。每隔10天重复灌肠1次，共4次。造模结束时，随机抽样8只模型组大鼠与2只正常组大鼠，处死，剖取结肠标本，并以10%福尔马林固定作形态学观察。
1.2 实验分组及治疗方法 在肯定实验性克隆病模型已成功建立的基础上，将模型组大鼠随机分成针药结合组、电针组、西药组、模型对照组，每组8只;正常对照组为正常SD大鼠。
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1.2.1 针药结合组(简称针药组N=8) (1)取穴:足三里(双)、上巨虚(双)。穴位定位参照文献 [2] 毫针针刺，深度0.3～0.5cm，接G6805-II型电针仪，频率3～5Hz，电流强度3档，以大鼠下肢轻微抖动为度。每次持续时间20min，每日1次，共针10次。(2)西药柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃:每日投药量按成人(70kg体重)与大鼠(200g体重)1∶0.018比例(据《药理学实验方法》)配制SASP溶液，每日2次，每次3ml，连续使用10天。
1.2.2 电针组(N=8) 取穴:足三里(双)、上巨虚(双)。穴位定位参照《实验针灸学》，毫针针刺，深度0.3～0.5cm，接G6805-II型电针仪，频率3～5Hz，电流强度3档，以大鼠下肢轻微抖动为度。每次持续时间20min，每日1次，共针10次。
1.2.3 西药组(N=8) 西药柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃。每日投药量按成人(70kg体重)与大鼠(200g体重)1∶0.018比例(据《药理学实验方法》)配制SASP溶液，每日2次，每次3ml，连续使用10天。
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1.2.4 模型对照组(简称模型组N=8) 按同样剂量用生理盐水灌胃，做与治疗组相同的捆绑固定，不作针灸治疗。
1.2.5 正常对照组(简称正常组N=8) 按同样剂量用生理盐水灌胃，做与治疗组相同的捆绑固定，不作针灸治疗。
1.3 观察指标
1.3.1 结肠粘膜组织病理学变化 将剖取的结肠用10% 福尔马林液固定，标本取自病变最明显部位，与肠径垂直，常规石蜡包埋、切片、HE染色，对肠道病变(充血、水肿、淋巴滤泡形成、炎细胞浸润)程度进行光镜下评价与比较。
1.3.2 超微结构观察 快速处死动物，迅速取下病变部位 周围的结肠粘膜，切成1mm 3的小块，在4℃下，用2%戊二醛-1%多聚甲醛固定，1%锇酸后固定，乙醇、丙酮逐级脱水，EPON812树脂包埋，超薄切片，铅、铀双重染，H-600透射电镜观察。
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1.4 统计学方法 治疗后组间组织病理学观察比较采用Ridit分析。
2 结果
2.1 大鼠克隆病模型制备结果 光镜下观察:模型大鼠肠道炎症明显，炎细胞浸润，粘膜上皮受损，粘膜下明显充血，有溃疡形成，纤维细胞增生，伴有陈旧性出血，血管壁不规则增厚。肠壁增厚，肌层破坏，并有成团巨细胞反应与类上皮反应，肉芽肿形成，出现克隆病肠道典型病理改变。提示:大鼠肠道克隆病发生，模型制备成功。(见图1～5略)
2.2 形态学观察结果 光镜观察结果(见表1、表2)。正常组:粘膜完好。模型组:粘膜表面有溃疡形成，偶见溃疡表面有单层柱状上皮延伸，粘膜下充血、水肿、炎细胞浸润、粘膜下淋巴滤泡增生较明显。针药组:可见愈合性溃疡，轻度充血水肿、少量炎细胞浸润，粘膜下淋巴滤泡增生情况明显轻于模型组。电针组:见愈合性溃疡形成，充血水肿、炎细胞浸润与淋巴滤泡增生，部分动物较明显。西药组:亦见愈合性溃疡形成，粘膜下充血、水肿、粘膜下淋巴滤泡增生较针药组明显，与电针组类似。
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表1 大鼠克隆病组织病理学变化比较略
表2 大鼠克隆病组织病理学变化比较略
从表1、表2可知:模型组大鼠结肠粘膜充血水肿、炎细胞浸润、淋巴滤泡增生情况均与正常组比较差异有非常显著性(P均<0.01)，针药组显著好转(P<0.05)，电针组与西药组有一定程度改善，但差异多无显著性。
2.3 超微结构观察 正常组:结肠粘膜由单层柱状上皮组成，上皮内有大量杯状细胞，柱状上皮表面有少量短而粗的微绒毛，细胞顶部细胞质中有较致密的小颗粒。杯状细胞细胞质内有内质网、线粒体、细胞核等，杯状细胞细胞核位于基底部，核的上方有高尔基体及粘液颗粒(见图6略)。模型组:肠腺杯状细胞数量减少，部分杯状细胞有不同程度的改变，有的细胞胞浆内粘液滴稀少，甚至完全缺乏。退变上皮表面微绒毛减少、变短、扭曲;柱状细胞排列紊乱、坏死，细胞质变浅，细胞器消失，细胞核固缩，线粒体肿胀，内质网轻度扩张。部分胞浆内可见絮状和块状密度较深的退变物质。细胞间隙不规则增宽。上皮细胞间及腺体周围见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，毛细血管扩张，充满红细胞(见图7略)。针药组:结肠粘膜组织基本正常，杯状细胞增多，肠腺几乎全由杯状细胞组成，排列大致整齐，胞浆内富含粘液滴，并向腺腔排出。上皮表面的微绒毛排列整齐，大小一致。上皮细胞连接紧密，细胞间隙未见增宽(见图8略)。电针组:杯状细胞较模型组增多，部分杯状细胞富含粘液滴，排列不整齐，仍可见到坏死上皮细胞。微绒毛断裂，粘膜下层水肿(见图9略)。西药组:肠腺杯状细胞增多，细胞内粘液滴较少，细胞排列紊乱，上皮细胞微绒毛减少、断裂，细胞肿胀(见图10略)。
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3 讨论
3.1 克隆病动物模型制备原理 克隆病的确切病因及病机迄今尚未完全明确，这给临床有效治疗带来一定的困难。从20世纪60年代以来，国内外的研究者开始尝试制作克隆病动物模型，但迄今尚无一种模型能阐明其全部的发病机理。在不同条件下制作实验模型，为从不同的角度探讨克隆病的病因、发病机制、病理变化、生物学行为以及全身的病理生理变化，更有利于人类对该病深入地研究，从而为有效地预防和治疗克隆病提供了可能。
研究发现，免疫异常是导致克隆病发病过程中的一个重要环节，从免疫学角度探讨克隆病的主要发病机制，具有十分重要的意义。其中由Morris等 [3] 在1989年制造的三硝基苯磺酸克隆病动物模型，是由免疫系统介导形成的肠道克隆病，与人类克隆病的发病比较接近，具有重复性好，模型可靠等优点，是目前研究中最为常用的模型之一。
三硝基苯磺酸模型的制备原理是:三硝基苯磺酸是一种有机弱酸，属半抗原，单独在体内不能诱导免疫应答，在与组织蛋白等高分子物质结合后，即可诱发机体的免疫反应。首先通过乙醇破坏肠粘膜屏障，TNBS渗入结肠组织与大分子物质结合，形成全抗原，引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应，从而导致克隆病的发生 [1] 。在此过程中，TNBS和乙醇共同作用于肠道，才能造成炎症的发生和发展，作为半抗原的TNBS只有通过有缺陷的肠粘膜屏障致敏机体激发免疫反应，而对于有完整肠粘膜屏障的肠道则无作用。这也表明克隆病的发生可能与肠粘膜屏障受损，肠道通透 性增加，造成致病抗原激发机体产生免疫损伤有关 [4] 。
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3.2 克隆病的组织病理学特征 克隆病特异性的组织病理学改变包括肉芽肿、裂隙溃疡以及肠壁各层炎症病变等。(1)结节病样肉芽肿发生于约60%的CD患者，该肉芽肿又称非干酪样结核样肉芽肿，可发生于肠壁各层和局部淋巴结。(2)裂隙溃疡可见于约30%的患者。(3)肠壁各层炎症病变是CD的普遍的组织学改变，以粘膜下层和浆膜层更明显 [5] 。
克隆病在病理学上与其它肠道炎症性肠病(溃疡性结肠炎)的主要区别在于肉芽肿。非干酪性肉芽肿为本病的特征之一，由上皮样细胞和巨细胞组成，中心无干酪性坏死，虽只见于50%～70%的病例，但其存在具有确诊价值。非干酪性肉芽肿是巨噬细胞疏松积聚，貌似上皮样，有单个核细胞特别是淋巴细胞围绕这些结构，其中可有Langerhan多核巨细胞。本研究造模后模型组大鼠有炎细胞浸润，粘膜上皮受损，粘膜下明显充血，有溃疡形成，纤维细胞增生等，并有成团巨细胞反应与类上皮反应，肉芽肿形成等克隆病肠道典型病理改变(图1～4略)，显示模型制备成功。
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3.3 针药结合治疗对大鼠克隆病病理学改变的影响 组织病理学观察显示:模型组大鼠治疗后较治疗前虽有轻度自愈倾向，肠道炎症程度仍较重，针药结合组则对肠道充血水肿、淋巴滤泡形成及炎细胞浸润的改善状况均比较显著(P均<0.05)，接近正常，与正常组比较无明显差别(P均>0.05);电针组与西药组改善情况不如针药结合组，且此二组间无明显差异(P>0.05)，治疗后三治疗组均未见典型肌层破坏、肠道狭窄、成团巨细胞反应与类上皮反应及肉芽肿形成等克隆病病变表现，仅表现为不同程度的肠道炎症，且以针药结合组程度最轻。
有关克隆病的肠道粘膜超微结构相关研究的报道甚少，而有关杯状细胞及粘液数量改变的报道结果不尽一致 [6～9] 。人类正常结肠粘膜表面由单层柱状吸收细胞及杯状细胞构成。细胞排列整齐。粘膜内肠腺腺窝上部为成熟的吸收细胞、杯状细胞及耗竭杯状细胞;中、下部出现未成熟及未分化细胞;腺窝底部有内分泌细胞。本研究对克隆病模型大鼠的超微结构观察发现，克隆病肠道病变中最显著的特征是杯状细胞减少，杯状细胞有不同程度的改变，有的细胞胞浆内粘液滴稀少，甚至完全缺乏。退变上皮表面微绒毛减少、变短、扭曲;柱状细胞排列紊乱、坏死，细胞质变浅，细胞器消失，细胞核固缩，线粒体肿胀，内质网轻度扩张。部分胞浆内可见絮状和块状密度较深的退变物质。细胞间隙不规则增宽。上皮细胞间及腺体周围见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，毛细血管扩张，充满红细胞。其超微结构改变与以往部分有关超微结构改变的报道相类似。针药结合治疗组大鼠结肠粘膜杯状细胞数及杯状细胞粘液含量明显较模型组增多，结构改善。电针组、西药组与模型组相比有一定程度改善，但不及针药结合组。
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本研究的结果表明针刺(电针)上巨虚、足三里与西药SASP灌胃结合治疗大鼠克隆病治疗效果显著优于单纯电针或单纯SASP治疗，能抑制或减轻克隆病大鼠肠道炎症，纠正结肠粘膜异常的组织病理改变。但有关针药结合的具体起效的途径、相关的影响因素以及针刺能否减少药物的毒副作用等问题本研究尚未涉及。从以往的经验来看，临床上采用针灸疗法治疗结肠型克隆病取得了一定疗效 [10] ，而针药结合治疗作用的确切机制还有待于今后的进一步深入研究。
参考文献
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10 吴焕淦，张琳珊.隔药饼灸治疗克隆病的临床研究.现代康复，2000，4(3):397.
基金项目:上海市教委资助项目(编号:02CK19)
国家自然科学基金资助项目(编号:30271638)
作者单位:200030上海市针灸经络研究所
(收稿日期:2003-11-24)
(编辑 小川), 百拇医药(刘慧荣)