大鼠海马伞损伤后内侧隔核、斜角带核NADPH-d阳性神经元变化
【摘要】 目的 研究大鼠海马伞损伤后内侧隔核(MS)、斜角带核(DB)NADPH-d阳性神经元时程变化及意义。方法 应用NADPH-d免疫组化方法观察大鼠海马伞损伤后不同时程(1d、3d、1w、2w、3w、4w、8w、16w、24w)及假手术对照组MS、DB中NADPH-d阳性神经元形态学变化，并计数作统计学处理。结果 损伤后3d损伤侧MS、斜角带核垂直支(VDB)NADPH-d阳性神经元开始减少，约为正常侧74.5%和85%(P>0.05)，第2w急剧减少为正常侧20%(P<0.01)，以后直至24w未见进一步变化;损伤1d及假手术对照组未见变化，斜角带核水平支(HDB)始终未见变化。结论 隔海马投射损伤后损伤侧MS、VDB中NADPH-d阳性神经元第3d开始萎缩、坏死，2w达高峰，以后不以时间延长而加剧，并不影响HDB中神经元。
关键词 内侧隔核 斜角带核 免疫组化 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0970-03
, http://www.100md.com
Changes of NADPH-d positive neurons in MS and DB in various survival
period following unilateral hippocampus fimbria transection in the rat
Miao Zengli，Lin Yuchang，Xu Xing，et al.
Department of Neurosurgery，Second Hospital of Wuxi，Jiangsu214002.
【Abstract】 Objective To study the changes of NADPH-d positive neuron in MS and DB in various survival period following unilateral hippocampus fimbria transection in the rat.Methods Using NADPH-d immunohistocheˉmistry method to investigate NADPH-d positive neuron in MS and DB in various survival period(1d，3d，1w，2w，3w，4w，8w，16w，24w)following unilateral hippocampus fimbria transection.Results The loss of NADPH-d positive neuron in the lesioned side of MS and VDB presented3day postlesion，74.5%and85%NADPH-d positive neuron in the lesioned side were left(P>0.05)，and that such changes reached the critical time about2～3weeks，only20%left(P<0.01)，and remained similar until24weeks.Conclusion The changes presented3day post-lesion，reached the critical times in2～3weeks，had nothing to do with neurons in HDB.
, 百拇医药
Key words medial septum diagonal band of broca immunohistochemistry rat
隔海马投射是一条有代表性的基底前脑胆碱能神经元投射系统，它的变性或损伤被认为是老年性痴呆病(Alzheimer’s disease，AD)的重要标志，Hagg [1] 等对穹窿海马伞切断不同时期胆碱能神经元的变化曾有报道。一氧化氮(NO)作为一种特殊的活性物质，它的神经递质样作用和神经调质样作用已引起神经科学界的广泛关注。研究表明它在脑内分布十分广泛、具有多种重要的生理功能 [2～4] 。其中对NO参与突触的可塑性，在学习记忆过程中充当长时程增强效应(LTP)的逆行信使的作用研究较多 [5，6] ，最近Kitchenen等 [7] 研究表明内侧隔核(medial septum，MS)、斜角带核(diagnonal band of Broca，DB)中的绝大部分NADPH-d阳性神经元与胆碱乙酰化酶(ChAT)神经元共存。目前对海马伞损伤后MS、DB中NADPH-d阳性神经元损伤情况报道较少。本文将对大鼠海马伞损伤后内侧隔核、斜角带核NADPH-d阳性神经元时程变化及意义进行研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及AD模型制作 成年SD大鼠50只，由 南通医学院动物中心提供。雌雄不限，体重180～220mg，按损伤不同时间(1d、3d、1w、2w、3w、4w、8w、16w、24w)及假手术对照组共分10组，每组5只。
动物经腹腔用复合麻醉剂chlorpeng(0.2ml/100g)麻醉后，固定于江湾Ⅱ型脑立体定位仪(由上海江湾医用仪器厂生产)上，低于耳棒3.3mm。在消毒情况下依次切开皮肤、皮下组织，根据Paxinos鼠脑立体定位图确定坐标:(1)A=-1.4mm;L=1.0mm;V=4.4mm;(2)A=-1.4mm;L=4.0mm;V=4.4mm。在两点之间凿一骨槽，用自制的尖端锐利双面刃的切割刀(刀刃宽3mm
，刀刃厚1mm)切断海马伞，左右拉动三次，保证切断完全，假手术对照组只达皮质浅层(V=2.2mm)，余同手术组。
, 百拇医药
1.2 组织学方法 各实验组及对照组动物麻醉后打开胸腔，以100ml冷生理盐水经左心室主动脉灌注冲洗，接着用含4%多聚甲醛的0.1mol/L PB液(pH7.2)灌注固定、取脑。同液中后固定4h后入含25%蔗糖的0.1mol/L PB液4℃过夜。恒冷箱冰冻切片机作冠状切片，切片头端始于胼胝体吻部的起始水平，尾端至海马尾端，片厚40μm。切片收集在PBS中(0.01mol/L pH7.2～7.4)，经PBS洗3次，然后行NADPH-d染色。步骤如下:将切片置于反应液中45min，37℃温育。反应液组成:0.01mol/L PBS(pH7.2～7.4)含0.3%Triton X-100，0.2mg/ml硝基四氮唑蓝(NBT)和1.0mg/mlβ-NADPH(购自Boehringer Mannheim公司)。反应后将切片移入0.01mol/L PBS漂洗数次，铺片、脱水、封片。最后染色切片用日产Olympus光学显微镜观察并计数各组动物正常侧、损伤侧MS、DB中NADPH-d阳性细胞数。
1.3 统计学方法 损伤侧与正常侧NADPH-d阳性神经元计数作t检验。
, http://www.100md.com
2 结果
假手术对照组及损伤1d组的切片，正常侧与损伤侧的NOS神经元未见明显变化，NOS细胞多呈强阳性，胞体大小不等，以大细胞居多，细胞形态为双极或多极。对称地分布于中线两侧的MS、DB中(图1)。损伤3d组，MS、DB损伤侧开始出现细胞数减少，约占各对侧的74.5%和85%(图2)，胞体萎缩，染色深浅不一，突起消失或变短。第2w起MS、VDB中NOS神经元均急骤减少，约为对侧的20%左右，胞体萎缩只剩下深染的斑点或完全消失，亦有个别完好的较 大的NOS神经元，和一些远离中线散在分布的小胞体NOS神经元(图3)。2w以上直至24w组，细胞丧失程度与2w组远离大致相似，各组HDB的NOS神经元变化不明显(图4)，计数从1d组起到24w组，每组每只动物从胼胝体吻部起始水平到前连合交叉前缘的NADPH-d阳性细胞数，凡胞体失去正常形态均不计数。损伤后不同时期MS、VDB的NOS神经元数目变化见表1和图5。
图5 海马伞损伤后MS、VDB中NOS阳性神经元时程变化图 略
, http://www.100md.com
表1 大鼠海马伞损伤后MS、VDB中NOS阳性神经元时辰变化 略
3 讨论
生理学和药理学资料证明隔海马投射为胆碱能投射 [8，9] ，切断穹窿海马伞后可引起内侧隔核，斜角带核胆碱能神经元和海马胆碱能支配显著减少，动物出现类似AD的痴呆症状。Hagg等 [1] 报道损伤穹窿海马伞后1w，损伤侧ChAT阳性神经元下降为对侧的50%左右，而到2w或更长时间仅剩下约为对侧20%，Heft [10] 和Kromer [11] 等研究结果也提示海马伞损伤后基底前脑、海马的胆碱能神经元和纤维的变化可引起实验对象行为的痴呆改变，说明基底前脑胆碱能神经元丧失程度和海马胆碱能变性情况，直接影响着动物的学习、记忆能力。切断海马伞可以复制出成功的AD模型。NADPH-d组化研究发现，海马伞在损伤后3d即出现NOS神经元减少、变性，这种变化从2w起至24w基本相似，表明神经元受损后，退变在2～3周内完成，并不因 时间的推移而加重。但切断海马伞后不同时期各组动物中，神经元丧失程度各动物间有差异，究其原因发现，海马切断完全的动物，神经元减少明显，而海马伞未完全切断动物神经元减少不如完全切断明显。Kitchenen等 [7] 报道的97%左右的NOS阳性神经元为AchE阳性或ChAT阳性神经元;余福林等[12] 报道略低，约90%，因此，基底前脑NOS阳性神经元的减少可以从一个侧面，或者部分说明胆碱能神经元的变化状态，基底前脑不仅是胆碱能神经元较为集中区，同时也是NOS阳性神经元集中区之一，支持NO可能是促进乙酰胆碱的释放而起协调作用观点 [13] ，至于具体机制尚需进一步研究。
, 百拇医药
本研究提示，神经元受损后，退变在2～3周内完成，以后并不因时间的推移而加重，提示神经元保护措施应及早运用，尽可能减少神经元损失数目和程度。
参考文献
1 HaggT.Delayed treatmentwith nerve growth factor reverses the apparent loss of cholinergic neurons after acute brain damage.Experimental Neuˉrology，1988，101:303-312.
2 Vincent SR，Kimura.Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat brain.Neuroscience，1992，46:755-784.
3 Vincent SR.Nitric oxide，a radical neurotransmitter in tha central nerˉvous system.Prog Neurobiol，1994，42:129-160.
, 百拇医药
4 Schuman EM，Madison DV.Nitric oxide and synaptic function.Ann Rev Neurosci，1994，17:153-183.
5 Chiang LW，Schweizer FE.Nitric oxide synthase expression in single hippocampus neurons.Brain-Res-Mol-Brain-Res，1994，27(1):183-188.
6 Luo P，Vincent SR.NMDA-depent nitric oxide release in hippocampus in vivo:interaction with noradrenaline.Neuropharmacology，1994，33(11):1345-1356.
7 Kitchenen PD，Diamond.Distribution and colocalization of choline acetyltransferase immunoreactivity and NADPH diaphorase reactivity in neurons within the medial septum and diagonal band of broca in the basal forebrain.The Journal of Comparative Neurology，1993，335:1-15.
, 百拇医药
8 He Yun Shao，ZhiBin Yao.Effect of nerve growth factor on the lesioned septohippocampal cholinergic system of aged rats.Brain Res，1991，522:159-163.
9 Went H.Nerve growth factor promotes survive of cholinergic neurons afˉterfimbria transection.J Neurosci，1986，6:2155-2162.
10 Hefti.T，etm al.Nerve growth factor promotes survive of cholinergic neurons after fimbria transection.J Neuroscience，1986，6(8):2155-2162.
, 百拇医药
11 Kromer LF.Nerve growth factor promotes survive of septal cholinergic neurons after fimbrial transection.J Neurosci，1986，6:2155-2162.
12 余福林.AF64对大鼠隔复合体一氧化氮合乙酰胆碱共存神经元的影响.生理学报，1996，48(1):15-22.
13 张松筠，张庆九，郝咏梅.2型糖尿病模型db/db小鼠内侧隔核-斜角带核NOS阳性神经元变化.脑与神经疾病杂志，2001，9(4):204-205.
作者单位: 1 214002江苏省无锡市第二人民医院神经外科
2 226001 南通医学院神经生物学教研室
(收稿日期:2003-09-18)
(编辑 小川), http://www.100md.com(苗增利)
关键词 内侧隔核 斜角带核 免疫组化 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0970-03
, http://www.100md.com
Changes of NADPH-d positive neurons in MS and DB in various survival
period following unilateral hippocampus fimbria transection in the rat
Miao Zengli，Lin Yuchang，Xu Xing，et al.
Department of Neurosurgery，Second Hospital of Wuxi，Jiangsu214002.
【Abstract】 Objective To study the changes of NADPH-d positive neuron in MS and DB in various survival period following unilateral hippocampus fimbria transection in the rat.Methods Using NADPH-d immunohistocheˉmistry method to investigate NADPH-d positive neuron in MS and DB in various survival period(1d，3d，1w，2w，3w，4w，8w，16w，24w)following unilateral hippocampus fimbria transection.Results The loss of NADPH-d positive neuron in the lesioned side of MS and VDB presented3day postlesion，74.5%and85%NADPH-d positive neuron in the lesioned side were left(P>0.05)，and that such changes reached the critical time about2～3weeks，only20%left(P<0.01)，and remained similar until24weeks.Conclusion The changes presented3day post-lesion，reached the critical times in2～3weeks，had nothing to do with neurons in HDB.
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Key words medial septum diagonal band of broca immunohistochemistry rat
隔海马投射是一条有代表性的基底前脑胆碱能神经元投射系统，它的变性或损伤被认为是老年性痴呆病(Alzheimer’s disease，AD)的重要标志，Hagg [1] 等对穹窿海马伞切断不同时期胆碱能神经元的变化曾有报道。一氧化氮(NO)作为一种特殊的活性物质，它的神经递质样作用和神经调质样作用已引起神经科学界的广泛关注。研究表明它在脑内分布十分广泛、具有多种重要的生理功能 [2～4] 。其中对NO参与突触的可塑性，在学习记忆过程中充当长时程增强效应(LTP)的逆行信使的作用研究较多 [5，6] ，最近Kitchenen等 [7] 研究表明内侧隔核(medial septum，MS)、斜角带核(diagnonal band of Broca，DB)中的绝大部分NADPH-d阳性神经元与胆碱乙酰化酶(ChAT)神经元共存。目前对海马伞损伤后MS、DB中NADPH-d阳性神经元损伤情况报道较少。本文将对大鼠海马伞损伤后内侧隔核、斜角带核NADPH-d阳性神经元时程变化及意义进行研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及AD模型制作 成年SD大鼠50只，由 南通医学院动物中心提供。雌雄不限，体重180～220mg，按损伤不同时间(1d、3d、1w、2w、3w、4w、8w、16w、24w)及假手术对照组共分10组，每组5只。
动物经腹腔用复合麻醉剂chlorpeng(0.2ml/100g)麻醉后，固定于江湾Ⅱ型脑立体定位仪(由上海江湾医用仪器厂生产)上，低于耳棒3.3mm。在消毒情况下依次切开皮肤、皮下组织，根据Paxinos鼠脑立体定位图确定坐标:(1)A=-1.4mm;L=1.0mm;V=4.4mm;(2)A=-1.4mm;L=4.0mm;V=4.4mm。在两点之间凿一骨槽，用自制的尖端锐利双面刃的切割刀(刀刃宽3mm
，刀刃厚1mm)切断海马伞，左右拉动三次，保证切断完全，假手术对照组只达皮质浅层(V=2.2mm)，余同手术组。
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1.2 组织学方法 各实验组及对照组动物麻醉后打开胸腔，以100ml冷生理盐水经左心室主动脉灌注冲洗，接着用含4%多聚甲醛的0.1mol/L PB液(pH7.2)灌注固定、取脑。同液中后固定4h后入含25%蔗糖的0.1mol/L PB液4℃过夜。恒冷箱冰冻切片机作冠状切片，切片头端始于胼胝体吻部的起始水平，尾端至海马尾端，片厚40μm。切片收集在PBS中(0.01mol/L pH7.2～7.4)，经PBS洗3次，然后行NADPH-d染色。步骤如下:将切片置于反应液中45min，37℃温育。反应液组成:0.01mol/L PBS(pH7.2～7.4)含0.3%Triton X-100，0.2mg/ml硝基四氮唑蓝(NBT)和1.0mg/mlβ-NADPH(购自Boehringer Mannheim公司)。反应后将切片移入0.01mol/L PBS漂洗数次，铺片、脱水、封片。最后染色切片用日产Olympus光学显微镜观察并计数各组动物正常侧、损伤侧MS、DB中NADPH-d阳性细胞数。
1.3 统计学方法 损伤侧与正常侧NADPH-d阳性神经元计数作t检验。
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2 结果
假手术对照组及损伤1d组的切片，正常侧与损伤侧的NOS神经元未见明显变化，NOS细胞多呈强阳性，胞体大小不等，以大细胞居多，细胞形态为双极或多极。对称地分布于中线两侧的MS、DB中(图1)。损伤3d组，MS、DB损伤侧开始出现细胞数减少，约占各对侧的74.5%和85%(图2)，胞体萎缩，染色深浅不一，突起消失或变短。第2w起MS、VDB中NOS神经元均急骤减少，约为对侧的20%左右，胞体萎缩只剩下深染的斑点或完全消失，亦有个别完好的较 大的NOS神经元，和一些远离中线散在分布的小胞体NOS神经元(图3)。2w以上直至24w组，细胞丧失程度与2w组远离大致相似，各组HDB的NOS神经元变化不明显(图4)，计数从1d组起到24w组，每组每只动物从胼胝体吻部起始水平到前连合交叉前缘的NADPH-d阳性细胞数，凡胞体失去正常形态均不计数。损伤后不同时期MS、VDB的NOS神经元数目变化见表1和图5。
图5 海马伞损伤后MS、VDB中NOS阳性神经元时程变化图 略
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表1 大鼠海马伞损伤后MS、VDB中NOS阳性神经元时辰变化 略
3 讨论
生理学和药理学资料证明隔海马投射为胆碱能投射 [8，9] ，切断穹窿海马伞后可引起内侧隔核，斜角带核胆碱能神经元和海马胆碱能支配显著减少，动物出现类似AD的痴呆症状。Hagg等 [1] 报道损伤穹窿海马伞后1w，损伤侧ChAT阳性神经元下降为对侧的50%左右，而到2w或更长时间仅剩下约为对侧20%，Heft [10] 和Kromer [11] 等研究结果也提示海马伞损伤后基底前脑、海马的胆碱能神经元和纤维的变化可引起实验对象行为的痴呆改变，说明基底前脑胆碱能神经元丧失程度和海马胆碱能变性情况，直接影响着动物的学习、记忆能力。切断海马伞可以复制出成功的AD模型。NADPH-d组化研究发现，海马伞在损伤后3d即出现NOS神经元减少、变性，这种变化从2w起至24w基本相似，表明神经元受损后，退变在2～3周内完成，并不因 时间的推移而加重。但切断海马伞后不同时期各组动物中，神经元丧失程度各动物间有差异，究其原因发现，海马切断完全的动物，神经元减少明显，而海马伞未完全切断动物神经元减少不如完全切断明显。Kitchenen等 [7] 报道的97%左右的NOS阳性神经元为AchE阳性或ChAT阳性神经元;余福林等[12] 报道略低，约90%，因此，基底前脑NOS阳性神经元的减少可以从一个侧面，或者部分说明胆碱能神经元的变化状态，基底前脑不仅是胆碱能神经元较为集中区，同时也是NOS阳性神经元集中区之一，支持NO可能是促进乙酰胆碱的释放而起协调作用观点 [13] ，至于具体机制尚需进一步研究。
, 百拇医药
本研究提示，神经元受损后，退变在2～3周内完成，以后并不因时间的推移而加重，提示神经元保护措施应及早运用，尽可能减少神经元损失数目和程度。
参考文献
1 HaggT.Delayed treatmentwith nerve growth factor reverses the apparent loss of cholinergic neurons after acute brain damage.Experimental Neuˉrology，1988，101:303-312.
2 Vincent SR，Kimura.Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat brain.Neuroscience，1992，46:755-784.
3 Vincent SR.Nitric oxide，a radical neurotransmitter in tha central nerˉvous system.Prog Neurobiol，1994，42:129-160.
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4 Schuman EM，Madison DV.Nitric oxide and synaptic function.Ann Rev Neurosci，1994，17:153-183.
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6 Luo P，Vincent SR.NMDA-depent nitric oxide release in hippocampus in vivo:interaction with noradrenaline.Neuropharmacology，1994，33(11):1345-1356.
7 Kitchenen PD，Diamond.Distribution and colocalization of choline acetyltransferase immunoreactivity and NADPH diaphorase reactivity in neurons within the medial septum and diagonal band of broca in the basal forebrain.The Journal of Comparative Neurology，1993，335:1-15.
, 百拇医药
8 He Yun Shao，ZhiBin Yao.Effect of nerve growth factor on the lesioned septohippocampal cholinergic system of aged rats.Brain Res，1991，522:159-163.
9 Went H.Nerve growth factor promotes survive of cholinergic neurons afˉterfimbria transection.J Neurosci，1986，6:2155-2162.
10 Hefti.T，etm al.Nerve growth factor promotes survive of cholinergic neurons after fimbria transection.J Neuroscience，1986，6(8):2155-2162.
, 百拇医药
11 Kromer LF.Nerve growth factor promotes survive of septal cholinergic neurons after fimbrial transection.J Neurosci，1986，6:2155-2162.
12 余福林.AF64对大鼠隔复合体一氧化氮合乙酰胆碱共存神经元的影响.生理学报，1996，48(1):15-22.
13 张松筠，张庆九，郝咏梅.2型糖尿病模型db/db小鼠内侧隔核-斜角带核NOS阳性神经元变化.脑与神经疾病杂志，2001，9(4):204-205.
作者单位: 1 214002江苏省无锡市第二人民医院神经外科
2 226001 南通医学院神经生物学教研室
(收稿日期:2003-09-18)
(编辑 小川), http://www.100md.com(苗增利)